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Methodenartikel

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

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DOI:

10.3791/68797

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17. Oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Zusammenfassung

Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine Neubildung unreifer lymphatischer Vorläuferzellen und eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen im Kindesalter. Obwohl die Heilungsraten bei pädiatrischen ALL bei 90 % liegen, bleiben Rückfälle und Arzneimittelresistenzen Herausforderungen. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Krebsbiologie in vivo unerlässlich, und patienteneigene Xenotransplantate (PDX) unter Verwendung von Mausmodellen werden zu diesem Zweck häufig eingesetzt. PDXs aus rezidivierten Proben - oder im Vergleich zu diagnostischen Proben - beurteilen jedoch nicht vollständig die Mechanismen hinter der Schubinitiierung und -progression. Dieses Protokoll beruht auf der Erzeugung von B-ALL-PDX-Rückfällen bei Mäusen, was die Entnahme von leukämischen Zellen während des gesamten Prozesses des Erwerbs von Arzneimittelresistenzen ermöglicht. Tiere, die mit B-ALL-PDX-Zellen transplantiert wurden, werden mit einer Kombination von vier Medikamenten behandelt, die üblicherweise in der ALL-Therapie eingesetzt werden und unterschiedliche Wirkmechanismen darstellen: Dexamethason, Vincristin, L-Asparaginase und Daunorubicin. Nach einer 4-wöchigen Remissionsinduktionsphase werden die Tiere während einer Ruhephase auf Rückfälle überwacht. Der Zyklus von Behandlung und Rückfall wird so lange wiederholt, bis sich die Zeit bis zum Rückfall verkürzt, was als Surrogat für eine erhöhte In-vivo-Arzneimittelresistenz dient. Um die Mechanismen zu untersuchen, die dem Rückfall und der Resistenz zugrunde liegen, werden Leukämiezellen vor und nach jedem Behandlungszyklus für phänotypische und genetische Analysen gesammelt. Um das Modell zu validieren, wurden verschiedene pädiatrische ALL-Proben getestet, darunter sowohl gute als auch schlechte Responder, die anhand des Vorhandenseins von Blasten im peripheren Blut nach 7-tägiger Kortikosteroidtherapie und anhand der minimalen Resterkrankung (MRD) an den Tagen 15, 33 und 78/96 beurteilt wurden. Die an Mäusen beobachteten Ergebnisse stimmten mit den Patientendaten überein und bestätigten die Genauigkeit des Modells bei der Nachahmung des klinischen Ansprechens auf eine Chemotherapie. Dieser Ansatz ermöglicht die dynamische Untersuchung von Rezidiven und Arzneimittelresistenzen bei B-ALL und unterstützt mechanistische Untersuchungen und die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien.

Einleitung

Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern. Trotz der hohen Heilungsraten, die in den letzten Jahrzehnten erreicht wurden, mit einem 5-Jahres-Gesamtüberleben von 90 % in Ländern mit hohem Einkommen1 und großen Anstrengungen bei der Suche nach neuen therapeutischen Strategien, erleiden in den Industrieländern 15 % bis 20 % der Patienten einen Rückfall der Krankheit, wobei die Überlebensrate zwischen 30 % und 60 % schwankt, je nachdem, ob der erste Rückfall früh (unter 18 Monaten) oder später (36 Monate) nach der Diagnose auftritt2. 3. Urheberrecht Vor diesem Hintergrund bleiben Refraktär- und Rezidiv-ALLE Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt. In Bezug auf die Diagnose unterscheidet sich die refraktäre ALL vom Rezidiv durch die geringe Empfindlichkeit gegenüber der Chemotherapie, während die rezidiväre ALL durch das Wiederauftreten der Krankheit nach einer Remissionsphase gekennzeichnet ist. Wie andere Krebsarten ist auch die ALL durch genetische Anomalien gekennzeichnet, darunter Aneuploidien, chromosomale Umlagerungen und verschiedene Genmutationen, die mit unterschiedlichen therapeutischen Reaktionen und einem Rückfallrisiko verbunden sind4. Da ALL-Schübe häufiger bei Hochrisikopatienten auftreten – die bereits eine Chemotherapie mit maximaler Intensität erhalten haben – dürften weitere Anpassungen der Medikamentendosen oder -kombinationen nicht ausreichend sein. Stattdessen müssen die Bemühungen darauf gerichtet werden, die Mechanismen zu identifizieren, die der Arzneimittelresistenz und dem Rückfall zugrunde liegen.

