Ein verifizierter Workflow für die MiRNA-seq-Datenverarbeitung und bioinformatische Analyse mit R

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse von miRNA-Seq-Daten mit R vor. Der Workflow ermöglicht es Forschern, miRNA-regulierte Netzwerke und ihre Bedeutung für verschiedene biologische und klinische Fragestellungen zu erforschen. Diese Arbeit soll als praktischer Leitfaden sowohl für Anfänger als auch für erfahrene Forscher auf dem Gebiet der miRNA-Bioinformatik dienen.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige posttranskriptionelle Regulatoren, die eine Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse beeinflussen. Mit der Weiterentwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat sich miRNA-Seq zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Profilierung von miRNA-Expressionsmustern entwickelt. Eine zuverlässige Interpretation solcher Daten erfordert jedoch eine standardisierte und reproduzierbare Analysepipeline. Hier stellen wir einen verifizierten Workflow für die miRNA-Seq-Datenverarbeitung und bioinformatische Analyse mit R vor. Dieses Protokoll umfasst alle wesentlichen Schritte, einschließlich Rohdatenvorverarbeitung, Qualitätskontrolle, Ausrichtung, Quantifizierung, Normalisierung, differentielle Expressionsanalyse, Zielvorhersage, funktionale Anreicherung und Aufbau regulatorischer Netzwerke. Der Workflow ist auf Flexibilität und Transparenz ausgelegt, integriert weit verbreitete R-Pakete und unterstützt speziesspezifische Annotationen und modulare Anpassungen. Darüber hinaus werden die Benutzer durch die Nutzung kuratierter Datenbanken und Visualisierungstools wie Cytoscape bei der Durchführung nachgelagerter biologischer Interpretationen angeleitet. Dieses Protokoll unterstützt nicht nur eine robuste statistische Analyse, sondern ermöglicht auch aussagekräftige Einblicke in miRNA-mRNA-Wechselwirkungen und ihre Rolle bei Krankheitsmechanismen. Es eignet sich besonders gut für Anfänger und erfahrene Forscher, die miRNA-Biomarker-Entdeckungen, Krankheitsmodellierungen oder integrative Multi-Omics-Studien durchführen.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Genexpression signifikant beeinflussen, indem sie im posttranskriptionellen Stadium¹ wirken. Sie funktionieren in der Regel, indem sie an komplementäre Sequenzen in den 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) von Ziel-Boten-RNAs (mRNAs) binden, was zu einem mRNA-Abbau oder einer translationalen Repression führt¹. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden miRNAs zunehmend als zentrale Regulatoren verschiedener biologischer Prozesse anerkannt, darunter Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Immunantworten und Organentwick....

Protocol

HINWEIS: Materialien mit Software-Verknüpfungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bereiten Sie RNA-Proben und Sequenzbibliotheken vor

HINWEIS: Führen Sie die RNA-Extraktion und -Sequenzierung außerhalb dieses Berechnungsworkflows durch. Es gibt mehr als eine Möglichkeit, miRNA-Sequenzierungsdaten zu analysieren. Dieser Abschnitt bietet den Kontext eines praktischen Abschnitts.

1. Extraktion der Gesamt-RNA: Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den biologischen Proben mit einem Kit, das für die Isolierung kleiner RNA optimiert ist (....

Results

Wir haben die microRNA-Expressionsmatrix von GSE133530 heruntergeladen und direkt eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt. Wir haben ein Beispiel für ein analytisches R-Skript für das Dataset in der Zusatzdatei 1 bereitgestellt. Der Datensatz führte ein globales miRNA-Profiling an 16 Nierenzysten unterschiedlicher Größe (minimale Zysten: weniger als 1-5 ml, n = 10; mittlere Zysten: zwischen 10-25 ml, n = 4; große Zysten: mehr als 50 ml, n = 4) und minimal zyst.......

Discussion

Die Analyse von miRNA-Seq-Daten stellt aufgrund der geringen Größe und Redundanz der Reads besondere Herausforderungen dar, was eine strenge Qualitätskontrolle und Vorverarbeitung entscheidend macht. Einer der wichtigsten Schritte im Arbeitsablauf ist das Trimmen von Adaptern. Da miRNAs etwa 22 Nukleotide lang sind, können Adaptersequenzen die Reads leicht dominieren, wenn sie nicht richtig entfernt werden. Wenn kein präzises Trimmen durchgeführt wird, kann dies zu einer Fehlausrichtung .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Humaner miRNA-Microarray	Agilent	/	Ein kommerzielles Array zur Profilierung von microRNAs von menschlichen Proben
Fliege	Johns Hopkins Universität	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Ein Software-Tool zum Ausrichten von Sequenzier-Reads an lange Referenzsequenzen
clusterProfiler (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Ein R-Paket, das für die Analyse der Funktionsanreicherung und die Visualisierung biologischer Hochdurchsatzdaten entwickelt wurde.
Cutadapt	Quelloffen	https://cutadapt.readthedocs.io	Ein Befehlszeilentool, das Adaptersequenzen, Primer, Poly-A-Schwänze und andere unerwünschte Fragmente aus Hochdurchsatz-Sequenzierungs-Reads entfernt.
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium	https://cytoscape.org/	Eine Open-Source-Softwareplattform, die für die Visualisierung und Analyse komplexer biologischer Netzwerke entwickelt wurde.
DESeq2 (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Ein R-Paket, das für die differentielle Genexpressionsanalyse von Zähldaten entwickelt wurde
EnhancedVolcano (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Ein R-Paket, mit dem Vulkandiagramme in Publikationsqualität erstellt werden können.
Schnelle Qualitätskontrolle	Babraham Bioinformatik	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Ein Open-Source-Tool zur Qualitätskontrolle für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten.
featureCounts	Unterlesen / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Ein Programm, das zum Zählen von Lesevorgängen verwendet wird, die auf genomische Merkmale abgebildet sind
HTSeq-Anzahl	Python-Paket	https://htseq.readthedocs.io	Ein Befehlszeilentool, das zählt, wie viele ausgerichtete Hochdurchsatz-Sequenzierungslesevorgänge genomische Merkmale wie Gene oder Exons überlappen. Ich
Illumina Human v2 MicroRNA-Expressions-Beadchip	Illumina	/	Ein kommerzielles Array zur Profilierung von microRNAs von menschlichen Proben
multiMiR (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Ein R-Paket, das die größte integrierte Sammlung von vorhergesagter und experimentell validierter microRNA bietet– Wechselwirkungen und ihre Assoziationen mit Krankheiten und Arzneimitteln gezielt ins Visier nehmen.
Org. Hs.eg.db (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Ein Annotationspaket, das für die Genomforschung des Menschen (Homo sapiens) entwickelt wurde.
R Software	R-Projekt	https://www.r-project.org/	Ein Open-Source-Projekt für statistisches Rechnen
Rstudio	Posit PBC	/	Eine integrierte Entwicklungsumgebung hilft, mit R und Python produktiver zu sein
SAMtools	Quelloffen	http://www.htslib.org/	Ein Softwarepaket zur Manipulation von Next-Generation-Sequencing-Daten (NGS).