Methodenartikel

Entwicklung von mausabgeleiteten Organoidlinien aus Epithelzellen des Eileiters für die Modellierung des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms

DOI:

10.3791/68753

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6. August 2025

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1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Mausmodellen (HGSOC) in vitro und in vivo. Von der Gewinnung von murinen Eileiter-Organoiden über ihre genetische Modifikation zur Rekapitulation der menschlichen HGSOC-Genetik bis hin zu ihrer Einführung in den Eierstockschleimbeutel syngener Mäuse für die in vivo-Entwicklung von Tumoren.

Zusammenfassung

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Die effektive Modellierung von Krankheiten in realistischen Umgebungen ist entscheidend, um unser Verständnis verschiedener Pathologien zu verbessern. In dieser Hinsicht bieten Organoide eine originalgetreuere Umgebung als ihre klassischen zweidimensionalen Pendants in vitro. In ähnlicher Weise ermöglichen syngene Mausmodelle es den Forschern auch, vollständigere Tumor-Wirt-Interaktionen, z. B. mit dem Immunsystem, in vivo zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll zur Extraktion von Eileiterepithelzellen, der Ursprungszelle hochgradiger seröser Ovarialkarzinome (HGSOC), aus einer Maus und deren Gewinnung als primäre Organoidkulturen sowie deren In-vitro-Kultur und -Erhaltung. Anschließend beschreiben wir, wie gentechnische Techniken wie die lentivirale oder retrovirale Genüberexpression sowie die CRISPR-Cas9-Gendeletion eingesetzt werden können, um diese Linien zu modifizieren und in präkanzeröse Tumoroide umzuwandeln. Wir berichten auch, wie sie für die In-vitro-Validierung verwendet werden können, durch die Extraktion von genetischem Material und die Immunfluoreszenzfärbung. Schließlich zeigen wir, wie diese Tumoroide zur Tumorinitiation effektiv in den ovariellen Schleimbeutel, die autochthone Stelle des HGSOC, injiziert werden können.

Einleitung

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Das hochgradige seröse Ovarialkarzinom (HGSOC) ist nach wie vor eine wenig verstandene und hochgradig tödliche Erkrankung. In der Vergangenheit war der Mangel an originalgetreuen In-vitro- und In-vivo-Modellen, die die Biologie und das Ansprechen auf die Therapie von HGSOC repräsentieren, ein großes Hindernis für den Fortschritt. Zum Beispiel haben mehrere (wenn nicht die meisten) Studien Zelllinien verwendet, die wichtige genomische/genetische Merkmale von HGSOC nicht teilen, was die Relevanz ihrer Ergebnisse fragwürdig macht 1,2,3,4. Zum Beispiel ist das gängige ID8-Syngen-Mausmodell aus dem Ovarialoberflächenepithel (OSE) abgeleitet und ist Trp53-Wildtyp 5. Im Gegensatz dazu entsteht das meiste, wenn nicht sogar das gesamte HGSOC im Eileiterepithel (FTE)6, und HGSOC ist fast durchweg TP53-mutiert oder zum Schweigen gebracht7. Forscher haben seitdem versucht, diese Linie zu korrigieren, indem sie Trp53-Mutationen in sie integrierthaben 5, aber da die Trp53-Mutation ein frühes Ereignis in der HGSOC-Pathogenese ist, kommt diese Modifikation möglicherweise zu spät in der Transformation dieser Zelllinie und repräsentiert wahrscheinlich nicht die normale HGSOC-Entwicklung.

In den letzten zehn Jahren wurden Versuche unternommen, diesen Zustand durch die Erstellung realistischerer Modelle des HGSOC zu korrigieren. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs), die relevante Mutationen auf Zellen der Müller-Trakt-Linie aufweisen, oft unter einem Cre-Rekombinase-System zur Kontrolle der Pathogenese, ermöglichen es den Forschern beispielsweise, die Krankheit in vivo besser nachzuahmen 8,9,10. Leider sind diese Modelle oft kompliziert zu generieren und können andere Probleme wie Cre-Leaking, Cre-Effekt oder "Feldeffekte" haben11,12,13. In dieser Hinsicht scheinen syngene Organoidmodelle ein robuster Kompromiss für Forscher zu sein, die die Krankheit sowohl in vitro als auch in vivo besser nachahmen möchten 14,15,16,17,18,19. Obwohl die meisten derzeit verfügbaren und verwendeten HGSOC-Modelle zweidimensionale Modelle sind, können sie leider die Komplexität der extrazellulären Matrix (ECM), einem entscheidenden Element, das die Zellbiologie beeinflusst, nicht richtig simulieren. Organoide sind selbstorganisierte 3D-Gewebe, die oft aus Stammzellen erzeugt werden und die frühe strukturelle und funktionelle Komplexität eines Organs in der Petrischale nachbilden können20. Ihre Erzeugung funktioniert in der Regel durch Suspendieren einzelner Zellen, die pluripotent sind, in einer Basalmembranmatrix (BMM), wie z. B. Matrigel21. In vitro sind diese Modelle bei der Rekapitulation von In-vivo-Bedingungen vergleichsweise genauer als 2D-Modelle. Ebenso können diese Modelle aufgrund ihrer syngenen Natur in eine Maus mit einem voll funktionsfähigen Immunsystem transplantiert werden, was eine genauere Rekonstruktion der Pathogenese und Entwicklung ermöglicht14,15. Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber patienteneigenen Xenotransplantaten, die zwar die realistischste Tumorgenetik aufweisen, aber in immungeschwächten Mausmodellen transplantiert werden müssen.

