Methodenartikel

Kundenspezifische 3D-gedruckte Formen für die Bildgebung von Zebrafischen und die Herzentwicklung

DOI:

10.3791/68768

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15. August 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine Methode, bei der mit einem kostengünstigen stereolithographischen 3D-Drucker Formen hergestellt werden, um die reproduzierbare Montage von Zebrafischembryonen für bildgebende Untersuchungen zu erleichtern. Mit dieser Methode haben wir Formen für die Abbildung der kardialen Morphogenese in Zebrafischembryonen hergestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Embryonalisierung ist eine der technischen Herausforderungen, mit denen Forscher bei der Durchführung eines Bildgebungsprojekts konfrontiert sind. Die Embryonen müssen reproduzierbar ausgerichtet werden, so dass das Gewebe während der gesamten Bildgebungszeit für ein Mikroskopobjektiv zugänglich ist. Um diese Herausforderung zu meistern, können Forscher Embryonen in viskose Medien einbetten oder spezielle Schalen und Abgüsse herstellen, um die Embryonen während der Bildgebung in einer gewünschten Ausrichtung zu halten. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung eines kostengünstigen stereolithographischen (SLA) 3D-Druckers zur Herstellung wiederverwendbarer Formen, die Agarose-Vertiefungen erzeugen, in die Embryonen für die Bildgebung montiert werden können. Diese Agarose-Vertiefungen bieten ein zuverlässiges Mittel zur Orientierung mehrerer Embryonen für die Bildgebung. Diese Methode umfasst ein Design-Framework, das leicht an eine Vielzahl von Geweben, Organismen und Bildgebungsherausforderungen angepasst werden kann. Mit dieser Methode haben wir Formen für die Darstellung der Herzentwicklung bei Zebrafischen sowohl für aufrechte als auch für inverse Mikroskope hergestellt. Durch die Verwendung von Materialien und Geräten, die zugänglich sind, ermöglicht diese Methode den Forschern, auf einfache Weise Formen zu erstellen, die speziell auf ihre Montageanforderungen zugeschnitten sind.

Einleitung

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Die Visualisierung der zellulären Dynamik in einem intakten Tier ist wesentlich für das Verständnis der Pathologien angeborener Krankheiten und der grundlegenden Prozesse der Entwicklung und Homöostase. Diese Visualisierung umfasst die Bildgebung auf mehreren räumlichen Skalen, um die physiologische Dynamik in einem gesamten Organismus sowie auf Gewebe-, zellulärer und subzellulärer Ebene zu identifizieren. Die Bildgebungsmodalitäten, die zur Visualisierung der zellulären Dynamik verwendet werden, reichen von Immunfluoreszenzstudien an fixierten Proben bis hin zur Zeitrafferbildgebung von lebenden Proben. Diese Bildgebungsmodalitäten erfordern, dass intakte Proben in bestimmten Orientierungen gehalten werden, so dass ein Bereich von Interesse für das Mikroskopobjektiv zugänglich ist.

Zebrafischembryonen sind aufgrund ihrer optischen Transparenz, genetischen Rückverfolgbarkeit, externen Befruchtung und Herkunft von Wirbeltieren ein idealer Modellorganismus für bildgebende Untersuchungen. Die Montage von Zebrafischembryonen in einer bestimmten Orientierung auf konsistente und reproduzierbare Weise stellte jedoch eine ständige Herausforderung dar. Die Montage ist eine besondere Herausforderung für die Visualisierung der Herzentwicklung in Zebrafischembryonen, da die kardiale Morphogenese in verschiedenen Ebenen stattfindet1.

Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die Herausforderungen bei der Aufzucht von Embryonen für die Bildgebung zu bewältigen. Eine der einfachsten Methoden besteht darin, Zebrafischembryonen zwischen zwei Deckgläsern mit Klebebandschichten zwischen den Deckgläsern zu befestigen, um ein Quetschen zu verhindern. Diese Methode ermöglicht die Bildgebung sowohl auf inversen als auch auf aufrechten Mikroskopen2. Zebrafischembryonen können auch in ein hochviskoses Medium oder Gel wie Methylcellulose oder Agarose mit einer niedrigen Schmelzpunkttemperatur von 0,1 bis 0,8 % eingelegt werden, um die Embryonen in bestimmten Orientierungen zu halten 2,3,4. Diese Ansätze mit niedrigem Durchsatz eignen sich gut für viele Bildgebungsprojekte. Die Sicherstellung der Integrität des Embryos und das reproduzierbare Erreichen spezifischer Orientierungen kann jedoch problematisch sein. Um den Bildgebungsdurchsatz zu erhöhen und die Einbettung zu erleichtern, können Wells in regelmäßigen Abständen aus erstarrter Agarose in einer Bildgebungsschale erzeugt werden 5,6,7,8. Um die Herstellung dieser Agarose-Vertiefungen zu erleichtern, wurden Kunststoffformen hergestellt 9,10,11. Während diese Formen für die Bildgebung entlang der standardmäßigen dorsal-ventral-lateralen Achsen 10,12 angewendet werden können, sind sie häufig für spezifische bildgebende Herausforderungen hergestellt, wie z. B. für die Verwendung in 96-Well-Platten13 oder für die Detektion des ersten Herzschlags14. In speziellen Fällen wurden ganze Bildgebungsschüsseln erstellt 5,15,16. Zum Beispiel erleichtert eine mikrofluidische Kammer (genannt ZEBRA) aus PDMS sowohl die Bildgebung als auch die Exposition von Embryonen gegenüber Chemikalien17. Diese Formen werden oft aus Silikon hergestellt oder aus Lucite 10,18,19 gefräst. Das Aufkommen relativ kostengünstiger dreidimensionaler (3D) Drucker hat jedoch die Herstellung kundenspezifischer Formen demokratisiert, die zur Herstellung von Agarose-Imaging-Wells verwendet werden.

Beim 3D-Druck, auch additive oder mehrschichtige Fertigung genannt, wird aus einem digitalen Design durch sequentielles Hinzufügen und Verschmelzen einzelner Schichten ein 3D-Objekt hergestellt20,21. Bei der Stereolithographie (SLA) wird ultraviolettes (UV) Licht verwendet, um ein lichtempfindliches flüssiges Harz in aufeinanderfolgenden Schichtenauszuhärten 22. SLA-Drucker sind kostengünstig, schnell und hochpräzise und können mit einer Vielzahl von Harzen verwendet werden, einschließlich solcher, die eine glatte Oberfläche liefern16. Der Prozess beginnt mit einer CAD-Software (Computer Aided Design), bei der digitale Modelle des Objekts de novo entworfen oder von bereits vorhandenen Entwürfen modifiziert werden können. Das digitale Modell wird dann virtuell in druckbare Schichten geschnitten. Anhand dieser digitalen Schichten konstruiert ein 3D-Drucker das Objekt Schicht für Schicht. Hier stellen wir eine Methode und ein Framework für das kundenspezifische Design und die Erstellung von Imaging-Formen mit einem kostengünstigen, kommerziell erhältlichen SLA-3D-Drucker vor. Darüber hinaus verwenden wir dieses Gerüst, um Formen für die Abbildung verschiedener Stadien der Herzentwicklung von Zebrafischen entweder auf inversen oder aufrechten Mikroskopen und für die Abbildung von Zebrafischembryonen entlang ihrer lateralen, dorsalen oder ventralen Achsen zu erstellen.

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Protokoll

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Die hier beschriebenen Protokolle, Experimente und Ergebnisse wurden in Übereinstimmung mit den Tierschutzbestimmungen und -richtlinien und dem Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Mississippi (Protokoll #24-008) durchgeführt.

Um Agarose-Vertiefungen in verschiedenen Formen zu erzeugen, in denen Embryonen für die Bildgebung orientiert werden können, haben wir ein Design entwickelt, bei dem eine Basis verwendet wird, die an Stiften befestigt ist (Abbildung 1A). Die Form dieser Stifte (siehe Pfeil, der in Abbildung 1A auf die Stifte in violett zeigt) kann angepasst werden, um Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien zu orientieren und sich auf verschiedene Gewebe zu konzentrieren. Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll für die Anpassung dieser Heringe und für die Verwendung dieses Systems zur Erstellung von Agarose-Bohrungen.