Vor diesem Hintergrund haben Forscher versucht zu verstehen, wie der Selektionsdruck, den die Chemotherapie ausübt, zur Entstehung resistenter Zellen beiträgt. Der größte Teil der vorhandenen Literatur führt den Rückfall auf die Vermehrung eines resistenten malignen Subklons zurück, der zum Zeitpunkt der Diagnose bereits vorhanden war5. Eine kürzlich durchgeführte Studie deutet jedoch auf die Existenz alternativer Mechanismen hin, wie z. B. epigenetischer Modifikationen, die Transkriptionsprogramme regulieren und ebenfalls zum Rückfall beitragen können6.

Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um genaue In-vivo-Modelle zur Untersuchung ALLER Rückfälle zu erstellen. Immundefiziente Mäuse wurden erfolgreich für die ALL-Transplantation eingesetzt, wobei die ursprünglichen Krankheitsmerkmale erhalten blieben 7,8, was zur Entwicklung von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs) führte. Dieses Modell ermöglicht die Transplantation und Proliferation von ursprünglichen Tumor-/Leukämiezellen in einer kompatiblen Mikroumgebung. Einer seiner Hauptvorteile ist die Möglichkeit, das Ansprechen transplantierter ALL-Zellen auf eine Chemotherapie zu beurteilen9.

PDX-Modelle wurden auch eingesetzt, um ALLE Rückfälle nachzuahmen und zu untersuchen. Zum Beispiel verwendete ein von Samuels et al.10 entwickeltes Protokoll nicht-adipöse diabetische/schwere kombinierte immundefiziente (NOD/SCID) Mäuse, die mit Leukämiezellen von Patienten transplantiert wurden, um Resistenzmechanismen gegen ein induktionsähnliches Chemotherapieschema zu untersuchen. Die Autoren beschrieben die Behandlung mit Vincristin, Dexamethason, L-Asparaginase und Daunorubicin (VXLD) und gaben Beispiele für die Anzahl der Behandlungszyklen und den Zeitpunkt des Rückfalls. Das Modell konzentrierte sich jedoch auf die Analyse von Zellen unmittelbar nach der Behandlung - diejenigen, die die Ersttherapie überlebten - was wahrscheinlich eher eine minimale Resterkrankung (MRD) als einen Rückfall darstellt.

In einer neueren Studie wurde untersucht, ob eine kurzfristige Behandlung von ALL-transplantiertem NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma oder NSG) immundefiziente Mäuse konnten bei entsprechenden Patienten ein Rezidiv vorhersagen11. ALL-Proben mit mittlerem Risiko - sowohl von schubförmigen als auch von nicht schubförmigen Patienten - wurden in Mäuse transplantiert und mit einem induktionsähnlichen Schema behandelt, das aus Vincristin, Dexamethason und L-Asparaginase (VXL) bestand. Die Zeit bis zur Transplantation und die Rückfälle nach der Behandlung wurden gemessen und verglichen. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass dieses PDX-Modell als prognostisches Instrument zur Vorhersage von Patientenergebnissen dienen könnte. Diese Erkenntnis unterstützt die Nützlichkeit von PDX-Mausmodellen bei der Untersuchung der Biologie aller Schübe. Zum Beispiel hätten schubförmige Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden können, um die Mechanismen aufzudecken, die dem Rückfall zugrunde liegen.

