Methodenartikel

Herstellung stabiler monodisperser phospholipidbeschichteter Mikrobläschen bei Raumtemperatur mit Hilfe eines mikrofluidischen Strömungsfokussiergeräts

DOI:

10.3791/68796

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10. Oktober 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von monodispersen, mit Phospholipiden überzogenen Mikrobläschen unter Verwendung einer mikrofluidischen Strömungsfokussierungsvorrichtung bei Raumtemperatur, einschließlich der Herstellung der Phospholipid-Beschichtungsformulierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monodisperse Mikrobläschen haben ein erhebliches Potenzial zur Verbesserung der Wirksamkeit von Ultraschallkontrastmitteln sowohl für bildgebende als auch für therapeutische Anwendungen gezeigt. Diese Mikrobläschen können direkt mit einem mikrofluidischen Strömungsfokussierungsverfahren hergestellt werden, das eine präzise Kontrolle über ihre Größe ermöglicht. Die Verhinderung von Koaleszenz während der Produktion bleibt jedoch eine kritische Herausforderung. Während erhöhte Produktionstemperaturen (z. B. 55 °C) die Koaleszenz unterdrücken können, erschweren solche Bedingungen das Design mikrofluidischer Geräte und können mit Zielmitteln und Wirkstoffkonjugaten inkompatibel sein. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von monodispersen, mit Phospholipiden überzogenen Mikrobläschen bei Raumtemperatur, wobei die Stabilität und Monodispersität der Mikrobläschen für mindestens 7 Tage erhalten bleibt. Das Protokoll beschreibt auch die Herstellung von wiederverwendbaren mikrofluidischen PDMS-Chips und die Herstellung der Phospholipid-Beschichtungsformulierung, die das Tensid Pluronic F68 enthält. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die mit dieser Methode hergestellten Mikrobläschen ihre Größe und Stabilität über 7 Tage beibehalten, was ihre zukünftige Anwendbarkeit in klinischen Umgebungen unterstützt, in denen stabile und kontrollierbare Ultraschallkontrastmittel unerlässlich sind.

Einleitung

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Ultraschallkontrastmittel (UCA) werden häufig in der klinischen Echographie und in therapeutischen Anwendungen eingesetzt 1,2,3. Bei intravenöser Verabreichung bleiben diese Mikrobläschen im Gefäßsystem eingeschlossen und wirken als Blutpoolmittel 4,5. Eine stabilisierende Hülle umhüllt die Mikrobläschen und reduziert die durch den Laplace-Druck verursachte Gasdiffusion, wodurch die Lebensdauer der Mikroblase verlängertwird 3,6. Bei Ultraschalleinwirkung beginnen Mikrobläschen zu schwingen und erzeugen aufgrund der Kompressibilität des Gaskerns 7,8 starke Echos. Die Schwingung ist bei der Resonanzfrequenz der Mikroblase am ausgeprägtesten, die durch die Größe der Mikroblase und die Schaleneigenschaftenbeeinflusst wird 9,10,11. Klinisch zugelassene UCA bestehen in der Regel aus polydispersen Mikrobläschen mit einer breiten Größenverteilung, die typischerweise von etwa 0,5 bis 10 μm mit einem Durchmesservon 12,13,14 reicht. Diese breite Größenverteilung führt zu einem weiten Frequenzbereich, bei dem diese Mikrobläschen resonant sind. Angesichts der Tatsache, dass klinische Ultraschallsonden in der Regel in einer engen Frequenzbandbreite arbeiten, resoniert nur eine Teilmenge der UCA-Population effektiv15. Es hat sich gezeigt, dass monodisperse Mikrobläschen, die eine enge Größenverteilung aufweisen (z. B. PDI 3~10%16,17), die Diagnose und Therapie im Vergleich zu polydispersen Mikrobläschen verbessern. Bei der kontrastverstärkten Ultraschallbildgebung stieg die Intensität um zwei bis drei Größenordnungen18, während die Empfindlichkeit für die nichtinvasive Druckmessung durch subharmonische Signale fast verdoppelt wurde 19,20,21 und die Effizienz der Arzneimittelabgabe um fast eine Größenordnung erhöht wurde 22. Folglich ist die Herstellung monodisperser Mikrobläschen mit einer engen Größenverteilung und damit einer akustischen Reaktion der Schlüssel zur Maximierung ihres Potenzials für die Ultraschallbildgebung und therapeutische Anwendungen, bei denen kontrollierte Mikroblasenschwingungen entscheidend sind.