1. Erstellen einer maßgeschneiderten Bildgebungsform

  1. Erstellen Sie eine vorläufige Skizze der Probe oder des Embryos, die in der gewünschten Ausrichtung positioniert sind. Berücksichtigen Sie die gewünschte Embryoausrichtung und ob das zu verwendende Mikroskop aufrechte oder umgekehrte Objektive enthält. Berücksichtigen Sie auch die Größe der Schale, die Anzahl der zu montierenden Embryonen und den Abstand zwischen ihnen.
  2. Messen Sie die Abmessungen des Embryos (z. B. Länge, Breite und Höhe) mit einem Mikroskop in Kombination mit einem Softwaretool wie FIJI23. Verwenden Sie diese Abmessungen, um sicherzustellen, dass die Embryonen in die Vertiefungen passen, die durch die Stifte erzeugt werden.
  3. Identifizieren Sie eine Form, die der Geometrie des Embryos entspricht. Erstellen Sie anhand der Messungen aus Schritt 1.2 in Kombination mit einer CAD-Software (Computer Aided Design) einen Stift, der die Form und Größe der Probe annähert.
    HINWEIS: Diese Form kann in einem einfachen CAD-Softwareprogramm erstellt werden, indem verschiedene vorgefertigte Formen kombiniert und überlappt werden, oder die Form kann mit einem fortschrittlichen CAD-Softwareprogramm neu erstellt werden. Zusätzlich kann man einen unserer vorgefertigten Heringe modifizieren (siehe Ergänzungsdatei 1). Das Verjüngen des Stifts, wie in Abbildung 1A, kann helfen, die Embryonen zu orientieren, um sicherzustellen, dass das Gewebe von Interesse dem Ziel am nächsten ist.
  4. Kombinieren Sie das Heringsdesign mit dem Basisdesign:
    1. Fügen Sie in einem CAD-Softwareprogramm einen benutzerdefinierten Stift zu einer der vorgefertigten Untergründe hinzu (Ergänzende Datei 1). Duplizieren Sie dann die Stifte und platzieren Sie sie gleichmäßig in der Basis, um eine Abbildung mit hohem Durchsatz zu erzielen, indem Sie die Werkzeuge in einem fortschrittlichen CAD-Programm verwenden. Vergewissern Sie sich, dass alle Heringe die gleiche Höhe von der Basis entfernt erreichen.
  5. Bereiten Sie das Design für den 3D-Druck vor:
    1. Übertragen Sie das kundenspezifische Formdesign oder eine der vorgefertigten Formen (Supplemental File 2) an eine Slicer-Software, die das Design in Befehle für den 3D-Drucker umwandelt.
    2. Achten Sie in der Slicer-Software darauf, das Design so zu drehen, dass kritische Komponenten wie die Stifte vom Druckertisch entfernt positioniert sind. Positionieren Sie den Deckglashalter, der auf einem FDM-Drucker (Fused Deposition Modeling) gedruckt wird, horizontal.
      HINWEIS: Durch Drehen des Designs wird ein Verziehen vermieden, das auftreten kann, wenn empfindliche Teile in der Nähe des Drucktisches positioniert werden.
    3. Fügen Sie Stützen in der Slicer-Software hinzu, um sicherzustellen, dass empfindliche Aspekte der Form während des Drucks nicht brechen. Die mittlere Funktion zur automatischen Platzierung von Stützen in der Software sorgt zusammen mit der manuellen Kuratierung für eine gute Verteilung der Stützen ohne große Lücken. Eine 100%ige Infill-Strategie wird verwendet, um eine feste Form zu erzeugen.
    4. Drucken Sie mehrere Teile gleichzeitig, indem Sie entweder eine einzige STL-Datei verwenden, die alle Formen enthält, oder indem Sie einzelne STL-Dateien mit der Slicer-Software zusammen anordnen.
  6. Druck
    HINWEIS: SLA-Drucker sind aufgrund ihrer Machbarkeit, Präzision und der Erstellung glatter Oberflächen unser bevorzugter 3D-Druckertyp für die Bildgebungsformen. Für die Herstellung des Deckglashalters wird ein FDM-Drucker verwendet, da er leichte, steifere Drucke als SLA-Drucker erstellt.
    1. Beginnen Sie mit folgenden Druckeinstellungen und optimieren Sie von dort aus: 0,05 mm Schichthöhe; 5 Anzahl der unteren Schichten; 2,5 s Belichtungszeit; 35 s untere Belichtungszeit; 5 mm Bodenhub und Hubabstand; 60 mm/min Geschwindigkeit des unteren Hubs; Hubgeschwindigkeit 80 mm/min; und 210 mm/min Rückzugsgeschwindigkeit.
      HINWEIS: Die Druckeinstellungen müssen wahrscheinlich vom Benutzer optimiert werden, da sie vom Harztyp, der Raumtemperatur und dem Druckermodell abhängen.
  7. Waschen Sie die Formen nach dem Drucken in Wasser, entfernen Sie die Stützen und stellen Sie die Formen unter UV-Licht in eine Gewebekulturhaube, um die Verfestigung des Harzes sicherzustellen.
    HINWEIS: Gründliches Waschen und Aushärten der Formen ist wichtig, um zu verhindern, dass das Harz abblättert und die Form sich nicht verformt.
    Beim Umgang mit nicht ausgehärtetem Harz und beim Reinigen der Formen sollten Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden, da nicht ausgehärtetes Harz hautreizend sein kann. SLA-Drucker verwenden UV-Licht, um das Harz auszuhärten, das für Augen und Haut schädlich sein kann. Stellen Sie sicher, dass die Druckkammer sicher geschlossen ist und vermeiden Sie es, direkt auf die UV-Lichtquelle zu blicken.

