Hier stellen wir ein Protokoll für eine optimierte Blutentnahmetechnik bei murinen Probanden durch Venenpunktion im Gesicht mit einer Lanzette vor. Wir verwenden diese Technik zusammen mit der durchflusszytometrischen Beurteilung, um zelluläre Phänotypen von transgenen, kongenen und Reporterstämmen zu charakterisieren. Es eignet sich auch für die Serumzytokinanalyse und Diabetesstudien.
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Methodenartikel
Venenpunktion im Gesicht zur Blutentnahme von Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll für die murine Blutentnahme mittels Venenpunktion im Gesicht mit einer Lanzette vorgestellt, das eine schnelle, minimalinvasive und kostengünstige Alternative zu anderen gängigen Techniken wie der Schwanzvenen- und retroorbitalen Probenahme bietet. Diese Technik ist besonders vorteilhaft für Studien, die wiederholte Probenahmen erfordern, wie z. B. die Phänotypisierung von Mäusen, die Serumzytokinanalyse und die Diabetesforschung. Das Protokoll ist effizient, erfordert nur minimale Spezialausrüstung und eignet sich gut für die zelluläre Hochdurchsatzanalyse bei Mäusen. Unsere primäre Anwendung ist die Phänotypisierung von transgenen, kongenen und Reportermäusen mittels Durchflusszytometrie, hier demonstriert mit Antikörperfärbung und tdTomato-Reportermäusen. Das Papier beschreibt das gesamte Verfahren, von der Tiervorbereitung bis zur Probenanalyse. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Blutentnahme mit einer 3-mm-Lanzette, die Zelllyse, die Färbung und die durchflusszytometrische Profilerstellung. Die Venenpunktion im Gesicht erhöht die Effizienz der Entnahme und unterstützt gleichzeitig ethische Forschungspraktiken. Diese praktische und anpassungsfähige Methode eignet sich für eine Vielzahl von experimentellen Protokollen, die die Blutentnahme von Mäusen und die Zellanalyse umfassen.
Einleitung
Eine effiziente, reproduzierbare und minimal-invasive Blutentnahme ist für viele Studien an Mäusen unerlässlich, insbesondere für solche, die wiederholte Probenahmen erfordern. Dieses Protokoll bietet eine optimierte Methode zur Entnahme kleiner Blutmengen mittels Venenpunktion im Gesicht, gefolgt von der Lyse roter Blutkörperchen, der Färbung von Antikörpern und der durchflusszytometrischen Analyse. Dieser Workflow eignet sich gut für Anwendungen mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Minimierung der technischen Komplexität.
Viele Blutentnahmemethoden, wie retroorbitale Blutungen oder Schwanzvenenschnitte, können Verfahren erfordern, die Hitze, Anästhesie1 und verlängerte Behandlungszeiten beinhalten, was zu erheblichen Belastungen für das Tierführen kann 2. Im Gegensatz dazu bietet die Venenpunktion im Gesicht mit einer Lanzette eine einfache und schnelle Alternative, die ein ethisches und reproduzierbares Versuchsdesign unterstützt. Diese Methode wurde in früheren Studien als humane Alternative für die Blutentnahme in kleinen Mengen bei Mäusen validiert3.
Wir veranschaulichen diese Methode, indem wir Immunzellen von transgenen und Reportermäusen, einschließlich TdTomato-Reportermäusen und MD4-IgHEL-Mäusen, phänotypisieren. Letzteres erfordert eine Färbung mit Antikörpern gegen CD19 und IgMa, einen IgM-Allotyp.
Obwohl dieses Protokoll für die Erstellung von zellulären Blutprofilen entwickelt wurde, kann es leicht für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich der Serumzytokinanalyse, des spezifischen Antikörpernachweises oder der Glukosemessung, indem der Schritt der Lyse roter Blutkörperchen weggelassen wird. Insgesamt verbessert diese Technik die Datenqualität und die experimentelle Effizienz bei minimalem Leid der Tiere, was sie in verschiedenen Forschungsanwendungen vielseitig einsetzbar macht.
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Protokoll
Die Mäuse wurden am Dartmouth Hitchcock Medical College, einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung, in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung untergebracht und gemäß einem genehmigten Protokoll des Institutional Animal Care and Utilization Committee verwendet.
1. Sammeln von Materialien
- Bereiten Sie 5 ml-Kulturröhrchen vor, die jeweils 1,5 ml 1x Erythrozyten-Lysepuffer (10x Erythrozyten-Lyse) enthalten. Verwenden Sie eine Röhre pro Maus.