Monodisperse Mikrobläschen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, wie z. B. Dekantieren23, mechanisches Filtrieren24 und Zentrifugieren eines polydispersen Mikroblasenmittels25. Mit diesen Techniken ist es jedoch nach wie vor eine Herausforderung, eine präzise Größenkontrolle und eine hohe Monodispersität zu erreichen26. Ein alternativer und kontrollierterer Ansatz ist die direkte Herstellung von monodispersen Mikrobläschen mit Hilfe eines mikrofluidischen Strömungsfokussiergeräts. Bei diesem Verfahren wird ein Gasfaden zwischen zwei wässrigen Liposomenströmen auf einem mikrofluidischen Chip fokussiert, was zu einem reproduzierbaren Abklemmen des Gasfadens führt, was eine Hochgeschwindigkeitsproduktion von monodispersen Mikrobläschen in der gewünschten Größe27 ermöglicht. Obwohl strömungsfokussierende Verfahren zur Herstellung monodisperser Tröpfchen weit verbreitet sind28,29, ist ihre Anwendung bei der Herstellung monodisperser Mikroblasen aufgrund der Schwierigkeit, Koaleszenz zu verhindern und die Langzeitstabilität in Bezug auf Größe, Monodispersität und Konzentration ordnungsgemäß aufrechtzuerhalten30, weniger verbreitet. Die Koaleszenz, bei der mehrere Mikrobläschen zu größeren verschmelzen, wirkt sich auf die Monodispersität aus. Es hat sich gezeigt, dass erhöhte Produktionstemperaturen die Koaleszenz reduzieren31, aber dies erschwert das mikrofluidische Systemdesign und ist möglicherweise nicht für Formulierungen geeignet, die Zielmittel oder Wirkstoffkonjugate enthalten. Daher wäre es vorteilhaft, monodisperse Mikrobläschen bei Raumtemperatur herzustellen. Ebenso wichtig ist die Methode zur Lagerung dieser monodispersen Mikrobläschen, da mit Phospholipiden beschichtete Mikrobläschen dazu neigen, zu schrumpfen, zu kollabieren und ihre Monodispersität im Laufe der Zeit zu verlieren32. Die Gewährleistung einer Langzeitstabilität über mehrere Tage während der Lagerung ist entscheidend für die Umsetzung der monodispersen Mikroblasentechnologie in klinische Anwendungen.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Phospholipid-beschichteten monodispersen Mikrobläschen unter Verwendung einer strömungsfokussierenden mikrofluidischen Plattform bei Raumtemperatur. Diese Methode ist mit Lipidflussraten von 13-42 μl/min kompatibel und für den Einsatz bei Raumtemperatur ausgelegt, wodurch sie für Labore geeignet ist, die keine Temperaturkontrolle in ihrem mikrofluidischen System haben. Das Protokoll verwendet eine Phospholipidformulierung, die aus 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[carbonylmethoxypolyethylenglykol] (DPPE-PEG5000) und Pluronic F68 besteht, die Stabilität und Reproduzierbarkeit gewährleistet. Das Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Herstellung wiederverwendbarer mikrofluidischer PDMS-Chips, zur Vorbereitung der Phospholipid-Beschichtungslösungen und zur Einarbeitung des Tensids Pluronic F68, um die Koaleszenz von Mikroblasen während der Produktion bei Raumtemperatur zu verhindern. Es beschreibt auch die Verfahren zur Reinigung des mikrofluidischen Systems, um ein Verstopfen der Düse zu verhindern, zur Anpassung des Gasdrucks und der Flüssigkeitsdurchflussrate zur Kontrolle der Mikroblasengröße sowie zum Sammeln und Aufbewahren der produzierten Mikrobläschen für eine Langzeitstabilität. Diese Methode bietet einen praktischen Ansatz zur Erzeugung stabiler monodisperser Mikrobläschen mit präziser Größenkontrolle bei Raumtemperatur.

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Protokoll

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1. Herstellung von Lipidfilmen

HINWEIS: Das Lipidgemisch für die Herstellung monodisperser Mikrobläschen ist mit einer binären Mischung aus DSPC und DPPE-PEG5000 in einem molaren Verhältnis von 90:10 formuliert. DSPC wurde als Hauptlipid gewählt, da gezeigt wurde, dass es sowohl in polydispersen33,34 als auch in monodispersen Mikrobläschen31 eine überlegene Stabilität gegen Gasauflösung bietet. Es wird angenommen, dass diese erhöhte Stabilität auf die relativ hohe Übergangstemperatur der gel-flüssigen kristallinen Phase von 55 °C35 zurückzuführen ist, die höher ist als die anderer häufig verwendeter Lipide wie DPPC (~41 °C)35, wodurch eine steifere und undurchlässigere Lipidhülle bei Raumtemperatur36 entsteht. Hier wird ein Beispiel für die Herstellung einer 3 mL Phospholipid-Beschichtungslösung demonstriert. Um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 mg/ml zu erreichen, was einer typischen Konzentration für die Herstellung von monodispersen Mikrobläschen16,17 entspricht, sind 60 mg Phospholipide erforderlich. Die gewünschte Menge jeder Phospholipidkomponente ist in Tabelle 1 angegeben.