In diesem Manuskript stellen wir Verbesserungen des PDX-Mausmodells zur Untersuchung des B-ALL-Rezidivs vor. Unser Ziel ist es, das Wiederauftreten der Krankheit und die Eigenschaften rezidivierter Zellen nach ihrer Formgebung durch Induktionschemotherapie zu untersuchen. Ein induktionsähnliches Regime mit vier Wirkstoffen - Vincristin, Dexamethason, L-Asparaginase und Daunorubicin - wurde unter Verwendung des NSG-Mäusestamms standardisiert. Es ist bekannt, dass dieser Stamm aufgrund der Prkdc-Scid-Mutation und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress Einschränkungen bei der Beständigkeit gegen wiederholte Chemotherapiezyklen aufweist12. Daher wurde das Körpergewicht der Tiere als Marker für die Toxizität der Behandlung überwacht. Das B-ALL-Rezidivmodell kann in drei Hauptschritte unterteilt werden: (1) Transplantation von ALL-Zellen in Mäuse mit dem Ziel einer Transplantationsschwelle von 0,2-1% humanen CD45⁺-Zellen im peripheren Blut; (2) 4 Wochen Chemotherapie, gefolgt von einer Ruhephase bis zum ersten Rückfall (Beleg1); und (3) nach Nachweis von R1 wiederholte 1-wöchige Induktionsbehandlungszyklen. Nachfolgende Schübe (R2, R3... RN) auftreten kann und das Intervall zwischen Behandlung und Rückfall (Δt) aufgezeichnet wird. Eine fortschreitende Verkürzung von Δt wird als Hinweis auf eine erworbene Arzneimittelresistenz interpretiert. Im Rahmen eingehenderer Untersuchungen der Mechanismen des Rückfalls können B-ALL-Zellen vor und nach verschiedenen Stadien des Protokolls entnommen werden. Es ist wichtig zu betonen, dass abhängig von der Zeit zwischen dem Auftreten eines Rückfalls und der Zellregeneration die inhärenten Mechanismen dieses Phänomens möglicherweise nicht konserviert werden. Vor diesem Hintergrund ist es äußerst wichtig, dass die Schubzellen nach der Schubbestätigung schnell entnommen werden. Die gesammelten Zellen können für zukünftige phänotypische und genetische Analysen verwendet werden, einschließlich der Bewertung der Zellzyklusdynamik, der Zellmigration, der Leukämie-auslösenden Zellfrequenz, chromosomaler Veränderungen und epigenetischer Modifikationen, um nur einige zu nennen.

Für die Zwecke dieses Artikels konzentrieren wir uns auf die Beschreibung des Schubmausmodells. Detaillierte Informationen werden für die drei experimentellen Phasen - Transplantation, Behandlung bis zum ersten Rückfall (R1) und zyklische Behandlung bis zu mehreren Rückfällen (R2, R3...) - bereitgestellt. Wir hoffen, dass dieses Modell es Forschern ermöglichen wird, Chemotherapie-resistente B-ALL-Zellen aus verschiedenen Subtypen zu erzeugen, was eine tiefere Untersuchung der zellulären und molekularen Veränderungen im Zusammenhang mit einem Rückfall ermöglicht. Letztlich kann dies zu einem besseren Verständnis von Resistenzmechanismen beitragen und die Entwicklung effektiverer und personalisierter Therapien erleichtern.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Vorschriften und ethischen Richtlinien der Comissão de Ética no Uso de Animais des Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Leukämieproben wurden aus Biobank-Fläschchen von Patienten gewonnen, die im Centro Infantil Boldrini behandelt wurden und die Verwendung ihrer Zellen durch eine Einverständniserklärung erlaubten. Das Projekt wurde von der Institutionellen Ethikkommission (CAAE 34601120.7.0000.5376) genehmigt.

