Ein verifizierter Workflow für die MiRNA-seq-Datenverarbeitung und bioinformatische Analyse mit R

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse von miRNA-Seq-Daten mit R vor. Der Workflow ermöglicht es Forschern, miRNA-regulierte Netzwerke und ihre Bedeutung für verschiedene biologische und klinische Fragestellungen zu erforschen. Diese Arbeit soll als praktischer Leitfaden sowohl für Anfänger als auch für erfahrene Forscher auf dem Gebiet der miRNA-Bioinformatik dienen.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige posttranskriptionelle Regulatoren, die eine Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse beeinflussen. Mit der Weiterentwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat sich miRNA-Seq zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Profilierung von miRNA-Expressionsmustern entwickelt. Eine zuverlässige Interpretation solcher Daten erfordert jedoch eine standardisierte und reproduzierbare Analysepipeline. Hier stellen wir einen verifizierten Workflow für die miRNA-Seq-Datenverarbeitung und bioinformatische Analyse mit R vor. Dieses Protokoll umfasst alle wesentlichen Schritte, einschließlich Rohdatenvorverarbeitung, Qualitätskontrolle, Ausrichtung, Quantifizierung, Normalisierung, differentielle Expressionsanalyse, Zielvorhersage, funktionale Anreicherung und Aufbau regulatorischer Netzwerke. Der Workflow ist auf Flexibilität und Transparenz ausgelegt, integriert weit verbreitete R-Pakete und unterstützt speziesspezifische Annotationen und modulare Anpassungen. Darüber hinaus werden die Benutzer durch die Nutzung kuratierter Datenbanken und Visualisierungstools wie Cytoscape bei der Durchführung nachgelagerter biologischer Interpretationen angeleitet. Dieses Protokoll unterstützt nicht nur eine robuste statistische Analyse, sondern ermöglicht auch aussagekräftige Einblicke in miRNA-mRNA-Wechselwirkungen und ihre Rolle bei Krankheitsmechanismen. Es eignet sich besonders gut für Anfänger und erfahrene Forscher, die miRNA-Biomarker-Entdeckungen, Krankheitsmodellierungen oder integrative Multi-Omics-Studien durchführen.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Genexpression signifikant beeinflussen, indem sie im posttranskriptionellen Stadium¹ wirken. Sie funktionieren in der Regel, indem sie an komplementäre Sequenzen in den 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) von Ziel-Boten-RNAs (mRNAs) binden, was zu einem mRNA-Abbau oder einer translationalen Repression führt¹. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden miRNAs zunehmend als zentrale Regulatoren verschiedener biologischer Prozesse anerkannt, darunter Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, Immunantworten und Organentwicklung². Darüber hinaus wurde eine Dysregulation der miRNA-Expression mit der Pathogenese zahlreicher Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurologischen Störungen und Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht³. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial von miRNAs nicht nur als therapeutische Ziele, sondern auch als minimal-invasive Biomarker in der klinischen Diagnostik.

Mit dem Aufkommen von Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS) ist die Erforschung von miRNAs in eine neue Ära eingetreten. Im Gegensatz zu Microarray-basierten Methoden, die auf bekannte miRNAs beschränkt sind, ermöglicht die miRNA-Sequenzierung (miRNA-Seq) ein umfassendes, hochwirksames und unvoreingenommenes Profiling sowohl bekannter als auch neuer miRNAs über verschiedene Probentypen und -bedingungen hinweg⁴. miRNA-Seq bietet eine überlegene Empfindlichkeit, Genauigkeit und einen überragenden Dynamikbereich, was es zu einer bevorzugten Methode zur Untersuchung von miRNA-Expressionsmustern und zur Entdeckung von Regulationsmechanismen in physiologischen und pathologischen Umgebungen macht⁵. Die Analyse von miRNA-Seq-Daten stellt jedoch besondere rechnerische Herausforderungen dar, darunter der Umgang mit kurzen Leselängen, die Entfernung von Adaptersequenzen, die Unterscheidung zwischen eng verwandten miRNA-Familienmitgliedern und die Verwaltung einer hohen Redundanz bei den Lesezahlen⁶. Diese Eigenschaften erfordern einen sorgfältig konzipierten und standardisierten analytischen Arbeitsablauf.