2. Ein Verfahren zur Verwendung von 3D-gedruckten Formen zur Herstellung von Agarose-Vertiefungen

  1. Herstellung von Agarose-Brunnen
    1. Stellen Sie Agarose-Vertiefungen her, indem Sie 2% (g/ml) Agarose in E3-Medien auflösen (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2*2H2O, 0,161 mM MgSO4*7H2O). Platzieren Sie eine Form in der Mitte einer Deckglas-Bodenschale, wobei der Pfeil nach unten in Richtung der Vertiefung zeigt (siehe Abbildung 2A,B). Pipettieren Sie 750 μl 2 % geschmolzene Agarose/E3 entlang der Hälfte des Umfangs der abbildenden Form (siehe Abbildung 2C).
      HINWEIS: Geschmolzene Agarose sollte nicht viskos, aber kühl genug sein, um sie zu pipettieren, ohne Blasen zu bilden. Wir verwenden 60-mm-Schalen mit einem 30-mm-Deckglasboden, während für Formen, die für aufrechte Mikroskope ausgelegt sind, eine Standard-60-mm-Schale verwendet werden kann. Für das Siebwerkzeug wird ein etwas anderes Protokoll verwendet (siehe unten).
    2. Pipettieren Sie weitere 750 μl 2 % geschmolzene Agarose/E3 entlang der anderen Hälfte des Umfangs der bildgebenden Form (siehe Abbildung 2D).
    3. Warten Sie 5-7 Minuten, bis sich die Agarose verfestigt hat, und beobachten Sie den Übergang von einer klaren Flüssigkeit zu einem undurchsichtigen blauen Gel (siehe Abbildung 2E).
    4. Fügen Sie eine dünne Schicht geschmolzener Agarose um den Umfang der erstarrten zentralen Agarose hinzu.
      HINWEIS: Obwohl dieser Schritt nicht unbedingt erforderlich ist, hilft er, die erstarrte Agarose an der Schale zu verankern und eine medieninduzierte Ablösung zu verhindern.
    5. Platzieren Sie den äußeren Ring (Ergänzende Abbildung S1B) über der Agarose-Formbaugruppe, wobei der Pfeil auf die Agarose zeigt (siehe Abbildung 2F).
    6. Während Sie den äußeren Ring leicht festhalten, ziehen Sie vorsichtig gerade nach oben, um ihn von der Agarose zu lösen (siehe Abbildung 2G).
      HINWEIS: Um ein Brechen oder Beschädigen der Agarose-Vertiefungen zu vermeiden, drücken Sie nicht zu stark auf den Außenring und verdrehen oder verschieben Sie die innere Form nicht, wenn Sie sie nach oben ziehen.
    7. Entfernen Sie den äußeren Ring, so dass die Agarose-Vertiefungen in der Deckglas-Bodenschale zum Vorschein kommen (Abbildung 2H).
    8. Untersuchen Sie die Agarose-Wells unter einem Mikroskop, um die korrekte Dimensionierung und Produktion zu bestätigen.
      HINWEIS: Für die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop muss häufig ein dünner Agarosefilm vom Boden der Vertiefung abgehoben werden. Dies kann mit einer Pinzette erfolgen.
  2. Modifiziertes Protokoll für die Verwendung des Siebwerkzeugs
    1. Gießen Sie geschmolzene 2 % Agarose/E3 in die Petrischale, bis sie etwa zur Hälfte gefüllt ist.
    2. Halten Sie die Form mit den Stiften nach oben und pipetieren Sie geschmolzene 2% Agarose/E3 auf die Stifte, bis sie bedeckt sind (~3 mL).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen, indem Sie nur 90 % der geschmolzenen Agarose freisetzen, die in die Pipette gezogen wurde.
    3. Setzen Sie mit einer Kippbewegung ein Ende und dann die gesamte Form mit den Stiften nach unten in die Petrischale mit geschmolzener Agarose (Ergänzende Abbildung S2).
    4. Die Agarose 5-7 min fest werden lassen.
    5. Entferne die Form vorsichtig, indem du mit dem Griff ein Ende und dann das andere Ende hochhebelst.