1. Überwachung der Transplantation von Leukämiezellen und der Transplantation

  1. Aufbereitung von Leukämieproben für die Transplantation von Mäusen
    1. Tauen Sie zuvor kryokonservierte Proben von ALL-Zellen auf, die aus dem Knochenmarkaspirat des Patienten entnommen wurden. Verwenden Sie ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 °C. Tauen Sie die Proben auf, indem Sie das Kryoröhrchen in kreisenden Bewegungen bewegen.
    2. Übertragen Sie die aufgetaute Probe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 14 ml 1x steriles PBS zur Probe, um die Zellen zu waschen und die Kryokonservierungslösung zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand.
  2. Herstellung der Transplantationslösung
    1. Resuspendieren Sie die aufgetauten Zellen in sterilem 1x PBS. Für jedes zu transplantierende Tier werden 5-10 x 106 lebensfähige Zellen in einem Volumen von 100 μl PBS verwendet. Bewahren Sie die Transplantationslösung bis zur Transplantation auf Eis auf.
      HINWEIS: Die Zellen wurden nach der halbautomatischen Methode13 gezählt.
  3. Transplantation von Mäusen
    1. Wählen Sie ein 2 Monate altes männliches oder weibliches NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse für die Leukämietransplantation.
      HINWEIS: Um ein homogenes Versuchsdesign ohne Geschlechtsinterferenzen bei Tieren zu erhalten, wurden die ALL-Proben in beide Geschlechter der Maus transplantiert, um sicherzustellen, dass alle guten und schlechten Leukämien bei beiden Geschlechtern gleich vertreten waren. Als Ergebnis fanden wir heraus, dass weibliche Mäuse früher transplantieren als männliche Mäuse. In Anbetracht der Tatsache, dass zur Vermeidung einer möglichen Interferenz des Mausgeschlechts in zukünftigen Analysen (wie z.B. der Transplantationskinetik) empfehlen wir, nur ein Mausgeschlecht zu verwenden, wenn mit derselben Leukämieprobe gearbeitet wird. Es wurden keine anderen Parameter verwendet, um ein Geschlecht gegenüber dem anderen zu bevorzugen.
    2. Platzieren Sie jeweils eine Maus in einer sicheren und zugelassenen Mausefalle, um eine ordnungsgemäße Eindämmung des Tieres zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass sich der Schwanz des Tieres außerhalb der Falle befindet und für die Transplantation leicht zugänglich ist.
      HINWEIS: Leukämiezellen werden durch intravenöse (i.v.) Injektion in Mäuse transplantiert. Etablierte Protokolle nutzen zu diesem Zweck die Seitenvenen des Schwanzes11.
    3. Verwenden Sie Infrarotlicht, um die richtige Venenausdehnung zu gewährleisten. Injizieren Sie 100 μl der Transplantationslösung mit einer sterilen, scharfen Einweg-Injektionsnadel. Bewahren Sie die transplantierten Mäuse in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung auf. Lassen Sie sie 15 Tage ruhen.
      1. Um das Infrarotlicht zu verwenden, halten Sie das bereits gefesselte Tier außerhalb des Käfigs und 30 cm Abstand zum Licht. Passen Sie je nach möglicher Lichtleistung die Belichtungszeit an. Bei Verwendung einer Lampe mittlerer Leistung ist ein Zeitraum von 5 Minuten ausreichend, um die Venenerweiterung zu gewährleisten. Wenn der Schwanz über einen längeren Zeitraum freigelegt wird, kann dies zu Verbrennungen und Stress für das Tier führen.
      2. Verwenden Sie für die Injektion eine Insulinspritze mit aufgesetzter Nadel mit einem Volumen von 1 ml und einer Nadelstärke von 12,7 mm x 0,33 mm. Die Spezifikation der verwendeten Nadel finden Sie in der Materialtabelle. Halten Sie die Mäuse in einem 12-Stunden/12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus. Darüber hinaus halten Sie die in dieser Studie verwendeten Tiere in einem autoklavierbaren, durchscheinenden, bernsteinfarbenen Polycarbonatkäfig mit Umgebungsanreicherung, um Nester zu schaffen.
