Dreidimensionale Quantifizierung von Darmschleim mittels Whole-Mount Tissue Imaging

Summary

In dieser Studie wird eine 3D-Bildgebungsmethode vorgestellt, bei der das gesamte Darmgewebe und die Multiphotonenmikroskopie zur Quantifizierung des sezernierten Schleims verwendet werden, was eine präzise volumetrische Analyse und Visualisierung der Schleimdynamik als Reaktion auf Reize wie Carbamoylcholinchlorid ermöglicht.

Abstract

Schleim spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase, indem er die Verdauung erleichtert, eine Barriere gegen Mikroben bildet und die Immunreaktionen im Darm reguliert. Seine Sekretion wird durch verschiedene intrinsische und extrinsische Faktoren moduliert, einschließlich mikrobieller Infektionen und Entzündungen. Während traditionelle Methoden zur Schleimanalyse auf relativer Quantifizierung beruhen, wie z. B. die Messung der Schleimdicke in histologischen Schnitten, bieten diese Ansätze nur einen begrenzten Einblick in das tatsächliche Volumen und die räumliche Verteilung des sezernierten Schleims im Darmlumen. In dieser Arbeit stellen wir eine detaillierte Methodik zur absoluten, dreidimensionalen Quantifizierung von Schleim unter Verwendung von Ganzkörper-Darmgeweben und Multiphotonenmikroskopie vor. Dieses Protokoll umfasst die Präparation ligierter Darmschlingen, die Behandlung mit Carbamoylcholinchlorid als Stimulus für die Aktivierung von Becherzellen, die Gewebefixierung und die Färbung für die Bildgebung. Mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie nehmen wir Z-gestapelte Bilder der luminalen Oberfläche auf. Diese werden in der Imaris-Software verarbeitet, um das Volumen und die räumliche Verteilung des sezernierten Schleims zu quantifizieren. Wir zeigen, dass Carbamoylcholinchlorid die Schleimsekretion sowohl im Ileum- als auch im Dickdarmgewebe innerhalb von 30 Minuten robust induziert. Der sezernierte Schleim tritt sporadisch und diskontinuierlich im gesamten Lumen auf, was die Bedeutung der volumetrischen Analyse gegenüber herkömmlichen zweidimensionalen Ansätzen unterstreicht. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, absolute quantitative Daten zu erhalten und die Schleimverteilung in situ zu visualisieren, und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Darmschleimdynamik unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Introduction

Das Schleimhautmilieu des Magen-Darm-Trakts von Säugetieren ist hochdynamisch und begünstigt die Besiedlung einer vielfältigen mikrobiellen Gemeinschaft. Das Darmepithel besteht aus verschiedenen spezialisierten Zellen, die zusammenarbeiten, um Nährstoffe aufzunehmen, die Integrität der Barriere aufrechtzuerhalten und mit dem Immunsystem zu kommunizieren¹. Unter diesen speichern Becherzellen Muzingranulate und scheiden unter stationären Bedingungen Schleim in das Lumen aus. Dieser Schleim bildet eine kritische physikalische Barriere, die den direkten mikrobiellen Kontakt mit der Epithelschicht verhindert, Gewebeentzündungen moduliert und die Darmhomöostase aufrechterhält ^2,3. Eine Dysregulation der Schleimsekretion beeinträchtigt die Barrierefunktion und wurde mit Entzündungen und Tumorgenese in Verbindung gebracht 4,5,6,7.