Obwohl verschiedene Pipelines und Softwaretools für die miRNA-Seq-Datenanalyse entwickelt wurden, verlassen sich viele von ihnen auf grafische Benutzeroberflächen oder feste Arbeitsabläufe, die die Flexibilität und Reproduzierbarkeit einschränken⁷. Im Gegensatz dazu bietet die Programmierumgebung R eine leistungsstarke und anpassbare Plattform für die bioinformatische Analyse⁸. R bietet ein umfangreiches Ökosystem von Paketen für statistische Modellierung, Datenvisualisierung und Integration in biologische Datenbanken. Dies ermöglicht es den Anwendern, umfassende und reproduzierbare Analysen transparent und skriptbasiert durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht der modulare Aufbau von R-Workflows den Forschern, jeden Schritt an spezifische experimentelle Anforderungen anzupassen, von der Rohdatenvorverarbeitung bis zur funktionalen Interpretation.

In diesem Protokoll stellen wir einen verifizierten und vollständigen miRNA-Seq-Analyse-Workflow vor, der vollständig in R implementiert ist, mit dem Ziel, Forschern, die mit miRNA-Expressionsdaten arbeiten, eine reproduzierbare und vom Benutzer anpassbare Lösung zu bieten. Der Arbeitsablauf beginnt mit der Qualitätskontrolle und dem Adaptertrimmen von Rohsequenzierungs-Reads, gefolgt von der Ausrichtung auf ein Referenzgenom oder bekannte miRNA-Sequenzen. Zu den nachfolgenden Schritten gehören die Quantifizierung der Lesezahlen, die Normalisierung, die differentielle Expressionsanalyse, die Vorhersage des Zielgens, die funktionelle Anreicherung und die Netzwerkvisualisierung. Der Workflow umfasst mehrere weit verbreitete und gut gepflegte R-Pakete, die sowohl die Zuverlässigkeit als auch die Kompatibilität mit zukünftigen Updates und Erweiterungen gewährleisten.

Eine der Hauptstärken dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, über differentielle Expressionsergebnisse hinauszugehen und eine aussagekräftige biologische Interpretation zu liefern. Durch die Integration kuratierter Datenbanken mit validierten und vorhergesagten miRNA-mRNA-Interaktionen ermöglicht der Workflow den Nutzern, biologisch relevante Zielgene zu identifizieren. Diese Ziele können dann einer Genontologie und Signalanreicherungsanalysen unterzogen werden, um betroffene biologische Prozesse und molekulare Signalwege aufzudecken. Im letzten Schritt können miRNA-mRNA-Interaktionsnetzwerke mit externen Tools wie Cytoscape⁹ visualisiert werden, um Einblicke in die regulatorische Landschaft zu erhalten und wichtige Hub-miRNAs mit potenzieller funktioneller Bedeutung zu identifizieren.

Diese Methode wurde erfolgreich in der klinischen Forschung eingesetzt, unter anderem in Studien zu Nierenerkrankungen, bei denen zirkulierende miRNAs als vielversprechende Biomarker für Diagnose und Prognose dienen¹⁰. Durch das modulare und flexible Design des Workflows eignet er sich jedoch für eine Vielzahl von Anwendungen, darunter Krankheitsmodellierung, Studien zum Ansprechen auf Medikamente, Entwicklungsbiologie und vergleichende Genomik. Forscher können den Arbeitsablauf leicht anpassen, um artspezifische Annotationen, Versuchsbedingungen oder zusätzliche Schichten von Omics-Daten aufzunehmen.

Durch das Angebot einer skriptbasierten Open-Source-Lösung behebt diese R-zentrierte Pipeline mehrere der größten Einschränkungen, die mit bestehenden miRNA-Seq-Tools verbunden sind, darunter begrenzte Anpassungsmöglichkeiten, Abhängigkeit von intransparenten grafischen Oberflächen, mangelnde Unterstützung für Nicht-Modellorganismen, schlechte Reproduzierbarkeit aufgrund fehlender Versionskontrolle und Schwierigkeiten bei der Integration mit nachgelagerten statistischen und funktionalen Analyse-Frameworks. Es ermöglicht die volle Kontrolle über die Parameter der Datenverarbeitung, fördert die Reproduzierbarkeit durch versionskontrollierten Code und fördert die Transparenz in der bioinformatischen Forschung. Da die Bedeutung von miRNAs im Kontext der Systembiologie und der translationalen Medizin weiter zunimmt, wird der Zugang zu einem zuverlässigen und anpassungsfähigen Analyserahmen immer wichtiger.