  1. Nehmen Sie das Phospholipidpulver aus dem -20 °C Gefrierschrank und lassen Sie es 1 h bei Raumtemperatur auftauen.
  2. Wiegen Sie das benötigte Lipidpulver in separaten 2-ml-Messkolben.
  3. Bereiten Sie 100 mL eines 90:10 V/V-Gemisches aus Chloroform:Methanol in einem Abzug vor, indem Sie 90 mL Chloroform mit einem 100 mL Glasmesszylinder messen und dann auf einen 250 mL Glaserlenmeyer übertragen. Messen Sie dann 10 mL Methanol mit dem 100 mL Glasmesszylinder ab und gießen Sie dieses in das 250 mL Glas Erlenmeyer, das bereits das Chloroform enthält. Verschließen Sie das Glas Erlenmeyer mit einem Glasstopfen und mischen Sie die beiden Lösungsmittel, indem Sie den Erlenmeyer vorsichtig schwenken, bis die Lösung klar geworden ist.
    ACHTUNG: Chloroform und Methanol sind giftige Chemikalien. Chloroform ist ein potenzielles Karzinogen und kann Atemwegs-, Haut- und Augenreizungen verursachen. Methanol ist leicht entzündlich, giftig, wenn es eingeatmet, verschluckt oder über die Haut aufgenommen wird, und kann bei Verschlucken zur Erblindung führen. Arbeiten Sie immer mit Chloroform/Methanol-Gemischen in einem gut belüfteten Abzug, um ein Einatmen von Dämpfen zu vermeiden. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit Methanol keine offenen Flammen oder Zündquellen vorhanden sind. Entsorgen Sie lösungsmittelhaltige Abfälle gemäß den Protokollen für gefährliche Abfälle der Institution.
  4. Um die in Schritt 1.2 gewogenen Lipidpulver vollständig aufzulösen, geben Sie ml des Chloroform/Methanol-Gemisches in jeden 2-ml-Messkolben und schließen Sie schnell den Glasdeckel, um eine Verdunstung zu verhindern.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Lipidpulver vollständig aufgelöst ist. Falls erforderlich, den Kolben vorsichtig schwenken, um die Auflösung zu erleichtern.
  5. Mischen Sie die gelösten Lipidlösungen in ein 30-ml-Glasfläschchen, indem Sie jede Lösung nacheinander gießen.
  6. Verdampfen Sie das Lösungsmittel unter einem stetigen Fluss von Argongas und drehen Sie das Fläschchen, um eine gleichmäßige Verteilung des Lipidfilms auf der Glasoberfläche zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die letzten Spuren des Lösungsmittels können mit Argongas allein schwer zu verdampfen sein. Lassen Sie das Fläschchen 2 Stunden lang im Abzug, damit es weiter trocknen kann. Ist kein Argongas verfügbar, so kann Stickstoffgas37 oder ein Vakuum-Rotationsverdampfer, der bei 6 °C31,38 (d. h. oberhalb der Phasenübergangstemperatur von DSPC von 55 °C35) betrieben wird, zum Verdampfen des Chloroform-/Methanollösungsmittels verwendet werden.
  7. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wird das Lipidgemisch einem Vakuum unterzogen, um verbleibende organische Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Verschließen Sie das Glasfläschchen mit einer Schicht Parafilm und stechen Sie mit einer Nadel mehrere Löcher, um den Luftstrom während des Vakuums zu ermöglichen.
    HINWEIS: Der Zweck der Verwendung von Parafilm besteht darin, zu verhindern, dass sich das Lipid während des Gefriertrocknungsprozesses aus dem Glasfläschchen verteilt.
  8. Stellen Sie die Fläschchen über Nacht unter Vakuum in einen Gefriertrockner, um alle organischen Lösungsmittelreste zu entfernen.
  9. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie den Lipidfilm bis zur Verwendung bei -20 °C.
    HINWEIS: In diesem Abschnitt oder an anderer Stelle im Protokoll wird kein Zentrifugationsschritt verwendet.

2. Herstellung von strömungsfokussierenden mikrofluidischen Chips

HINWEIS: Monodisperse Mikrobläschen werden mit einem strömungsfokussierenden Mikrofluidik-Chip erzeugt, wie in Abbildung 1A dargestellt. Ein Schema der mikrofluidischen Kanalgeometrie, einschließlich der Düsen- und Auslassabmessungen, ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Ein detailliertes Herstellungsprotokoll für die SU-8-basierte Photolithographie, die zur Herstellung dieser Formen verwendet wird, wurde zuvorbeschrieben 37 und kann als ergänzende Information zu diesem Protokoll gefunden werden. In den folgenden Schritten wird der Herstellungsprozess des PDMS-Chips skizziert.

  1. Mischen Sie die PDMS-Base (23 g) und das Härter (2,3 g) im Verhältnis 10:1, um insgesamt 25,5 g PDMS zu erhalten.
  2. Lege die Urform in eine Petrischale und gieße die PDMS-Mischung darüber.
  3. Entgasen Sie das Gemisch unter Vakuum (2~7 mbar) für 40 Minuten, um die eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
    HINWEIS: Bei größeren Volumina kann eine längere Entgasungszeit erforderlich sein, um eine vollständige Blasenentfernung zu gewährleisten.
  4. Stellen Sie die Form für 1 h auf eine 75 °C heiße Platte.
    HINWEIS: Bei größeren Volumina kann eine längere Aushärtungszeit erforderlich sein.
  5. Lassen Sie das PDMS auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig um das ausgehärtete PDMS herum und ziehen Sie es ab, um den Chip freizusetzen.
  6. Schneiden Sie den PDMS-Chip auf die gewünschte Größe zu und stanzen Sie die Ein-/Auslasslöcher mit einem 1 mm Stanzer.
  7. Reinigen Sie den PDMS-Chip mit Klebeband, um Staubpartikel zu entfernen.
  8. Reinigen Sie sowohl den PDMS-Chip als auch den Objektträger mit Isopropanol, gefolgt von entionisiertem Wasser.
  9. Verbinden Sie das PDMS mit dem Objektträger, indem Sie es 1 Minute lang bei 60 % Leistung (60 W) in einem Luftplasmareiniger behandeln.
  10. Legen Sie den gebondeten Chip für 3 min auf eine 95 °C heiße Platte, um die Verklebung zu verbessern.
  11. Lassen Sie den PDMS-Chip auf Raumtemperatur abkühlen. Der vollständig gefertigte Chip ist in Abbildung 1C dargestellt, und ein mikroskopisches Hellfeldbild der Düse ist in Abbildung 1D dargestellt.
  12. Legen Sie den gebondeten Chip für 5 Minuten bei 80 % Leistung (80 W) in den Plasmareiniger, um die Oberflächenhydrophilie des mikrofluidischen Kanals wiederherzustellen.
  13. Füllen Sie den Chip sofort mit Milli-Q Wasser, um die Hydrophilie zu erhalten.
  14. Lagern Sie die Chips bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in Milli-Q Wasser.