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie syngene HGSOC-Organoidmodelle entwickelt werden können. Von der Erzeugung der ursprünglichen Wildtyp-FTE-Organoidkultur, die aus einer Maus extrahiert wurde, über ihre Gentechnik zur Erzeugung krankheitsinformierter Genotypen bis hin zu ihrer Transplantation zurück in den Schleimbeutel der Eierstöcke, um voll entwickelte Tumore zu erzeugen. Wir haben auch einige zusätzliche Protokolle hinzugefügt, um bei gängigen Experimenten zu helfen, wie z. B. der Immunfluoreszenz (IF)-Färbung von In-vitro-Organoiden und der 2D-Umwandlung von Zelllinien für die großtechnische Produktion von Zellen, z. B. für Injektionen. Dieses Protokoll richtet sich an Forscher, die organoide syngene Modelle von HGSOC mit Kontrolle über ihr Erbgut entwickeln wollen, mit der besonderen Absicht, die Biologie des HGSOC unter realistischeren In-vitro-Bedingungen sowie die in der Tumormikroumgebung vorhandenen Wechselwirkungen in vivo zu untersuchen.

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Protokoll

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Alle tierischen Gewebeentnahmen und -verfahren wurden unter ethischer Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Alexandria Center for Life Sciences und des Perlmutter Cancer Center an der NYU Langone Health, New York, New York, durchgeführt.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Vorbereitung der murinen Organoidmedien (MOM)
    1. Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie die Elemente in Tabelle 1 kombinieren.
      HINWEIS: Das Medium ist bis zu einem Monat bei 4 °C stabil.
  2. Vorbereitung von 2D-Medien
    1. Kombinieren Sie rekombinantes murines EGF 50 ng/ml, Insulin-Transferrin-Selen (Endkonzentrationen 10 mg/l Insulin, 5,5 mg/l Transferin, 6,7 μg/l), 3 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (100 U/ml) in DMEM (mit Pyruvat und hohem Glukosespiegel).
  3. Zubereitung der Aufschlussmischung
    1. Kombinieren Sie Kollagenase / Hyaluronidase (3000 U/ml Kollagenase, 1000 U/ml Hyaluronidase) mit DMEM (mit Pyruvat und hoher Glukose) in einem Verhältnis von 1:10. Bereiten Sie 1-ml-Aliquots in 1,5-ml-Mikroröhrchen vor. Die Aliquots bei -20 °C lagern und auf Eis auftauen.
    2. Bereiten Sie Einweg-Aliquots von DNAse I (10.000 U/ml) und Dispase (5 U/ml) vor.
    3. Sobald ein Aliquot von Kollagenase/Hyaluronidase in DMEM aufgetaut ist, fügen Sie DNAseI (10 μl, 100 Einheiten) und Dispase (25 μl, 0,1 Einheiten) hinzu.
      HINWEIS: Diese Verdauungslösung ist auch nützlich für die Verdauung von bis zu 0,5 g Tumor.
  4. BMM-Handhabung
    1. BMM bei -80 °C langfristig lagern. Um ein Frostauftauen von BMM zu vermeiden, bereiten Sie 1 ml-Aliquots in 1,5-ml-Röhrchen vor. Tauen Sie ein Aliquot auf, indem Sie es 2 Stunden lang oder über Nacht bei 4 °C auf Eis legen.
      HINWEIS: BMM verfestigt sich bei Raumtemperatur (RT). Daher wird empfohlen, die Tube von BMM immer auf Eis oder auf einem kalten Tube-Gestell aufzubewahren. Verwenden Sie Pipettenspitzen, die mindestens 2 h im -20 °C tiefgekühlten Gefrierschrank vorgekühlt wurden.

2. Isolierung von Zellen aus Maus-FTE

  1. Tauen Sie ein Aliquot von BMM, ein vorwarmes TrypLE Express Enzym und eine 24-Well-Platte bei 37 °C auf (lagern Sie die Platte 24 Stunden lang im Inkubator, um beste Ergebnisse zu erzielen). Bereiten Sie dann den Operationsbereich vor: Werkzeuge zum Sezieren und Reinigen des Gewebes am Präpariermikroskop, Platte mit kaltem PBS + P/S und warmer Aufschlussmischung.
  2. Euthanasieren Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse durch Kohlendioxid-Erstickung. Durchführung einer sekundären Euthanasiemethode (Zervixluxation), wie von der IACUC gefordert.
  3. Präparieren und entfernen Sie den Eierstock und den Eileiter und geben Sie sie in eine sterile Petrischale, die DMEM + P-S bei 4 °C enthält. Mit einem Präpariermikroskop wird mit einer feinen Pinzette und einer Schere die Restmenge an Fett aus dem Eierstock entfernt und der Eileiter (Infundibulum und ein Teil der distalen Ampulle) aus dem Eierstock und der Gebärmutter isoliert.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie die Haut oder Haare der Maus nicht mit den Werkzeugen berühren, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
  4. Übertragen Sie das Gewebe in das Röhrchen mit der vollständigen Verdauungsmischung und hacken Sie den Eileiter mit einer feinen Schere in kleine Stücke (<0,5 mm). 40-50 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Nach der Dissoziation zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 5 min und verwerfen den Überstand. 500 μl vorgewärmtes TrypLE Express zugeben. 15 min bei 37 °C inkubieren.
  6. Quench-Trypsinisierung mit 500 μl 3% FBS in DMEM (2D-Medien). Die Mischung durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues Mikroröhrchen abseihen. 5 min bei 350 g drehen und den Überstand wegwerfen.
  7. Resuspendieren Sie das Zellpellet (je nach Anzahl der verwendeten FTs kaum sichtbar) in 12,5 μl organoidem Mausmedium und inkubieren Sie es kurz auf Eis. Mit 37,5 μl eiskaltem BMM mischen und das gesamte Volumen (50 μl) in den Boden einer Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte aussäen.
  8. Stellen Sie die Platte mindestens 20 min, jedoch nicht länger als 48 h auf 37 °C, um das BMM einzustellen. Achten Sie darauf, die Kuppeln nicht zu stören, wenn Sie die Platte in den Inkubator umfüllen.
  9. Geben Sie 500 μl vorgewärmtes MOM in jede Vertiefung, indem Sie das Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung hinunter pipettieren. Legen Sie niemals Medien direkt in die Kuppel ein, da dies zu Beschädigungen oder Ablösungen führen kann. Den Deckel auf die Kulturplatte legen und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.