Die Darmschleimsekretion kann durch intrinsische Faktoren wie den Neurotransmitter Acetylcholin und durch mikrobielle Bestandteile aus Kommensalen ausgelöst werden ^8,9. Angesichts der Komplexität des Darmmilieus sind viele Faktoren, die die Schleimsekretion von Becherzellen beeinflussen, noch unerforscht. Daher ist eine präzise Methode zur Quantifizierung des luminalen Schleims unerlässlich, um zu untersuchen, wie sich verschiedene Reize auf die Sekretionsdynamik auswirken. Traditionelle Ansätze beruhen hauptsächlich auf der relativen Quantifizierung: zum Beispiel die Messung der Schleimdicke mit Fluoreszenz- oder Holzkohlepartikeln in ex vivo Darmexplantatsystemen^10,11 oder die Beurteilung des Abstands zwischen luminalen Mikroben und dem Epithel in gefärbten Gewebeschnitten^12,13. Obwohl diese Methoden für relative Vergleiche geeignet sind, erfassen sie möglicherweise nicht die vollständige Verteilung oder dreidimensionale Struktur des sezernierten Schleims, insbesondere da der sekretierte Schleim das Epithel nicht immer gleichmäßig bedeckt.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur dreidimensionalen Visualisierung und absoluten Quantifizierung von luminalem Schleim anhand von ganzem Darmgewebe vor. Dieser Ansatz erfordert die Fixierung von frischem Gewebe mit einem geeigneten Fixiermittel, um die strukturelle Integrität und Morphologie zu erhalten, gefolgt von einer Fluoreszenzfärbung und Bildgebung mit einem konfokalen oder Multiphotonenmikroskop. Durch die direkte Verabreichung von Testmitteln in ligierte Darmschlingen von tief anästhesierten Mäusen, gefolgt von einer sofortigen Fixierung, bewahrt die Methode die native Schleimarchitektur und ermöglicht die Analyse der Sekretkinetik. Im Vergleich zu geschnittenen Geweben, bei denen die Bildgebungstiefe in erster Linie durch die Gewebedicke begrenzt ist, erreicht die Bildgebungstiefe von Whole-Mount-Geweben (ohne Delipidierung) etwa 200-300 μm, begrenzt durch Lichtstreuung und Gewebetrübung. Mit dieser Technik zeigen wir, dass Carbamoylcholinchlorid (CCh), ein Acetylcholinanalogon, dessen Rezeptoren auf Becherzellen^{exprimiert werden 14}, eine schnelle Schleimsekretion robust induziert. Bemerkenswert ist, dass der sekretierte Schleim sowohl eine durchgehende Schicht entlang des Epithels als auch diskontinuierliche Strukturen innerhalb des Lumens bildet, Merkmale, die in herkömmlichen Gewebeschnitten nur schwer zu erkennen sind. Dieses Protokoll bietet eine robuste Plattform, um die dreidimensionale Verteilung des Darmschleims zu quantifizieren und das schleimauslösende Potenzial verschiedener Stimuli zu vergleichen.

Protocol

Alle Tierversuche werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Chang Gung Universität genehmigt. Die Tiereinrichtung der Chang Gung Universität ist von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert. In diesen Studien wurden keine Bedenken hinsichtlich der Tiergesundheit festgestellt.

1. Vorbereitung der Fixierungsbasis

1. Agarosepulver mit ddH₂O bis zu einer Konzentration von 4 % (w/v) in einem mikrowellengeeigneten Kolben mischen. 2-3 Minuten in der Mikrowelle erhitzen, bis es ohne winzige Blasen zum Kochen kommt.
   HINWEIS: Die Lautstärke hängt von der Anzahl der Samples ab. ca. 10 mL für eine 6 cm Schale.
2. Lassen Sie die Agaroselösung in ~3 min auf ~60 °C abkühlen. Gießen Sie die Agarose vorsichtig in eine 6-cm-Schale, bis die Flüssigkeitshöhe die Hälfte der Schale erreicht (ca. 10 ml für eine 6-cm-Schale).
3. Die Form mit Deckel für 20-30 min in einen geschlossenen Bereich stellen, bis die Agarose vollständig fest geworden ist.

2. Vorbereitung des Fixiermaterials

1. Bereiten Sie neue Kupferdrähte vor und schneiden Sie sie in 5 mm Länge. Für jedes Stück Gewebe werden 6-8 Stück Draht benötigt.

3. Herstellung der CCh-Lösung

1. Kristallines CCh in sterilem PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 10 μM (200 μl für eine Darmschlingen) auflösen.