3. Herstellung der Phospholipid-Beschichtungslösung

  1. Den vorbereiteten Lipidfilm aus dem -20 °C Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur 1 h auftauen.
  2. Geben Sie 3 ml vorgewärmte (55 °C) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den Lipidfilm (60 mg), um eine endgültige Lipidkonzentration von 20 mg/ml zu erreichen. Stellen Sie die Fläschchen für 40 min in ein 55 °C heißes Wasserbad und wirbeln Sie sie alle 15 min bei mittlerer Geschwindigkeit (Stufe 3 von 5 am Vortex-Mischer).
    HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, die Lipidkomponenten in PBS vor der Beschallung in Schritt 3.5 vorzulösen und gleichmäßig zu dispergieren. Diese Temperatur ist die Phasenübergangstemperatur von DSPC39, die die partielle Solubilisierung fördert und die Lipidaggregation reduziert. Obwohl eine Beschallung in Schritt 3.6 erforderlich ist, um volle optische Klarheit zu erreichen, ermöglicht die vorläufige thermische Inkubation eine effizientere und reproduzierbare Beschallung, indem sie die Bildung großer Lipidaggregate minimiert und die Homogenität der Dispersion verbessert.
  3. Fügen Sie 0,43 ml Pluronic F68-Lösung zum Lipidgemisch hinzu, um eine molare Konzentration von 10 % zu erreichen, nämlich DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Danach sollte die Probe optisch Abbildung 2A ähneln, bei der es sich um eine trübe Lösung handelt.
    HINWEIS: Pluronic F68 ist ein Tensid, das verwendet wird, um die Koaleszenz während der Produktion monodisperser Mikrobläschenzu verhindern 16,40. In Abwesenheit von Pluronic F68 können monodisperse Mikrobläschen nicht unter Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Horizon-Mikrofluidikvorrichtung37und der in diesem Protokoll beschriebenen Lipidformulierunggebildet werden. In der Lipidformulierung wurde kein Propylenglykol verwendet, da berichtet wurde, dass diese Verbindung sowohl die Monodispersität als auch die Stabilität der resultierenden monodispersen Mikroblasensuspension beeinträchtigt38.
  4. Für die Herstellung von fluoreszenzmarkierten monodispersen Mikrobläschen wird in diesem Stadium ein Lipidfarbstoff, wie z. B. ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, in die Mischung eingearbeitet.
  5. Beschallen Sie das Lipidgemisch in einem Wasserbad bei 100 % Leistung für 20 min und halten Sie die Wassertemperatur bei 55 °C. Die Lipidlösung sollte nach 20 min Abbildung 2B ähneln, die eine weniger trübe Lösung als in Schritt 3.4 darstellt. Setzen Sie die Beschallung in 10-Minuten-Intervallen fort, bis die Lösung klar ist, wie in Abbildung 2C gezeigt.
    HINWEIS: Für die Lösung in Abbildung 2C waren 30 Minuten Ultraschall erforderlich, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Charakterisierung der Lipidlösung kann durch Messung der Liposomengröße erfolgen, z. B. mit Hilfe eines dynamischen Lichtstreuers.
  6. Lassen Sie die Lipidlösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie weiterverarbeiten.

4. Vorbereitung des Fläschchens zur Sammlung von Mikrobläschen

HINWEIS: Um eine langfristige Lagerung von monodispersen Mikrobläschen zu gewährleisten, wird ein gasdichtes medizinisches Fläschchen als Auffangfläschchen benötigt.

  1. Verschließen Sie ein medizinisches 5-ml-Glasfläschchen mit einem Gummistopfen und füllen Sie das Fläschchen mit C4F10 Gas. Crimpen Sie anschließend eine Aluminiumkappe um das Fläschchen, um die Gasdichtheit zu gewährleisten. Das Auffangfläschchen ist nun gebrauchsfertig.

5. Vorbereitung der mikrofluidischen Plattform

HINWEIS: Wie in 3A dargestellt, umfasst das System die mikrofluidische Horizon-Plattform37 (im Folgenden als "mikrofluidische Plattform" bezeichnet), einen Computer zur Steuerung, eine Hochgeschwindigkeitskamera zur Überwachung des Produktionsprozesses, eine externe Leuchtdiode (LED)-Lichtquelle zur Beleuchtung während der Hochgeschwindigkeitsbildgebung und einen Funktionswellenformgenerator zum Auslösen einer Hochgeschwindigkeitsbildgebung in bestimmten Intervallen während der Produktion. Vor Beginn der Mikroblasenproduktion muss das Gerät gereinigt werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung der Düse zu verringern. Das Reinigungsverfahren umfasst sowohl den Schlauch als auch den mikrofluidischen Chip.