3. Pflege von murinen FTE-abgeleiteten Organoiden

  1. Wechselnde Medien
    1. Saugen Sie das Medium mit einer ungefilterten, sterilen 10-μl-Spitze vom Boden der Vertiefung an, während die Platte in einer Neigung von 45° gehalten wird. Wenn sich die Kuppel von der Platte löst, saugen Sie das Medium vorsichtig von der Oberseite der Vertiefung an, während sich die abgelöste Kuppel unten befindet.
    2. Langsam 750 μl MOM hinzufügen, auf 37 °C vorgewärmt, wobei die Spitze gegen die Seitenwand der Vertiefung gedrückt wird.
    3. Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage oder bis das Medium seine Farbe von rosa zu gelb ändert. Wenn das Medium weniger als 24 Stunden nach dem Wechsel gelb wird, sind die Organoide bereit für den Durchgang.
  2. Vorübergehende Organoide
    1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie jede Vertiefung mit 500 μl kaltem PBS (4 °C). Aspirieren Sie PBS und geben Sie 500 μl kalte (4 °C) Zellrückgewinnungslösung direkt in die BMM-Kuppel, um sie aufzulösen. Fahren Sie mit dem Pipettieren fort, bis sich das BMM vollständig aufgelöst hat, und geben Sie es in ein 1,5-ml-Röhrchen.
    2. Legen Sie das Röhrchen für 30 Minuten auf Eis und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, damit sie warm bleibt. Wenn Sie eine neue Platte verwenden, stellen Sie sicher, dass diese 24 h lang bei 37 °C vorgewärmt wird.
      HINWEIS: Wenn Sie mehr als 2x 50 μl Kuppeln passieren, wie z. B. während der unten beschriebenen Expansionen, muss die Inkubation auf Eis möglicherweise länger als 30 Minuten verlängert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
    3. Bei 350 g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu aspirieren, und mit 500 μl kaltem PBS waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
      HINWEIS: Wenn keine Kaltzentrifuge verfügbar ist, lassen Sie das Röhrchen zwischen den Wäschen abkühlen, indem Sie es auf Eis oder ein kaltes Gestell legen.
    4. Nach dem letzten Waschen 5 Minuten lang bei 350 g zentrifugieren, den Überstand entfernen und 500 μl vorgewärmtes (37 °C) TrypLE Express Enzym hinzufügen. Um zu vermeiden, dass Zellen beim Pipettieren verloren gehen, ziehen Sie das Röhrchen gegen das Entlüftungsgitter in der Gewebekulturhaube, um die Zellen zu homogenisieren.
    5. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 30 bis 60 Minuten.
      HINWEIS: Die Zeit kann je nach Organoid-Genotyp und Passagezeit angepasst werden, da einige eine längere Trypsinisierung erfordern können, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
    6. Stoppen Sie den Zelldissoziationsprozess, indem Sie 500 μl DMEM + 3 % HI FBS hinzufügen und durch Auf- und Abpipettieren mischen, bis die Lösung homogenisiert ist.
    7. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 350 × g und saugen Sie den Überstand an, bis ~20 μl Volumen übrig sind. Entfernen Sie den restlichen Überstand manuell mit einer P20-Pipette und nicht mit einem Vakuumsauger, da es üblich ist, das Pellet in diesem Schritt zu aspirieren.
    8. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem (4 °C) MOM und messen Sie die Zellkonzentration. Bereiten Sie die Zellverdünnungen nach Belieben vor und bewahren Sie sie auf Eis auf. Anschließend mit eiskaltem BMM mit Pipettenspitzen mischen, die zuvor bei -20 °C gelagert wurden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, zwei 50-μl-Dome mit 2 × 105 Zellen/ml herzustellen, wobei das Verhältnis von MOM zu BMM 1:4 beträgt. Daher sollten Sie haben; 25 μl Zellen in MOM bei 8 × 105 Zellen/ml und 75 μl BMM für insgesamt 100 μl, aufgeteilt in 2 Dome. Auf diese Weise sät man effektiv 1 × 104 Zellen pro Kuppel aus.
    9. Jede 50-μl-Kuppel in der Mitte der Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte aussäen. Stellen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator, damit sich das BMM verfestigen kann. Geben Sie 500 μl MOM bei 37 °C wie zuvor in Schritt 3.1.2 gezeigt hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
  3. Erweiterung
    1. Um die Organoid-Zellkultur auf eine (vorgewärmte) 6-Well-Platte zu erweitern, bereiten Sie fünf 50-μl-Domen mit 8 × 105 Zellen/ml vor. Resuspendieren Sie die Zellen in insgesamt 62,5 μl MOM und mischen Sie sie mit 187,5 μl eiskaltem BMM und säen Sie die 5 Domes in derselben Vertiefung aus.
    2. Schieben Sie die Platte für 30 Minuten in den Inkubator, damit sich das BMM verfestigen kann. Fügen Sie 2 ml MOM bei 37 °C hinzu, wie zuvor in Schritt 3.1.2 gezeigt, und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium nach Bedarf, bis die Zellen zusammenfließen.
      HINWEIS: Um Zellen für die Passage zu sammeln, verwenden Sie 1 ml Zellwiederherstellungslösung anstelle von 500 μl und inkubieren Sie 45 Minuten statt 30 Minuten auf Eis.
  4. Kryokonservierung
    1. Für die Langzeitlagerung von Organoiden die Passage wie in den Schritten 3.2.1 bis 3.2.7 beschrieben. Anschließend in 250 μl organoidem Gefriermedium (80 % MOM, 10 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)) resuspendieren und in ein Kryoröhrchen überführen. Frieren Sie 1 × 105 Zellen pro Kryofläschchen ein.
    2. Lagern Sie das Röhrchen in einem kryogenen Gefrierbehälter für Fläschchen (z. B. Mr. Frosty) und lassen Sie es in einem -80 °C-Gefrierschrank abkühlen. Für die Langzeitlagerung bewahren Sie die Zellen in einem Flüssigstickstofflager oder in einem -150 °C Gefrierschrank auf.