Protocol

HINWEIS: Materialien mit Software-Verknüpfungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bereiten Sie RNA-Proben und Sequenzbibliotheken vor

HINWEIS: Führen Sie die RNA-Extraktion und -Sequenzierung außerhalb dieses Berechnungsworkflows durch. Es gibt mehr als eine Möglichkeit, miRNA-Sequenzierungsdaten zu analysieren. Dieser Abschnitt bietet den Kontext eines praktischen Abschnitts.

1. Extraktion der Gesamt-RNA: Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den biologischen Proben mit einem Kit, das für die Isolierung kleiner RNA optimiert ist (z. B. miRNA-Isolationskit). Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers sorgfältig. Stellen Sie sicher, dass Sie RNase-freie Verbrauchsmaterialien verwenden und die Proben auf Eis aufbewahren, um den Abbau zu minimieren.
2. Bewertung der RNA-Integrität und -Menge: Führen Sie 1-2 μl der extrahierten RNA auf einem Bioanalysator oder einem gleichwertigen Gerät aus. Überprüfen Sie die RNA-Integritätsnummer (RIN) und stellen Sie sicher, dass sie für eine zuverlässige Sequenzierung ≥ 7,0 beträgt. Erfassen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer oder Fluorometer.
3. Aufbau kleiner RNA-Bibliotheken: Bereiten Sie Sequenzierungsbibliotheken aus 1 μg Gesamt-RNA mit einem kommerziellen Vorbereitungskit für kleine RNA-Seq-Bibliotheken vor. Befolgen Sie das Kit-Protokoll, um Adapter zu ligieren, zurückzutranskribieren und die cDNA zu amplifizieren. Aufreinigen Sie die PCR-Produkte mit Größenauswahl (z. B. 18-30 nt Insert), um sie für miRNA-Fragmente anzureichern.
4. Sequenzbibliotheken: Laden Sie die Bibliotheken auf eine Sequenzierungsplattform mit hohem Durchsatz. Legen Sie die Ausführungskonfiguration für Single-End-Sequenzierung mit einer Leselänge von ~50 bp fest. Stellen Sie sicher, dass jede Probe ca. 10 Millionen Rohlesevorgänge generiert, um eine ausreichende Tiefe zu erreichen.
5. Sequenzierungsausgabe exportieren: Exportieren Sie nach der Sequenzierung die Rohdaten als FASTQ-Dateien mit der Datenausgabesoftware des Geräts. Stellen Sie sicher, dass das Ausgabeverzeichnis sowohl die Sequenzlesevorgänge als auch die zugehörigen Qualitätsbewertungsdateien enthält. Speichern Sie die FASTQ-Dateien in einem strukturierten Verzeichnis für die nachgelagerte Analyse.