  1. Verfahren zur Reinigung von Rohren
    1. Schalten Sie den Netzschalter der mikrofluidischen Plattform ein, der sich auf der rechten Seite befindet (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Der "Netzschalter" bezieht sich auf die Hauptstromsteuereinheit der Horizon-Plattform, die den internen Mikrocontroller, die Pumpen und die Sensoren des Systems aktiviert.
    2. Legen Sie ein mit 70 % Ethanol gefülltes 4-ml-Glasfläschchen in die linke Seite der P-Pumpenkammer der mikrofluidischen Plattform (Abbildung 3). Starten Sie den Flüssigkeitsfluss bei 100 μl/min, sodass der Flüssigkeitseinlassschlauch mit dem 70%igen Ethanol aus dem Fläschchen gespült wird. Stoppen Sie die Spülung, indem Sie den Flüssigkeitsfluss nach 5 Minuten stoppen.
      HINWEIS: P-Pumpe bezieht sich auf die druckgesteuerte Gasfördereinheit, die in das mikrofluidische System integriert ist. Dieser Schritt dient nur der Reinigung des Schlauchs; Der Schlauch sollte zu diesem Zeitpunkt nicht mit dem Mikrofluidik-Chip verbunden werden. Dieser Prozess entfernt ethanollöslichen Staub und Verunreinigungen aus dem Fluidiksystem.
    3. Ersetzen Sie die mit Ethanol gefüllte Durchstechflasche durch eine wassergefüllte Durchstechflasche von Milli-Q.
    4. Spülen Sie den Schlauch 5 Minuten lang mit Milli-Q Wasser bei 100 μl/min, um Ethanolreste aus dem System zu entfernen.
  2. Verfahren zur Chipreinigung
    1. Schalten Sie den internen LED-Lichtschalter der mikrofluidischen Plattform ein.
    2. Setzen Sie den PDMS-Chip in die Halterung ein.
    3. Positionieren Sie den Krümmer über dem Chip und sichern Sie ihn mit dem verstellbaren Rad.
    4. Befestigen Sie die Gas-, Flüssigkeits- und Auslassschläuche mit einer Pinzette am PDMS-Chip. Die Verbindungskonfiguration ist in Abbildung 3B dargestellt. Stellen Sie sicher, dass der Auslassschlauch zu einem Fläschchen führt, um die Abfalllösung aus dem Reinigungsprozess aufzufangen.
    5. Stellen Sie die Plattform so ein, dass die Düse des Chips im Sichtfeld des Objektivs positioniert wird.
    6. Reinigen Sie den Chip 5 Minuten lang mit Milli-Q Wasser bei einem Gasdruck von 1000 mbar und einem Flüssigkeitsdurchfluss von 100 μL/min. Starten Sie zuerst den Gasfluss, dann folgen Sie mit dem Flüssigkeitsfluss.
      HINWEIS: In diesem Schritt wird der mikrofluidische Chip vor der Düse gereinigt.
    7. Stoppen Sie den Flüssigkeitsfluss, gefolgt von dem Gasfluss.
    8. Schließen Sie den Gas- und den Auslassschlauch wieder an, wie in Abbildung 3C gezeigt.
    9. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit Milli-Q Wasser für weitere 5 Minuten bei einem Gasdruck von 1000 mbar und einem Flüssigkeitsdurchfluss von 50 μL/min. Starten Sie zuerst den Gasfluss, dann folgen Sie mit dem Flüssigkeitsfluss.
      HINWEIS: Dieser Aufbau reinigt den mikrofluidischen Chip hinter der Düse.
    10. Stoppen Sie den Flüssigkeitsfluss, gefolgt von dem Gasfluss. Der PDMS-Chip ist nun bereit für die Produktion von Mikroblasen.

6. Einrichtung der Hochgeschwindigkeitsbildgebung

HINWEIS: Um die Produktion von monodispersen Mikrobläschen zu überwachen und zu steuern, wird empfohlen, eine Hochgeschwindigkeitskamera in die mikrofluidische Plattform zu integrieren, da die Mikroblase mit einer Produktionsrate von mehr als 105 Mikrobläschen/s produziert wird. Die Hochgeschwindigkeitskamera ermöglicht die Messung der Größe und Produktionsrate der Mikroblase auf dem Chip sowie die Überwachung der Koaleszenz der Mikroblasen auf dem Chip.

  1. Montieren Sie eine LED-Lichtquelle über der Montageplattform (Abbildung 3A), um den Mikrofluidik-Chip während der Hochgeschwindigkeitsbildgebung zu beleuchten.
  2. Koppeln Sie die Hochgeschwindigkeitskamera an den seitlichen Bildgebungsanschluss der mikrofluidischen Plattform.
  3. Verwenden Sie einen externen Funktionswellenformgenerator, um Hochgeschwindigkeitsaufnahmen in 10-s-Intervallen für die gesamte Dauer der Mikroblasenproduktion auszulösen. Verbinden Sie den TTL-Trigger-Ausgang des Signalgenerators mit einem Standard-BNC-Kabel mit dem externen Trigger-Eingang der Hochgeschwindigkeitskamera, um eine synchronisierte Erfassung zu gewährleisten. Diese Überwachung ist erforderlich, um die Form des Gasfadens und die Größenstabilität der Mikrobläschen während der Produktion zu beurteilen.
    HINWEIS: Eine kontinuierliche Überwachung ist wichtig, da es während der Produktion zu Verstopfungen kommen kann. Darüber hinaus werden die Hochgeschwindigkeits-Bildsequenzen verwendet, um zeitaufgelöste On-Chip-Mikroblasengrößenverteilungen zu extrahieren. Dieses 10-s-Intervall kann je nach Benutzerwunsch angepasst werden."