  4. Periphere Blutentnahme
    1. Entnehmen Sie 2 Wochen nach der Inokulation und danach jede Woche eine periphere Blutprobe von 50 μl von jeder Maus.
    2. Halten Sie das Tier mit der linken Hand manuell fest und achten Sie darauf, dass sein Kopf sicher gehalten wird. Verwenden Sie mit der rechten Hand eine sterile, scharfe Einweglanzette, um die Gesichtsvene des Plexus submandibularis des Tieres zu punktieren.
      HINWEIS: Dies ist ein potenziell schädliches Verfahren für die Mäuse und muss sorgfältig durchgeführt werden.
      1. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Fixierung leicht atmen kann. Achten Sie auf Veränderungen der Atemfrequenz (Kurzatmigkeit) und Veränderungen der Mundfarbe (sie sollte nicht lila oder dunkelblau werden). Wenn der Plexus submandibularis nicht richtig punktiert wird, kann es aufgrund der Gehörgangspunktion zu Blutungen im Ohr kommen. Als Orientierungshilfe für zukünftige Experimentatoren steht die ergänzende Abbildung 1 zur Verfügung, um die richtige Position des Plexus sicherzustellen.
        HINWEIS: Alternativ können auch Schwanzvenenblutungen zur Entnahme von Blutproben verwendet werden.
    3. Lassen Sie das Tier nach der Entnahme nicht unbeaufsichtigt. Er muss aktiv und unversehrt sein. Wenn die Maus Anzeichen von Stürzen (Kopf oder Körper) und Inaktivität zeigt, sollte sie eingeschläfert werden. Überschreiten Sie nicht 50 μl Volumen, da größere Blutmengen zum Tod des Tieres führen können.
    4. Bewahren Sie die entnommene Blutprobe in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 8 μl 50 mM EDTA auf, um eine Gerinnung der Probe zu vermeiden.
      HINWEIS: Hier haben wir eine zuvor vorbereitete EDTA-Lösung als Antikoagulans verwendet. Falls gewünscht, können bei diesem Schritt auch handelsübliche EDTA-Röhrchen mit geringem Volumen für die Blutentnahme verwendet werden. Die Blutproben müssen noch am selben Tag aufbereitet werden.
  5. Vorbereitung von peripheren Blutproben für die Verarbeitung
    1. Homogenisieren Sie das Blut mit EDTA. Übertragen Sie 50 μl des Gemisches in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen.
    2. Bereiten Sie eine Antikörpermischung vor, die jeder Probe zugesetzt wird, bestehend aus einem Anti-Maus-CD45-Antikörper (mCD45), einem Anti-Human-CD45-Antikörper (hCD45), einem Anti-Human-CD19-Antikörper (hCD19) und sterilem 1x PBS als Verdünnungsmittel.
  6. Verarbeitung von Blutproben
    1. Geben Sie 10 μl des Antikörpergemisches zu jeder Blutprobe. Durch leichtes Klopfen mit dem Zeigefinger homogenisieren. 30 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
      HINWEIS: Wählen Sie die oben beschriebenen geeigneten Antikörper unter Berücksichtigung der verfügbaren Kanäle des Zytometers aus. Um die Menge des pro Probe verwendeten Antikörpers zu bestimmen, sollten Sie für jeden Antikörper eine Titrationskurve durchführen. Die in unserer Studie verwendeten Antikörper, die Fluorochrome, und das für die Proben gewählte Volumen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Eine vollständige Beschreibung der Antikörper, der Katalognummern und der Klonnamen finden Sie in der Materialtabelle.
    2. Geben Sie 1 ml handelsübliche 1x Lyselösung für rote Blutkörperchen (RBC) zu jeder Probe. Mit dem Zeigefinger kräftig homogenisieren. 15 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
      HINWEIS: Bei der in diesem Schritt verwendeten Lyselösung handelt es sich um eine handelsübliche 10x Erythrozyten-Lyselösung. Wenn ein anderes Reagenz verwendet wird, muss das 1x Arbeitsvolumen für die Lyse angepasst werden.