4. Vorbereitung von injizierbaren Anästhetika

1. Zur Herstellung der Stammlösung für die Anästhesie wird 2,2,2-Tribromethanol in 2-Methyl-2-butanol gelöst.
2. Die Stammlösung wird mit sterilem PBS verdünnt, so dass die endgültige Arbeitslösung 30 mg/ml 2,2,2-Tribromethanol und 3 % (v/v) 2-Methyl-2-butanol enthält.
3. ~1 min gründlich vortexen, bis kein Pellet mehr in Lösung verbleibt (maximale Menge: 8).
4. Lagern Sie die Stammlösung dunkel bei 4 °C, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Entsorgen Sie den Vorrat 1 Monat nach der Vorbereitung.
5. Vor der Anästhesie die Stammlösung in steriles PBS ziehen und gut mischen, um eine gleichmäßige Dispersion zu gewährleisten, wodurch eine Enddosis von 250 mg/kg pro Maus erreicht wird.
   ACHTUNG: 2,2,2-Tribromethanol ist neurotoxisch und 2-Methyl-2-butanol ist flüchtig und hat einen reizenden Geruch. Es sollte geeignete Schutzausrüstung verwendet werden. Sammeln Sie den Abfall zur Entsorgung in einem verschlossenen Behälter und befolgen Sie die Verfahren zur Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle der Institution.

5. Darminokulation mittels Schlingeninjektion

1. Betäuben Sie eine 6-8 Wochen alte Maus mit intraperitonealer Injektion von 200 μl 2,2,2-Tribromethanol (250 mg/kg pro Maus) und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um ihre Körpertemperatur zu halten.
2. Nachdem Sie die Hautoberfläche mit Alkohol sterilisiert haben, machen Sie mit einer Operationsschere einen Schnitt in den linken Unterbauch der Maus und legen Sie den Blinddarm unter Narkose frei.
3. Identifizieren Sie das Ileum oder den proximalen Dickdarm, legen Sie die Darmschlaufe auf eine sterile Gaze und sichern Sie beide Enden mit arteriellen Klemmen, so dass eine 3 cm lange geschlossene Schlaufe entsteht.
4. Spülen Sie das Organ auf der Gaze mit sterilem PBS ab.
5. Injizieren Sie steriles PBS- oder CCh-Reagenz in einem Volumen von nicht mehr als 200 μl unter Narkose in die ligierte Darmschlinge.

6. Gewebeentnahme, Fixierung und Färbung

1. Nach 30 Minuten Behandlung euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation und entnehmen Sie die Darmschlinge.
2. Halten Sie die Darmschlinge mit einer Pinzette fest und spülen Sie sie vorsichtig mit sterilem PBS aus.
3. Schneiden Sie die Darmschlinge vorsichtig in Längsrichtung auf und spülen Sie das Gewebe mit sterilem PBS aus.
4. Das Gewebe flach drücken und mit Kupferdrahtsegmenten in einer 6 cm großen Schale auf der Agarose verankern.
5. Fixieren Sie das Gewebe mit 10 mL 4%iger Paraformaldehydlösung für 12-24 h in der Schale.
6. Waschen Sie das Tuch mindestens 3x mit PBS, um restliches Paraformaldehyd zu entfernen.
7. Tauchen Sie das Gewebe 12-24 h lang in 10 ml Blockierungspuffer (PBS ergänzt mit 0,4 % Triton X-100 und 3 % Rinderserumalbumin [BSA]) bei 4 °C in die Schale.
8. Das Gewebe mit Weizenkeim-Agglutinin (WGA, 1:200) und Phalloidin (1:500) in Blockpuffer färben und bei 120 U/min bei 4 °C 12-24 h in der Schale schütteln.
   HINWEIS: Um den Farbstoffverbrauch zu minimieren, kann das Gewebe auf verfestigter Agarose in einer 3 cm großen Schale verankert werden, die zur Färbung in 2 ml Farbstoffpuffer getaucht ist.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd stellt eine Gefahr beim Einatmen dar. Bei der Handhabung, z. B. beim Betrieb in einem Abzug, sollte geeignete Schutzausrüstung verwendet werden. Sammeln Sie den Abfall zur Entsorgung in einem verschlossenen Behälter und befolgen Sie die Verfahren zur Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle der Institution.