4. Genetische Modifikation von murinen FTE-abgeleiteten Organoiden zur Entwicklung neuartiger Zelllinien

  1. Transduktion durch Spinokulation (lentiviral oder retroviral)
    1. Bereiten Sie eine Mischung aus 25 μl MOM und 75 μl BMM vor und geben Sie sie in eine Vertiefung einer kalten (4 °C, ermöglicht es BMM, die Vertiefung vollständig zu "benetzen") 48-Well-Platte. Inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten bei 37 °C, damit sich BMM vor der Aussaat der Zellen verfestigen kann.
    2. Man erhält einzelne Zellen, die von Organoiden abgeleitet sind (Schritt 3.2.5) und sät etwa 2 × 104 auf das BMM. 200 μl warmes (37 °C) MOM zugeben und bei 37 °C und 5 % CO2 48 h inkubieren.
    3. Fügen Sie das Virus in der gewünschten Konzentration hinzu. Bestimmen Sie das Trägheitsmoment experimentell; Es wird ein ungefähres Trägheitsmoment von unter 30 % empfohlen.
      HINWEIS: Organoide sind im Vergleich zu 2D-Zelllinien besonders schwer zu infizieren und erwarten selbst bei hohen Virustitern niedrige MOIs. Zellen bei 600 × g für 60 min bei 32 °C zentrifugieren. Stellen Sie die Platte nach Beendigung der Spinokulation wieder in den Inkubator.
    4. Entfernen Sie nach 8 Stunden das Medium und fügen Sie eine Mischung aus 25 μl MOM und 75 μl BMM auf die Zellen hinzu, um sie in BMM zu "sandwichen", so dass Organoide auf natürliche Weise in 3 Dimensionen wachsen können. Lassen Sie das BMM erstarren, indem Sie die Platte für 30-60 Minuten in den Inkubator stellen. Fügen Sie dann 250 μl warmes (37 °C) MOM hinzu.
    5. Sobald die Zellen konfluent sind, fahren Sie mit dem Durchgang fort, wie in Schritt 3.2 beschrieben, und erweitern Sie das gesamte Zellvolumen in 2 Domes in einer 24-Well-Platte.
      HINWEIS: Wenn Sie eine Antibiotikaauswahl verwenden, wird empfohlen, die Auswahl direkt in der 48-Vertiefung durchzuführen, beginnend 48 Stunden nach der ersten Spinokulation. Bei der Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) wird empfohlen, eine 6-Well-Platte wie oben beschrieben weiter zu erweitern, um genügend Zellen zu erhalten. Längere Trypsinisierungszeiten (1 h) werden ebenfalls empfohlen, um sicherzustellen, dass die einzelnen Zellen vor dem Filtrieren der Proben für den Durchfluss gefiltert werden.
  2. Transformation durch Elektroporations-basiertes CRISPR-Cas9
    HINWEIS: Informationen zu den Konzentrationen und der Zubereitung des Ribonukleoproteins (RNP)-Komplexes finden Sie im IDT Homology-Directed Repair Guide (S. 9-11)22. Lassen Sie den HDR Enhancer V2 für Knockouts jedoch weg, da er nur für Genome Editing empfohlen wird, die eine homologe Rekombination erfordern.
    1. Bereiten Sie eine einzellige Suspension aus Organoiden vor (Schritt 3.2.7). Mit PBS waschen und die Zellkonzentration messen. Eine Zellsuspension, die eine Menge innerhalb der Größenordnung 104 (1 × 104 bis 9 × 104 Zellen) enthält, wird in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt.
    2. Bei 350 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 10 μl Genom-Editing-Puffer. Wenn >1 × 104 Zellen für die Elektroporation benötigt werden, ist ein ausreichendes Volumen für die serielle Elektroporation vorzubereiten und sicherzustellen, dass jede 10 μl 1 × 104 bis 9 × 104 Zellen enthält.
    3. Sammeln Sie mit einem Elektroporationspipettensystem 10 μl der Zellsuspension und stellen Sie sicher, dass keine Blasen gebildet werden. Elektroporate unter folgenden Bedingungen: 1200 V Spannung, 20 ms Impulsdauer, insgesamt 4 Impulse. Legen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit kaltem MOM.
    4. Nach der Elektroporation der Zellen wird die gesamte Suspension 5 Minuten lang bei 350 × g zentrifugiert. Suspendieren Sie das Pellet in eiskaltem MOM und BMM (Verhältnis 1:4) und bereiten Sie so viel vor, dass eine Kuppel pro Runde Elektroporation (1 Kuppel pro 1 104 Zellen) ausgesät werden kann.
    5. Stellen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator, damit sich das BMM verfestigen kann. Geben Sie 500 μl MOM bei 37 °C wie zuvor in Schritt 3.1.2 gezeigt hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
  3. Einzelne Klone auswählen
    1. Um einen Klon zu erhalten, der aus einer einzelnen Zelle stammt, Passagezellen wie oben beschrieben, aber säen Sie 50 bis 100 Zellen pro Dome aus (4 × 103 bis 8 × 103 Zellen/ml in Zellsuspension vor dem Mischen mit BMM).
    2. Wechseln Sie die Mutter alle 3 Tage. Überprüfen Sie, ob Organoide angemessen wachsen, und notieren Sie, welche gut von den anderen getrennt sind.
    3. Wenn Organoide zu einer erkennbaren Größe (ca. 500 μm) heranwachsen, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um 4-5 große Organoide zu identifizieren, die ausreichend voneinander entfernt sind.
      HINWEIS: Sie sollten mit bloßem Auge sichtbar sein, aber es ist hilfreich, den Boden der Platte mit einem feinen Marker zu markieren, indem Sie einen Kreis um den Bereich der Platte zeichnen, in dem sich das Organoid befindet.
    4. Führen Sie die Spitze mit einer 20-μl-Pipette in der sterilen Haube vorsichtig in das BMM ein und aspirieren Sie das einzelne Organoid (aspirieren Sie ein Volumen von ca. 12,5 μl). Legen Sie das Organoid in ein 1,5-ml-Entnahmeröhrchen mit 500 μl MOM.
    5. Bei 350 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 500 μl TrypLE Express Enzym. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
    6. Die Zelldissoziationsreaktion mit 500 μl 3 % FBS in DMEM (2D-Medien) abschrecken und bei 350 × g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie sehr vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie ihn in 12,5 μl kaltem MOM, mischen Sie ihn mit 37,5 μl eiskaltem BMM und säen Sie die gesamte Suspension als eine einzelne 50-μl-Kuppel in einer 24-Well-Platte aus, wie oben beschrieben.
    7. Stellen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator, damit sich das BMM verfestigen kann. Geben Sie 500 μl MOM bei 37 °C wie zuvor in Schritt 3.1.2 gezeigt hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
    8. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage und durch, wenn die Kuppel zusammenfließt.