    3. Geben Sie 2 ml steriles 1x PBS zu jeder Probe für den ersten Waschschritt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 x g (in einem Schwenkrotor) für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie ihn umdrehen, und trocknen Sie die verbleibende Flüssigkeit oben im Röhrchen, indem Sie ihn vorsichtig mit Küchenpapier abtupfen.
      HINWEIS: In den Waschschritten werden die Leukämiezellen am Boden des Zytometerröhrchens pelletiert und die restliche Flüssigkeit wird verworfen. Beim Umgang mit den Proben ist unbedingt Vorsicht geboten, da das Pellet in bestimmten Fällen nicht erkennbar sein kann. Um die Unversehrtheit des Pellets zu gewährleisten, vermeiden Sie es, die Probe zu schütteln, da dies zu einem Verlust führen kann.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.6.3. Resuspendieren Sie die Leukämiezellen mit 200 μL sterilem 1x PBS, indem Sie vorsichtig mit dem Zeigefinger auf das Zytometrieröhrchen klopfen. Die Proben sind bereit für die Analyse durch Durchflusszytometrie. Die Transplantationsüberwachung muss am selben Tag wie die Blutentnahme durchgeführt werden.
  7. Überwachung des Transplantats durch Durchflusszytometrie
    1. Verwendung von Standard-Durchflusszytometrie-Methoden 9,14, um den prozentualen Anteil menschlicher CD45+-Zellen im peripheren Blut im Vergleich zu CD45+-Zellen von Mäusen (% hCD45+) zu bestimmen.
    2. Sammeln Sie durch Durchflusszytometrie generierte Daten für die anschließende Analyse des Prozentsatzes von hCD45+ über die Gesamtzahl der CD45-Zellen (hCD45+ plus mCD45+) mit Hilfe einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware.
      HINWEIS: Um eine ordnungsgemäße Überwachung der Transplantation zu gewährleisten, sollten die folgenden Analyseschritte am selben Tag durchgeführt werden. Diese Tagesabfolge ist besonders wichtig, wenn man den Beginn des zukünftigen Behandlungsplans berücksichtigt, den wir empfehlen, am Montag zu beginnen. Wenn es nicht möglich ist, am Montag zu beginnen, kann die Behandlung an jedem Wochentag beginnen, abhängig von der Erreichung des hCD45+% (0,2%-1%) im peripheren Blut.
  8. Vorbereitung der Umgebung für die Datenanalyse der Durchflusszytometrie
    1. Starten Sie die Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Importieren Sie die gesammelten Daten und warten Sie auf ihre Erkennung durch das Tool.
    2. Öffnen Sie die Daten aus der ersten Probe, um das Tor mit der Bezeichnung Lymphozyten zu erstellen. Überprüfen der Achseneinstellungen: Wählen Sie FSC-A für die X-Achse und SSC-A für die Y-Achse. Wählen Sie im oberen Anschnitterstellungsfenster das Poly-Liner-Werkzeug aus und skizzieren Sie die Hauptzellenpopulation.
      HINWEIS: Lymphozyten erscheinen typischerweise zwischen 50.000 und 100.000 auf der X-Achse und 0 bis 50.000 auf der Y-Achse. Die Werte können je nach den Merkmalen der jeweiligen Leukämie variieren.
    3. Doppelklicken Sie auf die Gated Population , um ein neues Tor zu erstellen. Um Zelldubletten auszuschließen, stellen Sie FSC-A auf der X-Achse und FSC-H auf der Y-Achse ein. Verwenden Sie das Poly-Liner-Werkzeug, um die primäre Zellpopulation zu isolieren. Zeichnen Sie das Gate eng um die Grundgesamtheit herum, wobei Ereignisse ausgeschlossen werden, die entlang der X-Achse weit entfernt sind.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden einzelne Zellereignisse unterschieden.
  9. Erstellen des Zytometrie-Panels zur Unterscheidung von Zellpopulationen
    1. Doppelklicken Sie auf die ausgewählte Population , um menschliche von CD45-Zellen aus der Maus zu unterscheiden. Stellen Sie die X-Achse auf das mCD45-Fluorophor und die Y-Achse auf SSC-A ein. Zeichnen Sie mit dem Formwerkzeug ein Quadrat um die mCD45-negative Population.