7. Bilderfassung durch Multiphotonenmikroskopie

1. Waschen Sie den restlichen Färbepuffer mindestens 3x mit PBS aus.
2. Verankern Sie das Gewebe auf Agarose mit Kupferdrähten in einer 6 cm großen Schale in 10 mL PBS.
3. Erfassen Sie 100 optische Schnitte (mit einer Tiefe von 99 μm) von Darmgewebe und zugehörigem sezerniertem Schleim mit einem Multiphotonenmikroskop, das mit einer Objektivlinse mit hoher NA für die Bildgebung von tiefem Gewebe ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Anregungsquelle für die Multiphotonenmikroskopie, die auf eine Wellenlänge von 750 nm eingestellt ist. Sammeln Sie Emissionssignale mit den Bandpassfiltern BP500-550 nm und BP565-610 nm. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 8 ein.
   HINWEIS: Für die Multiphotonenmikroskopie beträgt die maximale Scangeschwindigkeit 9, wobei höhere Werte eine schnellere Erfassung anzeigen. Die Geschwindigkeitseinstellung hängt von der Kapazität des Mikroskops ab. Wenn Sie die Imaging-Plattform verwenden, die zur Erfassung von 3D-Stacks verwendet wird, empfehlen wir eine Scangeschwindigkeit von 8, um die Aufnahmezeit und die Bildqualität in Einklang zu bringen.

8. Bildanalyse und Schleimquantifizierung (Abbildung 1)

9. Statistische Auswertung

1. Analysieren und vergleichen Sie das Gesamtvolumen für jede Gruppe. Geben Sie den Wert des Schleimvolumens in Spalte ein und analysieren Sie es mit einem nichtparametrischen Mann-Whitney-Test.

Results

In dieser Methode quantifizierten wir das Volumen des Darmschleims aus gestapelten Bildern von Ganzgeweben, die mittels Multiphotonenmikroskopie aufgenommen wurden. Das Darmgewebe wurde mit fluoreszierendem Phalloidin und Weizenkeim-Agglutinin (WGA) gefärbt, um zelluläres F-Aktin bzw. Schleim sichtbar zu machen^15,16. Sowohl im ilealen als auch im Dickdarmgewebe, das mit PBS behandelt wurde, wurde WGA⁺-Schleim hauptsächlich in Becherzellen an der Epithe...

Discussion

Hier stellen wir eine Methode zur dreidimensionalen Quantifizierung von Darmschleim mittels Ganzgewebefärbung, Multiphotonenmikroskopie und Analyse mit der Imaris-Software vor. Dieses Verfahren ermöglicht die Beobachtung der diskontinuierlichen Schleimverteilung im Darmlumen und ermöglicht eine absolute Messung des Schleimvolumens.

Eine diskontinuierliche Schleimverteilung nach Stimulation wurde auch in explantierten Gewebekultursystemen beobachtet

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-Methyl-2-Butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm Schüssel&nlffel;	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Carbamoylcholinchlorid ≥ 98 % (Titration), kristallin	SIGMA	SI-C4382-1G
Kupferdraht (neu)	TOP TECH WIRE & KABELINDUSTRIE	IW00125	Kupferdraht ohne Isolierschicht
Zange	Shineteh	ST-M110
Gaze, steril	GMTH	Mai 40
GraphPad Prism 8	GraphPad-Software
Heizkissen	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	OXFORD-INSTRUMENTE
Paraformaldehyd	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Phalloidin-Markierungssonden	Invitrogen	A12379
Schere	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Weizenkeim-Agglutinin-(WGA)-Konjugate	Biotium	29027
Zeiss 7MP mit einem W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III Wasserimmersionsobjektiv (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti Saphir-Femtosekundenlaser (ohne DeepSee-Modul) mit BP500 nm-550 nm und BP565 nm-610 nm Detektoren sowie 750 nm Laserwellenlänge			Bildgebungsplattform zur Erfassung von 3D-Stacks mit einer High-NA-Objektivlinse für Tiefengewebsbildgebung; Eine Anregungsquelle für die Mehrphotonenmikroskopie, die auf eine Wellenlänge von 750 nm eingestellt ist