- Stellen Sie eine Schachtel mit 3 mm Lanzetten zusammen (eine Lanzette pro Maus).
- Sammeln Sie eine Schachtel Mullschwämme (ein Mullschwamm pro Maus).
- Sammeln Sie Transferpipetten und ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 1x HBSS mit 0,5 mM EDTA (ausreichend für bis zu 20 Mäuse).
HINWEIS: Dieser Puffer wird verwendet, um die Lysereaktion zu stoppen. Wenn der Puffer nur für die Phänotypisierung und nicht für die weitere nachgelagerte Analyse benötigt wird, können die meisten neutralen Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4 anstelle von HBSS verwendet werden. - Bringen Sie einen Eiskübel, zusätzlichen 1x Erythrozyten-Lysepuffer, zusätzliche 5-ml-Röhrchen und Transferpipetten mit.
2. Beschriftung von Maus und Röhre
- Beschriften Sie jede Käfigkarte und jede Maus mit einer Phänotyp-Kennung, die den Beschriftungen auf jedem Röhrchen entspricht, um besser unterscheiden zu können, welche Ergebnisse mit welcher Maus korrelieren. Zu den häufig verwendeten Identifikatoren gehören verschiedene Permanentmarkerfarben (z. B. rot, blau, grün, schwarz) auf den Schwänzen von Mäusen, die den Markierungen auf der Röhre entsprechen.
HINWEIS: Fügen Sie immer eine Steuermaus für die Phänotypisierung bei. Bei Reportermäusen ist auf eine negative Reporterkontrolle zu achten. Bei transgenen Mäusen ist eine Wildtyp-Maus als Kontrolle zu verwenden. - Ordnen Sie die beschrifteten Röhrchen in einem Gestell mit einem Eiskübel in der Nähe an, um die Röhrchen sofort nach der Blutentnahme aufzubewahren.
- Öffnen Sie alle Lanzetten, die für den Eingriff benötigt werden.
- Öffnen Sie alle Mullschwämme, die für den Eingriff benötigt werden.
3. Handhabung der Maus und Probenentnahme
- Fassen Sie die Maus mit der dominanten Hand am Schwanz und legen Sie sie auf ein Drahtgestell oder eine ebene Fläche.
- Verwenden Sie den nicht-dominanten Zeigefinger und Daumen, um die Maus zu bewegen, indem Sie vom Schwanz in Richtung Halsregion manövrieren.
- Verwenden Sie die restlichen Finger, um den Schwanz zu sichern, um die Bewegung der Maus zu minimieren.
- Benutze die dominante Hand, um eine geöffnete 3 mm Lanzette zu holen.
- Lokalisieren Sie den kleinen haarlosen Fleck direkt hinter dem Mund und ziehen Sie eine gerade Linie in Richtung Ohr. Stoppen Sie dort, wo sich die Linie mit dem äußeren Augenwinkel schneidet (Abbildung 1).
- Führen Sie die Lanzette an dieser Kreuzung ein, um eine ausreichende Blutversorgung zu gewährleisten.
- Verwenden Sie den flachen Seitenrand der Lanzette, um einen einzelnen Tropfen Blut zu sammeln.
- Geben Sie die gesamte Lanzette mit der Blutprobe in das markierte Röhrchen mit dem Erythrozyten-Lysepuffer.
- Rühren Sie das Röhrchen vorsichtig um, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe in den Puffer gemischt wird. Eine unvollständige Durchmischung kann zu Gerinnseln und schlechter Datenqualität führen.
- Mit einem Mullschwamm 5-10 s lang sanften Druck auf die Einstichstelle ausüben.
- Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein.
- Halten Sie ein Verhältnis von Blut-zu-Lysepuffer von mehr als 1:10 ein.
- Wiederholen Sie die Schritte in diesem Abschnitt für jede weitere Maus.
4. Lyse, Vorbereitung und Analyse der Probe
- Warten Sie 7-10 Minuten nach Beginn der Lyse und fügen Sie ca. 2 mL 1x HBSS mit 0,5 mM EDTA (oder einem anderen Medium) hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für 5 min. Bereiten Sie in dieser Zeit Antikörper-Cocktails vor.
- Entsorgen Sie den Überstand.
- Entfernen Sie die Lanzetten mit einer Pinzette aus den Röhrchen.