3. Aufsteigende Embryonen in Agarose-Vertiefungen mit und ohne Agarose bei niedriger Schmelztemperatur

  1. Dechorionieren und betäuben Sie die Embryonen in einer 200 μg/ml-Tricainlösung vor der Montage.
    HINWEIS: Eine ~400 μg/ml-Tricainlösung ist erforderlich, um den Herzschlag zu stoppen.
    1. Ohne Verwendung von Agarose bei niedriger Schmelztemperatur: Füllen Sie die Bildgebungsschale mit 1x E3 und Tricain (200 μg/ml), geben Sie dechorionierte anästhesierte Embryonen in die Bildgebungsschale, verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen in die Agarose-Vertiefungen zu platzieren und auszurichten, und nehmen Sie dann ein Bild ab (siehe Abbildung 2I, J).
      HINWEIS: Da eine Pinzette einen Embryo leicht beschädigen kann, kann stattdessen ein Embryo-Schürhaken verwendet werden, bei dem eine Angelschnur mit einem Durchmesser von 0,41 mm in ein Kapillarrohr oder eine Pipettenspitze eingeführt und mit Sekundenkleber gesichert wird24.
    2. Bei niedriger Schmelztemperatur Agarose:
      HINWEIS: Während die Formen so konzipiert sind, dass sie Embryonen in bestimmten Ausrichtungen platzieren, kann die Verwendung von Agarose bei niedriger Schmelztemperatur, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten, sicherstellen, dass die Embryonen während der Bildgebung oder beim Transport der Bildgebungsschale mit den montierten Embryonen zum Mikroskop nicht driften. Die folgenden Schritte sind von unserem vorherigen Protokoll6 abgeleitet.
      1. Stellen Sie Röhrchen aus Agarose bei niedriger Schmelztemperatur her, indem Sie 0,1-0,8 % Agarose bei niedriger Schmelztemperatur in 5 mL E3-Medium auflösen und in einem Wasserbad auf 65-70 °C erhitzen. Gelegentlich das Rohr umdrehen, bis sich die Agarose bei niedriger Schmelztemperatur aufgelöst hat. Aliquotieren Sie die Agaroselösung bei niedriger Schmelztemperatur in Mikrofugenröhrchen und legen Sie sie auf einen auf 42 °C eingestellten Heizblock. Lassen Sie die Lösung mindestens 1 h lang auf 42 °C äquilibrieren.
        HINWEIS: Es ist generell ratsam, eine frisch hergestellte Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur zu verwenden.
      2. Mit einer Pasteurpipette aus Glas mit breiter Bohrung wird ein einzelner Embryo in ein Röhrchen mit der Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur übertragen. Um zu vermeiden, dass der Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur überschüssige Flüssigkeit zugesetzt wird, übertragen Sie nur den Embryo und die unmittelbar umgebende Flüssigkeit. Übertragen Sie den Embryo, der sich jetzt in niedrigschmelzender Agarose befindet, sofort in eine der Agarose-Vertiefungen. Geben Sie die Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur zur Wiederverwendung in den Heizblock zurück.
      3. Positionieren Sie den Embryo mit einer Pinzette oder einem Embryoschürhaken (siehe Schritt 3.1.1) in der Vertiefung für die Bildgebung.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2.2 bis 3.1.2.3 für die anderen Vertiefungen. Wenn die vorherigen Vertiefungen auszutrocknen beginnen, verwenden Sie eine p200-Pipette, um eine kleine Menge E3 (~50-100 μl) auf die Vertiefung zu geben.
  2. Sobald die Embryonen in alle Vertiefungen eingelagert wurden und die Agarose bei niedriger Schmelztemperatur erstarrt ist, wird mit einer Pipette die Tricain/E3-Lösung langsam in die Bildgebungsschale gegeben.
  3. Entnehmen Sie die Embryonen nach der Bildgebung vorsichtig mit einer Pinzette aus den Vertiefungen und lassen Sie sie sich weiter entwickeln, um sicherzustellen, dass die Bildgebung keine Entwicklungsstörungen verursacht.
    HINWEIS: Die Agarose-Vertiefungen können aus der Bildgebungsschale entnommen werden, die gespült und wiederverwendet werden kann. Das Spülen mit handelsüblichem Glasreiniger und anschließend mehrmaliges Spülen mit ddH2O hilft, Salzablagerungen auf den Deckgläsern zu entfernen. Obwohl wir keine Toxizität aufgrund von Restspuren von Glasreiniger festgestellt haben, wird dem Forscher empfohlen, diese Ergebnisse unter eigenen Laborbedingungen zu bestätigen.

