Dreidimensionale Quantifizierung von Darmschleim mittels Whole-Mount Tissue Imaging

Summary

In dieser Studie wird eine 3D-Bildgebungsmethode vorgestellt, bei der das gesamte Darmgewebe und die Multiphotonenmikroskopie zur Quantifizierung des sezernierten Schleims verwendet werden, was eine präzise volumetrische Analyse und Visualisierung der Schleimdynamik als Reaktion auf Reize wie Carbamoylcholinchlorid ermöglicht.

Abstract

Schleim spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase, indem er die Verdauung erleichtert, eine Barriere gegen Mikroben bildet und die Immunreaktionen im Darm reguliert. Seine Sekretion wird durch verschiedene intrinsische und extrinsische Faktoren moduliert, einschließlich mikrobieller Infektionen und Entzündungen. Während traditionelle Methoden zur Schleimanalyse auf relativer Quantifizierung beruhen, wie z. B. die Messung der Schleimdicke in histologischen Schnitten, bieten diese Ansätze nur einen begrenzten Einblick in das tatsächliche Volumen und die räumliche Verteilung des sezernierten Schleims im Darmlumen. In dieser Arbeit stellen wir eine detaillierte Methodik zur absoluten, dreidimensionalen Quantifizierung von Schleim unter Verwendung von Ganzkörper-Darmgeweben und Multiphotonenmikroskopie vor. Dieses Protokoll umfasst die Präparation ligierter Darmschlingen, die Behandlung mit Carbamoylcholinchlorid als Stimulus für die Aktivierung von Becherzellen, die Gewebefixierung und die Färbung für die Bildgebung. Mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie nehmen wir Z-gestapelte Bilder der luminalen Oberfläche auf. Diese werden in der Imaris-Software verarbeitet, um das Volumen und die räumliche Verteilung des sezernierten Schleims zu quantifizieren. Wir zeigen, dass Carbamoylcholinchlorid die Schleimsekretion sowohl im Ileum- als auch im Dickdarmgewebe innerhalb von 30 Minuten robust induziert. Der sezernierte Schleim tritt sporadisch und diskontinuierlich im gesamten Lumen auf, was die Bedeutung der volumetrischen Analyse gegenüber herkömmlichen zweidimensionalen Ansätzen unterstreicht. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, absolute quantitative Daten zu erhalten und die Schleimverteilung in situ zu visualisieren, und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Darmschleimdynamik unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Introduction

Das Schleimhautmilieu des Magen-Darm-Trakts von Säugetieren ist hochdynamisch und begünstigt die Besiedlung einer vielfältigen mikrobiellen Gemeinschaft. Das Darmepithel besteht aus verschiedenen spezialisierten Zellen, die zusammenarbeiten, um Nährstoffe aufzunehmen, die Integrität der Barriere aufrechtzuerhalten und mit dem Immunsystem zu kommunizieren¹. Unter diesen speichern Becherzellen Muzingranulate und scheiden unter stationären Bedingungen Schleim in das Lumen aus. Dieser Schleim bildet eine kritische physikalische Barriere, die den direkten mikrobiellen Kontakt mit der Epithelschicht verhindert, Geweb....

Protocol

Alle Tierversuche werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Chang Gung Universität genehmigt. Die Tiereinrichtung der Chang Gung Universität ist von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert. In diesen Studien wurden keine Bedenken hinsichtlich der Tiergesundheit festgestellt.

1. Vorbereitung der Fixierungsbasis

1. Agarosepulver mit ddH₂O bis zu einer Konzentration von 4 % (w/v) in einem mikrowellengeeigneten Kolben mischen. 2-3 Minuten in der Mikrowelle erhitzen, bis es ohne winzige Blas....

Results

In dieser Methode quantifizierten wir das Volumen des Darmschleims aus gestapelten Bildern von Ganzgeweben, die mittels Multiphotonenmikroskopie aufgenommen wurden. Das Darmgewebe wurde mit fluoreszierendem Phalloidin und Weizenkeim-Agglutinin (WGA) gefärbt, um zelluläres F-Aktin bzw. Schleim sichtbar zu machen^15,16. Sowohl im ilealen als auch im Dickdarmgewebe, das mit PBS behandelt wurde, wurde WGA⁺-Schleim hauptsächlich in Becherzellen an der Epithe.......

Discussion

Hier stellen wir eine Methode zur dreidimensionalen Quantifizierung von Darmschleim mittels Ganzgewebefärbung, Multiphotonenmikroskopie und Analyse mit der Imaris-Software vor. Dieses Verfahren ermöglicht die Beobachtung der diskontinuierlichen Schleimverteilung im Darmlumen und ermöglicht eine absolute Messung des Schleimvolumens.

Eine diskontinuierliche Schleimverteilung nach Stimulation wurde auch in explantierten Gewebekultursystemen beobachtet

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-Methyl-2-Butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm Schüssel&nlffel;	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Carbamoylcholinchlorid ≥ 98 % (Titration), kristallin	SIGMA	SI-C4382-1G
Kupferdraht (neu)	TOP TECH WIRE & KABELINDUSTRIE	IW00125	Kupferdraht ohne Isolierschicht
Zange	Shineteh	ST-M110
Gaze, steril	GMTH	Mai 40
GraphPad Prism 8	GraphPad-Software
Heizkissen	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	OXFORD-INSTRUMENTE
Paraformaldehyd	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Phalloidin-Markierungssonden	Invitrogen	A12379
Schere	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Weizenkeim-Agglutinin-(WGA)-Konjugate	Biotium	29027
Zeiss 7MP mit einem W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III Wasserimmersionsobjektiv (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti Saphir-Femtosekundenlaser (ohne DeepSee-Modul) mit BP500 nm-550 nm und BP565 nm-610 nm Detektoren sowie 750 nm Laserwellenlänge			Bildgebungsplattform zur Erfassung von 3D-Stacks mit einer High-NA-Objektivlinse für Tiefengewebsbildgebung; Eine Anregungsquelle für die Mehrphotonenmikroskopie, die auf eine Wellenlänge von 750 nm eingestellt ist