7. Herstellung und Charakterisierung monodisperser Mikrobläschen

  1. Richten Sie das Auffangfläschchen vor Produktionsbeginn wie in Abbildung 4A gezeigt ein. Stechen Sie eine Nadel durch den Gummistopfen, um als Auffangnadel zu dienen, und eine andere Nadel durch den Stopfen als Belüftungsnadel, wobei sich die Spitze der Nadel in der Nähe des Bodens der Durchstechflasche befindet. Halten Sie das Auffangfläschchen während der Produktion mit einer Klemme umgedreht.
    HINWEIS: Die Belüftungsnadel sorgt für einen konstanten Druck im Inneren des Fläschchens während der Entnahme. Da C4F10 schwerer als Luft ist, tritt es nicht spontan aus dem Fläschchen aus.
  2. Laden Sie die vorbereitete Phospholipidlösung in die P-Pumpe der mikrofluidischen Plattform.
  3. Bewegen Sie den Düsenteil des Chips in das Sichtfeld des Objektivs.
    HINWEIS: Die mikrofluidische Plattform umfasst ein internes optisches Modul mit einstellbarem Zoom und Fokus sowie einen externen F-Mount-Koppler zum Anschließen einer Hochgeschwindigkeitskamera.
  4. Um die Produktion von Mikroblasen zu starten, stellen Sie den Gasdruck auf 800 mbar und den Flüssigkeitsdurchfluss auf 40 μL/min ein.
    HINWEIS: Die mikrofluidische Plattform integriert zwei durchflussgesteuerte Flüssigkeitskanäle, 1-5 μL/min auf der linken Seite und 1-100 μL/min auf der rechten Seite, sowie einen druckgesteuerten Gaskanal. In diesem Protokoll wurden der 1-100 μL/min Flüssigkeitskanal und der druckgesteuerte Gaskanal verwendet.
  5. Sobald die Flüssigkeit die Düse erreicht, klemmt sich der Gasfaden ab und setzt monodisperse Mikrobläschen durch den Auslass frei (Abbildung 4A).
  6. Stellen Sie die Highspeed-Aufnahme auf eine Bildrate von ≥ 200.000 fps ein und verwenden Sie Highspeed-Aufnahmen, um die Größe der erzeugten Mikrobläschen über die Imfindcircles-Funktion in MATLAB zu messen.
  7. Passen Sie den Gasdruck und den Flüssigkeitsdurchfluss an, um die Größe der Mikroblase zu steuern.
    HINWEIS: Nachdem Sie die Durchflussrate und/oder den Gasdruck angepasst haben, verwenden Sie das MATLAB-Skript, um die Größenverteilung auf dem Chip aus der Hochgeschwindigkeitsaufzeichnung darzustellen. Wenn die Größenverteilung mit einer Gaußschen Verteilung angepasst wird, können die mittlere μ und die Standardabweichung σ abgeleitet werden. Die μ stellt die On-Chip-Größe der produzierten monodispersen Mikrobläschen dar. In der Anfangsphase der Produktion kann es aufgrund von Milli-Q-Restwasser in den Schläuchen zu einer Mikroblasenkoaleszenz kommen, die die Lipidkonzentration verdünnt. Dieses Problem verschwindet in der Regel, sobald die unverdünnte Lipidlösung die Düse erreicht. Tabelle 2 fasst die resultierenden Mikroblasendurchmesser für mehrere angelegte Durchflussmengen bei einem konstanten Gasdruck von 800 mbar zusammen; Verschiedene Kombinationen von Gasdruck und Flüssigkeitsdurchfluss können ähnliche Mikroblasengrößen erzeugen, obwohl unterschiedliche Parameterkombinationen auch die Produktionsrate beeinflussen. Bei einem konstanten Gasdurchfluss ist bekannt, dass die Fördergeschwindigkeit positiv mit den Flüssigkeitsdurchflüssen41 korreliert. Die Mikroblasen-Produktionsrate in diesem Protokoll liegt in der Größenordnung von ~105 Mikrobläschen pro Sekunde, basierend auf einer Einzelbild-für-Bild-Analyse der Hochgeschwindigkeitsaufzeichnungen, was mit den zuvor berichteten Werten für ähnliche strömungsfokussierende Geometrienübereinstimmt 37.
  8. Sobald die gewünschte Mikroblasengröße erreicht ist, sammeln Sie die erzeugten Mikrobläschen, indem Sie den Auslassschlauch mit dem Auffangfläschchen verbinden.
  9. Stellen Sie während der Entnahme die Hochgeschwindigkeitsaufzeichnung so ein, dass sie alle 10 s ausgelöst wird, um den Produktionsprozess zu überwachen.
    HINWEIS: Das Intervall zwischen den Aufnahmen kann je nach Bedarf angepasst werden.
  10. Nachdem ausreichend Mikroblasensuspension gesammelt wurde, entfernen Sie sowohl die Beatmungsnadel als auch die Auffangnadel aus dem Auffangfläschchen.
  11. Stoppen Sie den Flüssigkeitsfluss, gefolgt von dem Gasfluss.
  12. Lagern Sie die gesammelten Mikrobläschen aufrecht bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass das Fläschchen nur minimal mechanisch bewegt wird.
    HINWEIS: Die Mikroblasenlösung besteht aus drei Schichten, wie in Abbildung 5A gezeigt: eine Schaumschicht, eine monodisperse Mikroblasenschicht und ein Überstand. Es ist am besten, die Schaumschicht im Fläschchen zu belassen, da frühere Studien berichteten, dass schaumassoziierte Blasen allmählich auf eine monodisperse Größe schrumpfen können16,38. Die mit diesem Protokoll hergestellten Mikrobläschen wurden keiner behördlichen Sicherheitsbewertung unterzogen. Die Bestandteile Lipide (DSPC, DPPE-PEG5000) und das Tensid (Pluronic F68) werden jedoch häufig in von der FDA zugelassenen injizierbaren Formulierungen verwendet und gelten als biokompatibel 42,43. Weitere präklinische Bewertungen sind erforderlich, um die Sicherheit für die medizinische Anwendung zu gewährleisten.
  13. 2 h nach der Produktion (d. h. 2 h nach der Produktion der monodispersen Mikrobläschen) charakterisieren Sie die endgültige Größe und Konzentration der Mikrobläschen mit einer Partikelcharakterisierungsmaschine.
    HINWEIS: Monodisperse Mikrobläschen, die durch die Strömungsfokussierungsmethode erzeugt werden, benötigen ca. 90 Minuten, um sich auf ihre endgültige Größe44 zu stabilisieren. Daher wird empfohlen, vor der Verwendung der Mikrobläschen mindestens 2 h Stabilisierung einzuplanen.
  14. Befestigen Sie eine 19-G-Nadel an einer ml-Spritze, die im Folgenden als "Extraktionsspritze" bezeichnet wird.
  15. Führen Sie eine separate 19-G-Nadel als Beatmungsnadel in das Mikroblasenfläschchen ein. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Nadel in der Nähe der Oberseite des Fläschchens bleibt, um den Lufteintritt zu ermöglichen und den Innendruck während der Extraktion der Mikroblase aufrechtzuerhalten.
  16. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig, um die Suspension zu homogenisieren. Die Suspension trennt sich in drei Schichten: eine obere Schaumschicht, eine mittlere Schicht mit monodispersen Mikrobläschen und eine untere wässrige Schicht.
  17. Führen Sie die Extraktionsspritze schnell ein und positionieren Sie die Nadelspitze vorsichtig in der Mitte der monodispersen Mikroblasenschicht, wobei Sie den Schaum und die untere wässrige Unterstandsschicht vermeiden. Entnehmen Sie das gewünschte Volumen der Mikroblasensuspension und nehmen Sie die Extraktionsspritze aus der Durchstechflasche. Wenn die Extraktion der Mikroblasen abgeschlossen ist, entfernen Sie die Beatmungsnadel.