2. Rohlesevorgänge vorverarbeiten und Qualitätskontrolle durchführen

1. Adapter-Sequenzen trimmen
   1. Installieren und konfigurieren Sie Cutadapt oder fastp.
   2. Führen Sie die Adapterkürzung für jede FASTQ-Datei mit dem folgenden Befehl aus:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      HINWEIS: Die Adaptersequenz nach '-a' sollte für das spezifische sRNA-Bibliotheksvorbereitungskit gelten. '-o' definiert den Namen der Ausgabedatei, gefolgt von der Eingabedatei.
2. Bewerten Sie die Lesequalität
   1. Verwenden Sie FastQC, um Qualitätskontrollberichte zu erstellen:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Überprüfen Sie die Qualitätsbewertungen pro Base, die Verteilung der Leselänge und die Adapterkontamination: Öffnen Sie den FastQC-HTML-Bericht, der für jede FASTQ-Datei generiert wurde, in einem Webbrowser. Untersuchen Sie Schritt für Schritt die folgenden Module:
      1. Qualität der Sequenz pro Base: Stellen Sie sicher, dass die meisten Basen im grünen Bereich liegen (Phred-Wert ≥30). Achten Sie auf Qualitätsverluste am 3'-Ende, die auf Sequenzierungsfehler hinweisen könnten.
      2. Leselängenverteilung: Vergewissern Sie sich, dass die Verteilung der erwarteten Insertgröße entspricht (z. B. 18-30 nt für miRNAs). Vergewissern Sie sich, dass keine unerwarteten Spitzen vorhanden sind.
      3. Adapterinhalt: Stellen Sie sicher, dass die Adaptersequenzen effektiv getrimmt wurden. Vergewissern Sie sich, dass der Verschmutzungsgrad des Adapters nach dem Trimmen nahe Null liegt.
   3. Speichern Sie den FastQC-Zusammenfassungsbericht und markieren Sie alle Proben mit Metriken von schlechter Qualität, um sie erneut zu kürzen oder von der weiteren Analyse auszuschließen.

3. Zuordnen von Lesevorgängen und Generieren von Zählmatrizen

1. Reads an Referenz ausrichten
   1. Laden Sie die FASTA-Datei des Referenzgenoms oder reifer miRNA-Sequenzen (z. B. aus miRBase) ^herunter11. Beispiel:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Indizieren Sie das Referenzgenom mit Bowtie.
      1. Öffnen Sie ein Terminal, und führen Sie den folgenden Befehl aus, um den Index zu erstellen:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. Ersetzen Sie reference.fa durch den tatsächlichen FASTA-Dateinamen.
      3. Ersetzen Sie reference_index durch das gewünschte Präfix für den Index.
      4. Stellen Sie sicher, dass Bowtie mehrere Indexdateien generiert (z. B. .ebwt). Stellen Sie sicher, dass diese Dateien im Arbeitsverzeichnis vorhanden sind, da sie für die Ausrichtung erforderlich sind.
   3. Richten Sie Lesevorgänge mit Bowtie mit geeigneten Parametern für kurze Lesevorgänge aus. Beispiel:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      HINWEIS: Die Eingabedatei ist trimmed_reads.fastq, und die Ausgabedatei ist aligned_reads.sam. '-v 0' bedeutet, dass wir keinen Fehler beim gesamten Lesen zulassen. '-a -best -strata' bedeutet, dass wir jede Ausrichtung verwerfen, die mehr Unstimmigkeiten aufweist als die beste.
2. Quantifizierung der miRNA-Expression
   1. Konvertieren Sie SAM-Dateien mit SAMtools in das BAM-Format.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      HINWEIS: Die Eingabedatei aligned_reads.sam ist das Ergebnis des letzten Befehls. Die Ausgabedatei aligned_reads.bam wird für die anschließende Analyse vorbereitet.
      1. Verwenden Sie SAMtools, um die Ausrichtungsdatei zu komprimieren und zu sortieren:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. Stellen Sie sicher, dass der erste Befehl die SAM-Datei in das BAM-Format konvertiert.
      3. Stellen Sie sicher, dass der zweite Befehl die BAM-Datei nach genomischen Koordinaten sortiert.
      4. Stellen Sie sicher, dass der dritte Befehl eine Indexdatei (.bai) generiert, die für nachgelagerte Analysen erforderlich ist.
      5. Vergewissern Sie sich, dass sowohl die sortierte BAM-Datei als auch ihr Index erfolgreich erstellt wurden, bevor Sie mit der Quantifizierung fortfahren.
   2. Verwenden Sie featureCounts oder HTSeq-count, um eine Zählmatrix mit der miRNA-Annotation GTF zu generieren:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      HINWEIS: featureCounts quantifiziert die Lesevorgänge in der Eingabedatei aligned_reads.bam basierend auf miRNA.gtf und gibt counts.txt aus.

4. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse in R durch

1. Daten zur Lastanzahl
   1. Importieren Sie die Zählmatrix und die Stichprobenmetadaten in R:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      HINWEIS: Die Zähldaten (counts.csv) und die Probengruppe (metadata.csv) müssen an DESeq2 übermittelt werden. "Bedingung" verdeutlicht hier die Gruppe der bereitgestellten Proben. Für individuelle Anforderungen siehe Handbuch von DESeq2¹².
2. Normalisieren und Transformieren von Daten
   1. Normalisieren Sie Zähldaten mit der Standardmethode von DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Varianzstabilisierende Transformation durchführen:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. Visualisieren Sie das Clustering von Stichproben mit PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Differentiell exprimierte miRNAs identifizieren
   1. Extrahieren und Sortieren von Ergebnissen differenzieller Ausdrücke:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      HINWEIS: Wir ordnen die Ergebnisdatei 'res' basierend auf dem Wert von pvalue neu an.
      summary(res)
   2. Filter für signifikant differentiell exprimierte miRNAs (p-Wert < 0,05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      HINWEIS: Es gibt mehrere Schwellenwerte für die Filterung signifikant veränderter miRNAs. Die Anforderungen 'p-Wert < 0,05, |log2FC| > 1' sind weit verbreitet. Die Schwellenwerte können für einzelne Daten angepasst werden.
4. Visualisieren von Ausdrucksänderungen
   1. Installieren und laden Sie das EnhancedVolcano-Paket.
   2. Erstellen Sie das Vulkandiagramm:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. Vorhersage von Zielgenen von miRNAs

1. Abfragen von Datenbanken
   1. Verwenden Sie Online-Ressourcen wie TargetScan, miRDB und miRTarBase, um nach spezifischer microRNA zu suchen und Zielgene abzurufen.
   2. Konzentrieren Sie sich auf experimentell validierte Ziele, um die Zuverlässigkeit zu erhöhen.
2. Automatisieren der Vorhersage in R
   1. Laden Sie das multiMiR-Paket und fragen Sie validierte Ziele ab:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      HINWEIS: Hier nehmen wir zum Beispiel "has-miR-21-5p" und erhalten validierte Ziele.
   2. Extrahieren Sie einzigartige Zielgensymbole für die Anreicherungsanalyse:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. Führen Sie eine funktionale Anreicherungsanalyse durch

1. Durchführen der GO-Anreicherung
   1. Werkzeuge zur Ladeanreicherung:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      HINWEIS: Hier laden wir eine Datenbank mit Annotationen des menschlichen Genoms, die für die Konvertierung gängiger Genidentifikatoren nützlich sind.
   2. Führen Sie die GO-Anreicherungsanalyse für biologische Prozesse durch:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      HINWEIS: Für die Verwendung von enrichGO stellen wir eine Liste von Genen zur Verfügung und stellen klar, dass sie hier als "SYMBOL" nominiert sind. Wir führten eine biologische Prozessanreicherung durch, die dem Parameter 'ont = BP' entspricht. Wir führen mehrere Testkorrekturen durch, daher bezeichnen wir pAdjustMethod = "BH". Für einen signifikanten Schwellenwert wählen wir pvalueCutoff = 0.05.dotplot zeigt ein visualisiertes Ergebnis an. Weitere individuelle Optionen finden Sie im Handbuch von clusterProfiler¹³.
2. Durchführung einer Anreicherung des KEGG-Signalwegs
   1. Führen Sie die KEGG-Anreicherung aus:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      HINWEIS: Für die Verwendung von enrichKEGG stellen wir eine Liste von Genen zur Verfügung und klären den Organismus als menschlich ("hat"). dotplot stellt ein visualisiertes Ergebnis dar. Weitere individuelle Optionen finden Sie im Handbuch von clusterProfiler¹³.

7. Konstruktion und Visualisierung des miRNA-mRNA-Interaktionsnetzwerks

1. Exportieren von Daten für die Netzwerkvisualisierung
2. Erstellen Sie einen Datenrahmen von miRNA-Zielgenpaaren basierend auf den Zielen, die von TargetScan, miRDB oder miRTarBase generiert wurden.
3. Schreiben Sie die Netzwerktabelle in CSV:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Import in Cytoscape
   1. Öffnen Sie Cytoscape und importieren Sie die Netzwerktabelle.
   2. Visualisieren Sie das Netzwerk mit einem kraftgerichteten oder kreisförmigen Layout.
   3. Analysieren Sie topologische Eigenschaften (z. B. Gradzentralität), um Hub-miRNAs zu identifizieren.