5. Ableitung von 2D-Zelllinien aus Organoiden

  1. Übergangs-Zellkultur
    1. Beginnen Sie mit einer einzelligen Suspension, wie nach dem Passieren von Organoiden.
    2. Gehen Sie wie bei der Aussaat einer 6-Well-Platte vor (Schritt 3.3), verwenden Sie jedoch eine vorgekühlte (4 °C für 24 h). Säen Sie die Kuppeln auf einer 6-Well-Platte, die über Nacht bei 4 °C gelagert wird, und lassen Sie die Platte 5-10 Minuten in der sterilen Haube ruhen, bevor Sie sie in den Inkubator einsetzen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es den Zellen, sich sanft am Boden der Platte abzusetzen, um eine 2D-Wachstumsbedingung aufzunehmen, während sie weiterhin Zugang zu den ECM-Komponenten von BMM haben.
    3. Die Platte wird 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, dann werden 2 ml MOM bei 37 °C zugegeben. Wechseln Sie das Medium nach Bedarf.
    4. Wenn Organoide die Konfluenz erreichen, erfolgt die Passage wie in den Schritten 3.2.1 bis 3.2.7 beschrieben. Nach dem abschließenden PBS-Waschen der Vertiefung, um übrig gebliebenes BMM zu entfernen, fügen Sie 2 ml vorgewärmtes 2D-Medium in die Vertiefung hinzu.
      HINWEIS: Durch die BMM-Entfernung werden keine Zellen entfernt, die an der Vertiefung befestigt sind, und diese können nun ungehindert in den Rest der Vertiefung eindringen, während sie sich an 2D-Bedingungen/Medien anpassen.
    5. Sobald eine Einzelzellsuspension mit den im BMM verbliebenen Zellen erreicht wurde, wird die Hälfte des Zellvolumens ausgesät und Schritt 5.1.2 wiederholt. Fügen Sie die andere Hälfte der ursprünglichen Vertiefung hinzu, damit mehr Zellen aussäen können, was die Konfluenz beschleunigt.
    6. Wechseln Sie das 2D-Medium nach 24 Stunden, um nicht gebundene Zellen zu entfernen.
      HINWEIS: Es sollten viele nicht gebundene Zellen vorhanden sein, da Zellen, die in BMM gezüchtet wurden, nicht an Kunststoffsubstrate gewöhnt sind und sich nicht ohne weiteres anheften.
    7. Wiederholen Sie Schritt 5.1.4. Resuspendieren Sie dann das gesamte Zellvolumen in 4 ml 2D-Medien und säen Sie 2 ml in jede der zuvor verwendeten Vertiefungen. Wechseln Sie das 2D-Medium alle 3-4 Tage.
  2. 2D-Zellkultur zur Expansion
    1. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, fahren Sie mit der ersten Passage fort.
    2. Zum Durchgang das Medium aspirieren, einmal mit 1 ml PBS waschen und 1 ml 0,25 % Trypsin hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 5 bis 10 Minuten.
      HINWEIS: Unterschiedliche Zelllinien können unterschiedliche adhärente Eigenschaften haben, wodurch die Dauer der Trypsinisierung variiert. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Ein sanftes Klopfen der Zellkulturplatte mit der Hand kann helfen, Zellen zu lösen.
    3. Sobald sich alle Zellen abgelöst haben, die Dissoziation mit DMEM + 10% FBS löschen und 5 min bei 350 × g zentrifugieren.
    4. Für die erste Expansion (wenn 80-100 % zusammenfließend) säen Sie im Verhältnis 1:1 nach. Wiederholen Sie Schritt 5.1.6 und wechseln Sie das 2D-Medium alle 2-3 Tage.
    5. Bei der zweiten Expansion (80-100 % Konfluenz) säen Sie alle Zellen in eine 100-mm-Schale, indem Sie die Zellen in 10 ml 2D-Medium bei 37 °C resuspendieren. Wiederholen Sie Schritt 5.1.6 und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
      HINWEIS: Dieser Vorgang ist zeitaufwändig und kann bis zu einem ganzen Monat dauern. Bei der Arbeit mit Zelllinien, die viral integrierte Gene für die Überexpression von Proteinen aufweisen, wird empfohlen, Selektionsantibiotika durchgehend im Wachstumsmedium zu belassen. Wenn es sich bei dem Marker um ein fluoreszierendes Protein handelt, führen Sie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung so bald wie möglich durch (d. h. am Ende der 100-mm-Schalenerweiterung).
  3. Kryokonservierung
    1. Für die Lagerung dieser Zellen ist der Durchgang wie in den Schritten 5.2.1 bis 5.2.3 beschrieben durchzuführen. Dann resuspendieren Sie ~1 × 106 Zellen in 1 ml 2D-Gefriermedium, das aus 80 % 2D-Medien, 10 % FBS und 10 % DMSO besteht, und übertragen Sie es in ein Kryoröhrchen. Speichern Sie die Zellen gemäß Schritt 3.5.2.