8. Reinigungs- und Abschaltverfahren

HINWEIS: Nach der Herstellung von Mikroblasen müssen die mikrofluidische Plattform und der Chip gründlich gereinigt werden, um eine ordnungsgemäße Funktion zu gewährleisten und die Wiederverwendung des Chips zu ermöglichen. In den folgenden Schritten wird der Reinigungsprozess beschrieben.

  1. Für den Chip gehen Sie wie folgt vor:
    1. Ersetzen Sie das Lipidfläschchen durch ein Milli-Q Wasserfläschchen.
    2. Spülen Sie den mikrofluidischen Chip mit einem Gasdruck von 800 mbar und einem Flüssigkeitsdurchfluss von 40 μL/min für 5 min.
    3. Stoppen Sie zuerst den Flüssigkeitsfluss und dann den Gasfluss.
    4. Trennen Sie nur den Gaseinlassschlauch vom Mikrofluidik-Chip.
    5. Füllen Sie den mikrofluidischen Chip mit Milli-Q Wasser, um die Hydrophilie der inneren Oberflächen zu erhalten.
    6. Stoppen Sie den Flüssigkeitsfluss und trennen Sie alle verbleibenden Schläuche vom Chip.
    7. Lagern Sie den Chip in Milli-Q-Wasser, bis er für die zukünftige Verwendung benötigt wird.
  2. Für das mikrofluidische System gehen Sie wie folgt vor:
    1. Ersetzen Sie das Milli-Q Wasserfläschchen durch ein Fläschchen mit 70 % Ethanol in der mikrofluidischen Plattform.
    2. Spülen Sie den Flüssigkeitseinlassschlauch 5 Minuten lang mit 70 % Ethanol bei einer Durchflussrate von 100 μl/min, um Lipidrückstände zu entfernen.
    3. Ersetzen Sie das Ethanolfläschchen durch ein Milli-Q Wasserfläschchen in P-Pump1.
    4. Spülen Sie den Schlauch 5 Minuten lang mit Milli-Q Wasser bei 100 μl/min, um Ethanolreste aus dem System zu entfernen. Das System ist jetzt sauber.
    5. Schalten Sie die mikrofluidische Plattform und das Hochgeschwindigkeitskamerasystem ab.

9. Schritte zur Fehlerbehebung

  1. Verstopfung der Düse
    HINWEIS: Aufgrund der geringen Größe der Düse (5 μm) kann es während des Produktionsprozesses zu Verstopfungen kommen. Um die Verstopfung zu beseitigen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Stoppen Sie sofort den Flüssigkeitsfluss, gefolgt von dem Gasfluss.
    2. Schließen Sie den Schlauch wieder gemäß der in Abbildung 3B gezeigten Anordnung an.
    3. Ersetzen Sie die mit Phospholipiden gefüllte Durchstechflasche durch eine wassergefüllte Milli-Q-Durchstechflasche in P-Pump1.
    4. Legen Sie einen Gasdruck von 1000 mbar an und stellen Sie den Flüssigkeitsdurchfluss 5 Minuten lang auf 100 μL/min ein, um die Düse zu spülen.
      HINWEIS: In den meisten Fällen sind Verstopfungen nach einer 5-minütigen Spülung beseitigt. Wenn die Verstopfung jedoch weiterhin besteht, kann es erforderlich sein, den PDMS-Chip durch einen neuen zu ersetzen.
    5. Sobald die Verstopfung behoben ist, schließen Sie den Schlauch wieder an, wie in Abbildung 3C gezeigt.
    6. Spülen Sie den Chip erneut 5 Minuten lang mit Milli-Q-Wasser bei einem Gasdruck von 1000 mbar und einem Flüssigkeitsdurchfluss von 50 μl/min, um eine vollständige Freigabe zu gewährleisten.
    7. Ersetzen Sie das mit Wasser gefüllte Milli-Q Fläschchen durch das mit Phospholipiden gefüllte Fläschchen in P-Pump1 und setzen Sie die Produktion der Mikroblase fort.
      HINWEIS: Wenn während der Produktion weiterhin Verstopfungen auftreten, kann dies auf eine unzureichende Reinigung des Schlauchs oder des Mikrofluidik-Chips hinweisen. Trennen Sie in diesem Fall den Schlauch vom Chip und befolgen Sie das in Schritt 5 beschriebene Reinigungsverfahren. Kommt es nach einer gründlichen Reinigung des gesamten Systems weiterhin zu Verstopfungen, könnte dies auf einen Ausfall des internen Filters in der mikrofluidischen Plattform hindeuten. Wenn Sie den Filter durch einen neuen ersetzen, kann das Problem möglicherweise behoben werden.
  2. Verwenden Sie den mikrofluidischen Chip bei Bedarf wieder.
    HINWEIS: Wenn der Chip nicht ordnungsgemäß gelagert wird, kann er die Hydrophilie verlieren. In diesem Fall kann das Abklemmen des Gasfadens dem in Abbildung 5E gezeigten Muster ähneln. In solchen Fällen empfiehlt es sich, auf einen neuen Chip umzusteigen, der hydrophil ist, um eine konsistente und zuverlässige Mikroblasenproduktion zu gewährleisten.