Results

Wir haben die microRNA-Expressionsmatrix von GSE133530 heruntergeladen und direkt eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt. Wir haben ein Beispiel für ein analytisches R-Skript für das Dataset in der Zusatzdatei 1 bereitgestellt. Der Datensatz führte ein globales miRNA-Profiling an 16 Nierenzysten unterschiedlicher Größe (minimale Zysten: weniger als 1-5 ml, n = 10; mittlere Zysten: zwischen 10-25 ml, n = 4; große Zysten: mehr als 50 ml, n = 4) und minimal zyst...

Discussion

Die Analyse von miRNA-Seq-Daten stellt aufgrund der geringen Größe und Redundanz der Reads besondere Herausforderungen dar, was eine strenge Qualitätskontrolle und Vorverarbeitung entscheidend macht. Einer der wichtigsten Schritte im Arbeitsablauf ist das Trimmen von Adaptern. Da miRNAs etwa 22 Nukleotide lang sind, können Adaptersequenzen die Reads leicht dominieren, wenn sie nicht richtig entfernt werden. Wenn kein präzises Trimmen durchgeführt wird, kann dies zu einer Fehlausrichtung ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Humaner miRNA-Microarray	Agilent	/	Ein kommerzielles Array zur Profilierung von microRNAs von menschlichen Proben
Fliege	Johns Hopkins Universität	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Ein Software-Tool zum Ausrichten von Sequenzier-Reads an lange Referenzsequenzen
clusterProfiler (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Ein R-Paket, das für die Analyse der Funktionsanreicherung und die Visualisierung biologischer Hochdurchsatzdaten entwickelt wurde.
Cutadapt	Quelloffen	https://cutadapt.readthedocs.io	Ein Befehlszeilentool, das Adaptersequenzen, Primer, Poly-A-Schwänze und andere unerwünschte Fragmente aus Hochdurchsatz-Sequenzierungs-Reads entfernt.
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium	https://cytoscape.org/	Eine Open-Source-Softwareplattform, die für die Visualisierung und Analyse komplexer biologischer Netzwerke entwickelt wurde.
DESeq2 (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Ein R-Paket, das für die differentielle Genexpressionsanalyse von Zähldaten entwickelt wurde
EnhancedVolcano (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Ein R-Paket, mit dem Vulkandiagramme in Publikationsqualität erstellt werden können.
Schnelle Qualitätskontrolle	Babraham Bioinformatik	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Ein Open-Source-Tool zur Qualitätskontrolle für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten.
featureCounts	Unterlesen / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Ein Programm, das zum Zählen von Lesevorgängen verwendet wird, die auf genomische Merkmale abgebildet sind
HTSeq-Anzahl	Python-Paket	https://htseq.readthedocs.io	Ein Befehlszeilentool, das zählt, wie viele ausgerichtete Hochdurchsatz-Sequenzierungslesevorgänge genomische Merkmale wie Gene oder Exons überlappen. Ich
Illumina Human v2 MicroRNA-Expressions-Beadchip	Illumina	/	Ein kommerzielles Array zur Profilierung von microRNAs von menschlichen Proben
multiMiR (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Ein R-Paket, das die größte integrierte Sammlung von vorhergesagter und experimentell validierter microRNA bietet– Wechselwirkungen und ihre Assoziationen mit Krankheiten und Arzneimitteln gezielt ins Visier nehmen.
Org. Hs.eg.db (R-Paket)	Bioleiter	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Ein Annotationspaket, das für die Genomforschung des Menschen (Homo sapiens) entwickelt wurde.
R Software	R-Projekt	https://www.r-project.org/	Ein Open-Source-Projekt für statistisches Rechnen
Rstudio	Posit PBC	/	Eine integrierte Entwicklungsumgebung hilft, mit R und Python produktiver zu sein
SAMtools	Quelloffen	http://www.htslib.org/	Ein Softwarepaket zur Manipulation von Next-Generation-Sequencing-Daten (NGS).