    2. Doppelklicken Sie auf die resultierende Population , um hCD19+- und/oder hCD45+-Zellen zu unterscheiden. Stellen Sie die X-Achse auf das hCD19-Fluorophor und die Y-Achse auf hCD45 ein. Wählen Sie in der Gruppe zur Erstellung des Tores die Option Senkrechte Linien , um die unterschiedlichen Populationen zu trennen.
      HINWEIS: Als Alternative kann der Untersucher das Gate oder die Möglichkeit zur Unterscheidung von hCD45- und mCD45-Zellen verwenden. Bei dieser Möglichkeit wird die Summe der Ereignisse als 100 % berücksichtigt, was eine genauere Strategie zur Identifizierung von Populationen ermöglicht.
  10. Anwenden von Statistiken auf das erstellte Panel
    1. Berechnen Sie den prozentualen Anteil jeder isolierten Zellpopulation im Verhältnis zu allen erfassten Ereignissen. Klicken Sie im Hauptfenster der Software mit der rechten Maustaste auf das Subgraph-Symbol , das aus dem Hauptdiagramm der einzelnen Stichproben abgeleitet wird, und wählen Sie Statistik erstellen aus. Klicken Sie im geöffneten Fenster auf Häufigkeit von und wählen Sie Einzelne Zellen aus. Führen Sie diesen Schritt für jedes Teildiagramm einzeln aus.
    2. Wählen Sie alle vorgenommenen Änderungen aus, um die Gating-Strategie und die zugehörigen Statistiken auf alle Stichproben anzuwenden. Ziehen Sie dann mit der linken Maustaste die ausgewählten Änderungen auf die Option Alle Samples im Hauptfenster der Software.
    3. Klicken Sie im Hauptfenster auf Tabelleneditor , um eine Tabelle mit allen berechneten Häufigkeiten zu erstellen. Wählen Sie im Popup-Fenster das .xls Dateiformat aus, legen Sie den Zielordner fest und klicken Sie auf Tabelle erstellen.
      HINWEIS: Alle Schritte, die mit der Durchflusszytometrie-Analysesoftware durchgeführt werden, können in der ergänzenden Abbildung 2 visualisiert werden. Die endgültige Tabelle, die durch diesen Schritt generiert wird, enthält den Prozentsatz an hCD45+, der zur Erstellung von Diagrammen zur Analyse des Transplantationsfortschritts im Laufe der Zeit erforderlich ist.
  11. Darstellung des Transplantationsverlaufs
    1. Starten Sie eine Software zum Zeichnen und Analysieren von Diagrammen. Wählen Sie das XY-Tabellenformat aus. Wählen Sie im Hauptfenster Enter or Import Data into a New Table (Daten in eine neue Tabelle eingeben) aus, legen Sie X auf Zahlen und Y auf Enter replicate values in nebeneinander angeordneten Unterspalten fest.
    2. Ordnen Sie in der geöffneten Tabelle die Spaltenüberschriften an: Geben Sie Tage der Transplantation für die X-Spalte und % hCD45+ auf PB für die erste Gruppe von Y-Unterspalten ein. Vervollständigen Sie die Spalte X mit den Tagen nach der Injektion, die den Tagen der Blutentnahme für die Transplantationsüberwachung entsprechen. Geben Sie den wöchentlich erfassten Prozentsatz der hCD45+-Daten für jede Maus manuell in die Unterspalten Y ein.
    3. Wählen Sie im Softwaremenü unter der Untergruppe Familie die Option Daten 1 aus. Wählen Sie im Popup-Fenster die zweite Diagrammoption mit dem Namen Punkte & Verbindungslinie mit Fehlerbalken und aktivieren Sie das Zeichnen von Mittelwert- und Fehlerbalken.
    4. Passen Sie die Diagrammachsen an die gewünschten Bereiche an. Klicken Sie in der oberen rechten Ecke des Menüs auf Exportieren , um das endgültige Diagramm herunterzuladen.
      HINWEIS: Alle Daten, die während der Experimente mit einer einzelnen ALL gesammelt wurden, müssen in derselben Grafik dargestellt werden, um die Analyse im Zeitverlauf seit Beginn des Experiments zu erleichtern. Ein anschauliches Beispiel für das Plotten von Diagrammen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 3.