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Ergebnisse

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In diesem Protokoll stellen wir ein Verfahren zur Herstellung stabiler, monodisperser Mikrobläschen bei Raumtemperatur mit Hilfe eines strömungsfokussierenden Mikrofluidik-Chips vor. Der PDMS-Chip wird durch Gießen aus einer Urform hergestellt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Um den PDMS-Chip mit einem Glasobjektträger zu verbinden, wird eine Plasmabehandlung eingesetzt. Die Plasmabehandlung ist von entscheidender Bedeutung, da sie die PDMS-Oberfläche von hydrophob zu hydrophil verändert. Di...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie stabile monodisperse Mikrobläschen bei Raumtemperatur mit Hilfe eines mikrofluidischen Strömungsfokussierungschips hergestellt und gelagert werden. Die monodisperse Mikroblase kann sowohl in vitro als auch in vivo für die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung18, die nicht-invasive Druckmessung19 und die Mikroblasen-vermittelte Wirkstoffabgabe22 verwend...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde zum Teil vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement 805308) und zum Teil vom Applied and Engineering Sciences TTW (VIDI-Projekt 17543), Teil der NWO, finanziert, die beide an K.K. vergeben wurden. Die Horizon Microfluidic Platform wurde mit Mitteln aus EPSRC-Zuschüssen (Fördernummern EP/I000623 und EP/K023845) entwickelt. Die Autoren danken dem Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) an der University of Leeds für die nützlichen Diskussionen sowie Stuart Weston und Andrew Price für ihre Hilfe bei der Konzeption des Instruments und der Produktion von Teilen für die Horizon Microfluidic Platform. Die Urform für die Herstellung der PDMS-Chips wurde freundlicherweise von der University of Leeds zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Robert Beurskens von der Biomedizinischen Technik, Abteilung für Kardiologie, und Geert Springeling von der Abteilung für Experimentelle Medizinische Instrumentierung, beide vom Erasmus MC, Niederlande, für die technische Unterstützung während der Experimente.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mm Biopsie-Stanze Kai Medizin143831
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanin (DiD)Thermo Fisher WissenschaftlichNr. D307ein lipophiler Carbocyanin-Farbstoff
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[carbonylmethoxypolyethylenglykol] (DPPE-PEG5000)LipoidCAS-Nr. 384835-61-4
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC)LipoidCAS-Nr. 816-94-4
100 mL GlasmesszylinderBLAUBRAND
2 mL volumetrische GlaskolbenBLAUBRAND
250 mL Glas ErlenmeyerBLAUBRAND
30 mL Glasfläschchen  DWK LebenswissenschaftenSCERC40752700D0C2
70% Ethanol
75 °C; C Heizplatte 
Klebeband
Aluminium-Kappe Sigma-aldrich27016
Argongas  Linde Gas Benelux
C4F10 GasF2 Chemikalien
ChloroformMerck KGaA67-66-3
Klinisch verfügbar  Ultraschall-Kontrastmittel (d.h. Mikroblase)Bracco,
Plan-LesOuates, Schweiz		SonoVueAbbildung 6A.
Entnahme und Belüftung 19G Nadel100 Sterican4657799
Scharzähler Multisizer 3Beckman CoulterMaschine zur Charakterisierung von Partikeln
Maßgeschneidertes Ultraschallkontrastmittel (z. B. monodisperse Mikroblase)NAF1-10PFAbbildung 6A. Produziert wie beschrieben von: Wang, Y. et al. Einfluss von pluronischem F68 auf die Größenstabilität und das akustische Verhalten von monodispersen phospholipidbeschichteten Mikrobläschen, die bei Raumtemperatur hergestellt werden. ACS Appl. Mater. Schnittstellen 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Maßgeschneidertes Ultraschallkontrastmittel (z. B. monodisperse Mikroblase)NAF2-10 PFAbbildung 6A. Produziert wie beschrieben von: Wang, Y. et al. Einfluss von pluronischem F68 auf die Größenstabilität und das akustische Verhalten von monodispersen phospholipidbeschichteten Mikrobläschen, die bei Raumtemperatur hergestellt werden. ACS Appl. Mater. Schnittstellen 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Demi-Wasser
Externes LED-LichtGSVITECGS02370
GefriertrocknerMertin Christ GmbHAlpha 1– 2 Farbtöne plus
Funktion Wellenform-Generator Agilent33220A
Gasdichtes GlasfläschchenSigma-aldrichZ113964-288EA
Glas-RutscheVWR631-1552
Hochgeschwindigkeits-KameraPhotronNova S16
Mikrofluidik-Plattform HorizonUniversität Leeds, EnglandDie Plattform ist kommerziell verfügbar und ausführlich beschrieben in: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Überprüfung der wissenschaftlichen Instrumente. 92 (7), 074105 (2021).
Matlab (Englisch)Die MathWorksR2023a
MethanolMerck KGaA67-56-1
Milli-Q Wasser
PDMS-GelSYLGARDSYLGARD®   184
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS 1x)Gibco10010023
Plasma-ReinigerHenniker ScientificHPT-100
Pluronisch F68Thermo Fisher Scientific24040032
Gummi-StopfenSigmaZ166065-100EA
VerrohrungMasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16" AD; 25 Fuß
Pinzette
Vortex Sigma-aldrichZ654779
Wasserbad-UltraschallgerätEMAGEMMI 30HC

Referenzen

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