6. Validierung von Organoidlinien

  1. Isolierung von genetischem Material aus Organoiden
    1. Ausgehend von einer Einzelzellsuspension werden zwei Dome mit der doppelten Zelldichte (1 × 106 Zellen/ml) ausgesiedelt. Wechseln Sie die Mutter an Tag 3.
    2. Entfernen Sie am 5. Tag das Medium, waschen Sie es einmal mit PBS und geben Sie 350 μl bevorzugten Lysepuffer direkt auf die Kuppeln. Nach 5 Minuten Inkubation bei RT oder bis das BMM aufgelöst ist, überträgt man das Lysat in ein 1,5-ml-Röhrchen.
    3. Für eine langfristige Anwendung lagern Sie das Lysat bei -80 °C. Andernfalls fahren Sie mit dem Protokoll für die DNA- und/oder RNA-Extraktion unter Verwendung der bevorzugten Extraktionstechnik oder eines kommerziellen Kits fort.
  2. Immunfluoreszenz-Färbung (IF)
    1. Zur Vorbereitung der Zellen die Passage wie in den Schritten 3.2.1 bis 3.2.5 beschrieben durchführen. Resuspendieren Sie in einer Mischung aus 37,5 μl MOM und 112,5 μl eiskaltem BMM (ausreichend für drei 50-μl-Dome, die als biologische Replikate fungieren). Befolgen Sie Schritt 3.2.6 und wechseln Sie das Medium an Tag 3 und Tag 5.
    2. An Tag 7 aspirieren Sie MOM und waschen die Zellen mit 500 μl PBS. Befestigen Sie jede Kuppel separat, indem Sie 500 μl vorgewärmte (37 °C) 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS direkt auf die Kuppel geben. Bei 37 °C 60 min inkubieren, bis sich das BMM aufgelöst hat.
    3. Sammeln Sie die Organoide mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung (falls nicht verfügbar, schneiden Sie einfach eine normale P1000-Spitze etwa 0,5 cm vom feinen Ende entfernt) in 4 % PFA und übertragen Sie das Volumen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Verwendung einer Standard-Pipettenspitze führt dazu, dass Organoide brechen.
    4. Warten Sie 2 bis 3 Minuten, bis die Organoide auf den Boden des Röhrchens gesunken sind. Aspirieren Sie 4 % PFA (wobei Sie eine sichere Volumenmenge lassen, um Organoide nicht zu aspirieren) und fügen Sie 500 μl PBS hinzu, um die Organoide zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male, für insgesamt 3 Wäschen.
      HINWEIS: Das Warten auf das Absinken der Organoide auf den Boden ist der Zentrifugation vorzuziehen, um die Organoidform zu erhalten.
    5. Für die Langzeitlagerung (4-6 Wochen) halten Sie Organoide in PBS bei 4 °C. Um mit der Färbung fortzufahren, permeabilisieren Sie mit PBS + 1% Triton-X für 30 min bei RT. Einmal mit PBS waschen.
    6. Mit PBS + 0,2 % Triton-X + 4 % FBS + 1 % Mausserum für 60 min bei RT blockieren. Einmal mit PBS waschen und 100 μl Volumen in der Tube belassen.
    7. Bereiten Sie den Arbeitspuffer für die Antikörperfärbung vor: PBS + 0,2 % Triton-X, 0,4 % FBS, 0,1 % Rattenserum. Dieser Puffer funktioniert sowohl für primäre als auch für sekundäre Antikörper.
    8. Um die Primärantikörperfärbung vorzubereiten, berechnen Sie, dass die Verdünnung doppelt so konzentriert ist wie die tatsächlich erforderliche Verdünnung. Bereiten Sie genügend Lösung vor, um 100 μl Antikörper zu den 100 μl PBS hinzuzufügen, die in jedem Röhrchen verbleiben. Bereiten Sie beispielsweise für eine ursprüngliche Verdünnung von 1:1000 100 μl 1:500 Lösung vor.
    9. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Anschließend dreimal mit 500 μL PBS waschen.
    10. Bereiten Sie die Sekundärantikörperfärbung vor, wie in Schritt 6.2.8 beschrieben. 1 h bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Achten Sie ab diesem Schritt darauf, den Arbeitsbereich mit Aluminiumfolie/bevorzugter dunkler Box abzudecken, um ein Photobleichen der fluoreszierenden Antikörper zu vermeiden.
    11. Nachdem die Sekundärfärbung beendet ist, waschen Sie es dreimal mit 500 μl PBS. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Röhrchen, um die Probe für die Montage vorzubereiten. Verwenden Sie eine 20-μl-Pipette, um ein Ansaugen der Organoide zu vermeiden.
    12. Mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung oder geschnittener Pipettenspitze 20 μl Einbettmedium Ihrer Wahl hinzufügen und die Lösung gut homogenisieren, dabei Blasen vermeiden.
    13. Geben Sie einen Tropfen Organoide in Eindecklösung auf einen rechteckigen Deckglas. Legen Sie mit einer Pinzette ein kreisförmiges Deckglas auf den Tropfen, vermeiden Sie dabei Blasen und lassen Sie es über Nacht im Dunkeln bei RT trocknen. Wiederholen Sie diesen Schritt auf demselben Objektträger, wenn mehr als eine Probe pro Objektträger platziert werden soll.
    14. Geben Sie weitere 20 μl Eindeckmedium direkt auf den kreisförmigen Deckglas. Erstellen Sie nun ein Montage-"Sandwich", indem Sie das rechteckige Deckglas um 180° drehen und auf den Objektträger legen. Mindestens 8 h im Dunkeln bei RT trocknen lassen.
      HINWEIS: Der Objektträger sollte in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben sein: Objektträger, kreisförmiger Deckglas, Organoide, rechteckiger Objektträger. So entstehen optimale Abbildungsbedingungen.