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Ergebnisse

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Das obige Protokoll wurde verwendet, um Formen für die Darstellung verschiedener Stadien der Herzentwicklung beim Zebrafisch zu entwerfen, einschließlich Herzfusion, Herzschlauchbildung, Herzschleife und Kammerbildung. Da die kardiale Entwicklung nicht entlang der großen anatomischen Achsen des Embryos stattfindet, wurde die Form der Stifte an die verschiedenen Entwicklungsstadien angepasst, um die Embryonen richtig zu positionieren. Zum Beispiel erfordert die vordere innere Platzierung des Zebrafischherzens 48 Stunden n...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll skizzieren wir eine Methode zum Entwerfen von 3D-gedruckten Formen, die Agarose-Vertiefungen erzeugen, die die Montage von Embryonen oder Geweben für bildgebende Untersuchungen erleichtern können. Diese Formen können für die Bildgebung mit aufrechten oder inversen Mikroskopen hergestellt werden, und die Agarose-Wells, die mit diesen kundenspezifischen Formen hergestellt werden, können für Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die von Immunfluoreszenzstudien an fixi...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Mitgliedern des Bloomekatz-Labors, insbesondere Sasmitha Singh und Allison Holmes, sowie dem GlyCORE-Bildgebungskern (unterstützt von P20GM130460), dem IDEA-Labor der University of Mississippi, Dr. Yiwei Han und dem Han-Labor sowie den Mitgliedern der Glykowissenschafts- und Entwicklungsbiologie-Gemeinschaften der University of Mississippi. Diese Arbeit wird von den NIH finanziell unterstützt (R15HD108782, P20GM130460).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SLA 3D DruckerElegooMARS 2 PRO
Agarose Apex Bioresearch; Genesee Scientific 20-102QDJede Marke kann ersetzt werden
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ CAD-Software (Computer Aid Design) - fortgeschritten
Axio-Zoom aufrechtes MikroskopZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Slicer Software
Deckglas Bodenschale (60 mm Schale mit 30 mm Bodenwell)CellvisD60-30-1.5N
F59 Myosin schwere Kette (alle schnellen Isoformen)DHSBF591:50 Verdünnung
FDM FilamenteBambuPLA Filamente
FDM-DruckerBambuBambu X1 Carbon FDM0,4 mm Extruderdüse
PinzetteFisher16-100-121Andere Marken sind wahrscheinlich geeignet Ziege
Anti-Maus Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 Verdünnung
ImarisAndor10.2Software
Inverses KonfokalmikroskopLeicaLeica SP8 X
Gold Biotechnologiebei niedriger SchmelztemperaturKatalognummer: A-204-25Andere Marken sind wahrscheinlich geeignet
PipettenpumpeBel-ArtF37898
Harz für SLA-DruckerElegooElegoo P05BB028Wasserauswaschbares Photopolymer Harz V2.0
Ricinus communis Agglutinin (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (Lektin-Kit)1:300 Verdünnung
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/ CAD-Software(Computer Aid Design) - grundlegende
Tricain-SoftwareWestern Chemical, Inc. ANADA #200-226
Weizenkeim-Agglutinin (WGA)Vector labs#RLK-2200 (Lektin-Kit)1:300 Verdünnung
Pasteur-Pipette aus Glas mit breiter Bohrung Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
Agarose

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

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