- Fügen Sie 30 μl eines Antikörpercocktails hinzu, der zur Identifizierung der gewünschten Zellpopulationen entwickelt wurde.
HINWEIS: Für den Phänotyp von MD4-IgHEL-Mäusen bestand unser Cocktail aus 1 ml HBSS, 25 μl IgMa PerCP cy-5.5 und 25 μl CD19 APC. - Resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen für 2-3 s und inkubieren Sie sie für 25-30 min bei 4 °C.
- Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und konfigurieren Sie die Flussdiagramme entsprechend den Anforderungen des Experiments.
HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, die Zellen nach der Färbung zu drehen, wenn das Ziel die Phänotypisierung ist. - Geben Sie 150-25 μl HBSS oder ein anderes Medium mit einer Transferpipette zu jeder Probe. Bei Bedarf kann DAPI in einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugegeben werden (verwenden Sie 10 μl DAPI-haltiges Medium).
- Wirbeln Sie jede Probe kurz vor der Aufnahme 2-3 s lang vortexen.
- Erfassen Sie Daten mit 8.000 bis 10.000 Ereignissen/s, mit dem Ziel von 100.000 Zellen, wenn die Lyse effektiv war.
- Analysieren Sie die erfassten Daten, die in Abbildung 2 und 3 dargestellt sind.
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Ergebnisse
Mittels Durchflusszytometrie zeigt Abbildung 2 lysiertes Blut von Wildtyp- (WT) und PF4-Cre-TdTomato-Reportermäusen, das unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls hergestellt wurde. Der erste Satz von Flussdiagrammen zeigt die seitliche Streuung (SSC), die die Zellengranularität widerspiegelt, und die Vorwärtsstreuung (FSC), die die Zellengröße angibt. Zelltrümmer und Blutplättchen werden in der Nähe des Ursprungs de...
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Diskussion
Dieses optimierte Protokoll zur Blutentnahme im Gesicht bietet eine effiziente und einfache Alternative zu anderen häufig verwendeten Methoden, wie z. B. Schwanzvenen- oder retroorbitale Blutungen. Obwohl das Protokoll einfach und unkompliziert ist, müssen einige kritische Schritte sorgfältig befolgt werden. Der wichtigste Schritt für die richtige Ausführung ist die korrekte Platzierung der Einstichstelle4. Wenn Sie auf die richtige Stelle auf der Wange abzielen, ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziert durch den National Institutes of Health Grant: R35 HL155458 (C.V.J.)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| APC-Antimaus-CD19-Antikörper | Biolegende | 152410 | CD19 APC |
| Zentrifuge 5810 R, ohne Rotor, 120 V, 50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | Zentrifuge |
| Dermacea-Gazeschwämme 8 lagige 5 x 5 cm | Covidien | 441211 | Guaze Ponges |
| Einweg-Graduierte Transferpipetten | Fisherbrand | 13-711-91 Uhr | Transferpipett |
| ErgoOne Einkanal-Pipette (200 & Mikro; L) | USA Scientific | 7100-2200 | Pipette |
| Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 m Lösung/pH 8,0) | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| FACSymphony A3 Zellanalysator | BD Biosciences | 660937 | Durchflusszytometer |
| Fisherbrand Analoger Vortex-Mixer | Fisherbrand | 02-215-414 | Vortex |
| Goldenrod Animal Lancet 3 mm steril 5 Tabletts zu je 200 | Goldrute | GR 3MM | Lancet 3 mm |
| Graefe Forceps | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 11051-10 | Pinzette |
| Hank' s Balanced Salt Solution, 1x ohne Kalzium und Magnesium | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cyanin5.5 Anti-Maus IgMa Antikörper | Biolegende | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| RBC-Lysepuffer (10x) | Biolegende | 420301 | RBC-Lysispuffer |
| Polystyrol-Reagenzgläser mit rundem Boden ohne Deckel | Fisherbrand | FB1496110 | Kulturröhren |
| Permanentmarker mit Sharpie, Meißelspitze | Sharpie | 38254PP | Sharpies |
| Getestet auf USP steriles Wasser | Corning | 25-055-CI | Zellkulturqualitäts-Wasser |
| TipOne Pipettenspitzen-Nachfüllungen (200 & micro; L Natürlich abgeschrägt) | USA Scientific | 1111-1730 | Pipettenspitzen |
Referenzen
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- Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
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- Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
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- Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
- Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).
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Nachdrucke und Genehmigungen