7. Entwicklung von Tumormodellen bei Mäusen

  1. Zellen vorbereiten
    1. Tauen Sie ein Fläschchen mit 2D-Zellen Ihrer Wahl in 2D-Medien auf. Lassen Sie diese Zellen wachsen und sich zu einer 150-mm-Platte ausdehnen. Wenn die Zellen Antibiotika-Selektionsmarker aufweisen, wählen Sie vor der Injektion Zellen aus, um eine reine Population der gewünschten Zellen zu gewährleisten.
    2. Für 5 Mausinjektionen erweitern Sie die Zellen auf zwei 150-mm-Platten. Wenn die Platten zu 80 % konfluent sind, ernten Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 5.2.2-5.2.3 befolgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Opti-MEM I Reduced Serum Medium und messen Sie die Zellkonzentration.
      HINWEIS: Jede Injektion enthält 4 × 106 Zellen; Es wird jedoch empfohlen, sich auf eine zusätzliche Injektion vorzubereiten, um das Totvolumen der Spritzen zu berücksichtigen. Bereiten Sie in diesem Fall 24 × 106 Zellen anstelle von 20 × 106 Zellen vor.
    3. Geben Sie das gesamte Zellvolumen für alle Injektionen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Bereiten Sie insgesamt 44 μl pro Injektion vor, bestehend aus 1 Teil Zellen in nicht supplementiertem Opti-MEM I und 1 Teil eiskaltem BMM. Zum Beispiel für 24 × 106 Zellen (6 Injektionen) resuspendieren Sie in 132 μl Opti-MEM I und 132 μl BMM.
    4. Mischen Sie die Zellen gründlich und lassen Sie sie bis zur Durchführung der Injektion auf Eis.
  2. Vorbereitung auf den Eingriff
    1. Stoßen Sie Luftblasen aus dem Totvolumen der Spritze (U-100 Insulin 28 G) mit kaltem PBS aus.
    2. Bereiten Sie unter Verwendung der Zellen im 1,5-ml-Röhrchen fünf 40-μl-Injektionen vor, indem Sie die Spritze langsam laden, um zu vermeiden, dass die Zellen aufgrund von Scherkräften in der Nadel lysieren. Auf Eis halten, bis die Mäuse sediert sind.
    3. Sobald alles für die Injektion vorbereitet ist, legen Sie die Spritzen neben die Heizlampe, damit sich das BMM erwärmen und viskos werden kann, was die Injektion und Transplantation erleichtert. Legen Sie sie nicht direkt unter die Heizlampe, da überfestiges BMM nicht richtig durch die Spritze gelangt. Arbeiten Sie im Allgemeinen schnell, um dies zu vermeiden.
  3. Intrabursale Injektion (IBI) in den Eierstock
    1. Betäuben Sie eine C57BL/6J-Maus mit Ketamin (100 mg/ml). Verabreichen Sie 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion.
      HINWEIS: Junge weibliche Mäuse benötigen oft nur 0,2 ml-Injektionen, benötigen jedoch möglicherweise mehr, wenn sie älter sind. Dies bietet eine Anästhesie für eine Dauer von 20-40 Minuten, aber keine Analgesie.
    2. Stellen Sie die Maus in einen Käfig, der von der Heizlampe erwärmt wurde.
      HINWEIS: Platzieren Sie Mäuse nicht direkt unter die Heizlampe, da dies zu Schwanznekrose und Hyperthermie führen kann, die tödlich sein können.
    3. Sobald die erste Maus vollständig anästhesiert ist, schneiden Sie mit aseptischer Technik einen <1 cm langen Schnitt entlang der Flanke einer C57BL/6J-Maus im Bauchbereich und über dem Oberschenkel. Achten Sie darauf, die Epidermis und die Hypodermis zu durchlaufen, bevor Sie die Schleimbeutelregion erreichen.
    4. Ziehen Sie den Eierstock vorsichtig heraus (leicht zu finden durch das daran befestigte Fettpolster). Nehmen Sie eine der vorbereiteten Spritzen und injizieren Sie die Zellen langsam durch das Fettpolster direkt hinter dem Eierstock, durch den Eierstock selbst, in den Eileitersack.
      HINWEIS: Bei erfolgreicher Injektion bläht sich der Eileitersack mit BMM auf. Die Mischung wird wahrscheinlich auch über das gesamte Fettpolster auslaufen, was normal ist.
    5. Setzen Sie den Eierstock vorsichtig wieder in den Schleimbeutel ein und verschließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Klammern oder durch Nähen.
    6. Setze die Maus wieder in den Käfig ein. Verwenden Sie eine Heizlampe, um die Mäuse warm zu halten, während sie sich nach der Operation erholen, bis sie halb bewusstlos sind (>15 Minuten). Überprüfen Sie am nächsten Tag die Maus, um sicherzustellen, dass über Nacht keine Sepsis aufgetreten ist.

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Ergebnisse

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Eine schematische Zusammenfassung des Arbeitsablaufs zur Generierung und Validierung von HGSOC-Eierstockkrebs ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieser Prozess beginnt mit der Extraktion von Eileitergewebe aus einer weiblichen C57BL/6J-Wildtyp-Maus (Abbildung 2A). Es wird empfohlen, mit einem großzügigen Stück Taschentuch zu beginnen, um eine ordnungsgemäße Entnahme zu gewährleisten. Die Verwendung eines Präpariermikroskops ermögli...

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Diskussion

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Trotz erheblicher Fortschritte in der onkologischen Forschung bleibt HGSOC die aggressivste Form gynäkologischer Malignome und die häufigste Todesursache bei allen Eierstockkrebsarten23,24. Mit der Weiterentwicklung der gynäkologischen Onkologieforschung sollten sich auch die darin verwendeten Modelle weiterentwickeln. In der Tat haben sich viele historische Modellzelllinien für Eierstockkrebs aus mehreren Gründen als suboptimal ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von den National Institutes of Health unter der Fördernummer R01(CA257507) unterstützt. Die Schaltpläne für die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Wir danken Dr. Benjamin Neel für seine Unterstützung während dieses Projekts, Dr. Shuang Zhang für die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls und Dr. Kiyomi Araki für ihre Hilfe bei der Optimierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA im HBSS ohne Kalzium, Magnesium und NatriumbicarbonatCorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
Fortgeschrittenes DMEM/F12Gibco12-634-028
Im Alter von C57 BL/6J (weiblich)Das Jackson-Labor000664
AllPrep DNA/RNA Mini-KitQIAGEN80204Für DNA/RNA-Extraktion
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Integrierte DNA-Technologien10008100
Anti-Ki67-AntikörperAbcamab15580
AutoClip-SystemFeine wissenschaftliche Werkzeuge12020-00Für den Wundverschluss nach IBI
B-27 Supplement (50x), serumfreiGibco17-504-001
Blastizidin HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenANT-BL-05
Rinderserum-AlbuminSigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393Zellen vor der DNA/RNA-Extraktion zu lysieren
ZellwiederherstellungslösungCorning354253
Kollagenase/HyaluronidaseSTEMCELL-Technologien07912
CoraLite 594-Phalloidin (rot)ProteintechPF00003
Deckglas 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Deckglas 24 mm & spitz; 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 SupplementGibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Deoxyribonuklease I (DNAse I) aus der bunter BauchspeicheldrüseSigma AldrichD5025
Difco MagermilchBecton Dickinson232100
DispaseSTEMCELL-Technologien07913
DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/L Glukose und NatriumpyruvatCorning10013CV
DNase I rekombinant, RNase-freiRoche04716728001
Dulbeccos phosphatgepufferte LösungSigma AldrichD8537
Dumont #5 – Keramikbeschichtete PinzetteFeine wissenschaftliche Werkzeuge11252-50Zur Eileiter-Dissektion
Fetales RinderserumCorning35-010-CVHitze-Inaktivieren bei 56 ��C; C für 60 Minuten.
Feine Schere – ToughCutFeine wissenschaftliche Werkzeuge14058-09Für Eileiterentnahme und IBI-Schnitt
Geneticin-selektives Antibiotikum (G418-Sulfat) (50 mg/mL)Gibco10131027
GlutaMAX-Supplement (100x)Gibco35-050-061
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Cyanin3InvitrogenA10520
Graefe ForcepsFeine wissenschaftliche Werkzeuge11053-10Für den Umgang mit Gewebe
HEPES-PufferCorning25060CI
Humanes R-Spondin-1 rekombinantes ProteinPeproTech120-38
Insulinspritze, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G) x 12,7 mm (1/2")BDBD329461
Insulin-Transferrin-Selen (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matrigel GFR BasementmembranmatrixCorning356231BMM
Maus EGF Rekombinantes ProteinPeproTech315-09
Maus FGF-basisches rekombinantes ProteinPeproTech450-33
Rekombinantes Rekombinantes Protein von Maus-NogginPeproTech250-38
Rekombinantes Wnt-3a-Protein der MausPeproTech315-20
N2-ErgänzungGibco17502048
N-Acetylcystein-AmidSigma AldrichA0737
Neon NxT ElektroporationssystemInvitrogenNEON1SFür die CRISPR-Cas9-Elektroporation
Neon NxT Elektroporationssystem 10-μ L-Kit mit 1-Kanal-RöhrenInvitrogenN1025Verbrauchsmaterialien für Elektroporation, einschließlich Genom-Editierungspuffer
NikotinamidSigma AldrichN3376
Normales MausserumInvitrogen10410
Normales RattenserumSTEMCELL-Technologien13551
Opti-MEM I reduziertes SerummediumGibco31985070
PAX8 Polyklonaler AntikörperProteintech10336-1-AP
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromycinSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm & akut; 75 mm & akut; 1,0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Fisher-BioreagenzienBP151
TrypLE Express Enzyme (1x), kein rotes PhenolGibco12-604-013
Vannas Spring Scissors – 4 mm SchneideFeine wissenschaftliche Werkzeuge15019-10Zur Eileiter-Dissektion
Y27632STEMCELL-Technologien72304Rho-kinase (ROCK) Inhibitor 

Referenzen

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Eileiter OrganoideMaus TumormodellOrganoidkulturGentechnikCRISPR Cas9 Deletionlentivirale berexpressionInteraktion mit dem ImmunsystemInjektion in die Bursa ovarialis

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