2. Behandlung von Mäusen

  1. Herstellung von Wirkstoffwirklösungen
    1. Bereiten Sie eine Vincristin-Arbeitslösung in einer Konzentration von 1 mg/ml vor. Bereiten Sie eine Dexamethason-Arbeitslösung mit 4 mg/ml vor. Bereiten Sie die L-Asparaginase-Arbeitslösung mit 2.000 I.E./ml vor. Bereiten Sie die Daunorubicin-Arbeitslösung mit 2 mg/ml vor.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Arzneimittel entsprechen denen, die bei der klinischen Behandlung von Patienteneingesetzt werden 15. Das Dexamethason-Arbeitslösungsvehikel besteht aus Kreatinin, Natriumcitratdihydrat, Natriumhydroxid, Natriumbisulfit, Methylparaben, Propylparaben und Wasser zur Injektion. Das Vincristin-Arbeitslösungsvehikel besteht aus Mannitol, Schwefelsäure, Natriumhydroxid und Wasser zur Injektionszwecke. L-Asparaginase und Daunorubicin sind häufig in lyophilisierter Form erhältlich. In solchen Fällen ist das empfohlene Vehikel für die Rekonstitution steriles Wasser für Injektionszwecke, das verwendet werden muss, um die richtige Konzentration zu erreichen. Um einen Verlust der Arzneimittelaktivität aufgrund wiederholter Auftauzyklen zu verhindern, müssen die Arzneimittel in Arbeitsaliquote unterteilt werden, die nicht mehr als 3x verwendet werden.
  2. Tiere, die wiegen, wenn Leukämie festgestellt wird
    1. Beginnen Sie die Behandlung an dem Punkt, an dem der Prozentsatz der hCD45+-Zellen im peripheren Blut von Mäusen einen Medianbereich zwischen 0,2 % und 1 % erreicht. Wenn Sie es erreicht haben, teilen Sie die transplantierten Mäuse in zwei verschiedene Gruppen ein: eine für die Behandlung und eine für die Kontrolle.
    2. Wenn Sie den festgelegten Schwellenwert erreicht haben, setzen Sie die wöchentliche Überwachung des Fortschreitens der Leukämie fort. Kontinuierliche Erfassung von hCD45 %-Daten, um das Ansprechen auf die Behandlung, das Auftreten von Schüben und die Erkennung von Arzneimittelresistenzen zu überwachen.
    3. Wiegen Sie die zu behandelnden Tiere. Verwenden Sie das arithmetische Mittel der Gewichte, um die Dosis jedes Arzneimittels zu bestimmen, das der Gruppe verabreicht werden soll. Wiegen Sie die Tiere der Kontrollgruppe, um die Gewichtszunahme/-abnahme zwischen den Gruppen zu vergleichen.
      1. Verwenden Sie die folgenden Arzneimitteldosen: Vincristin, 0,15 mg / kg; Dexamethason, 5 mg/kg; L-Asparaginase, 1.000 IE/kg; und Daunorubicin, 1,2 mg/kg. Wiegen Sie alle Tiere mindestens 3x pro Woche: montags, mittwochs und freitags. Verwenden Sie die Gewichte, um die Behandlungsdosen der Arzneimittel anzupassen und den Grad der Behandlungstoxizität zu überwachen.
  3. Herstellung der Verabreichungslösungen des Arzneimittels aus der Arbeitslösung Aliquote
    HINWEIS: Arzneimittelverabreichungslösungen bestehen aus sterilem 1x PBS als Verdünnungsmittel und dem korrekten Volumen (entsprechend dem Gewicht des Tieres) an Arbeitsarzneimittellösungen (steriles Wasser wird ausschließlich zur Rekonstitution und nicht zur Injektion verwendet), die jeden Tag der Woche verabreicht werden. Medikamente, die intraperitoneal verabreicht werden, können in derselben Lösung vereint werden. Wenn jedoch ein Arzneimittel intravenös verabreicht wird, sollte es in eine individuelle Lösung gegeben werden. Das Volumen der Arzneimittelverabreichungslösung, die jedem Tier verabreicht wird, beträgt 100 μl.
    HINWEIS: Im oben beschriebenen Schritt wurde eine sterile Insulinspritze mit aufgesetzter Nadel (1 ml, mit den Nadelabmessungen 12,7 mm x 0,33 mm) verwendet. Eine vollständige Beschreibung der Spritze finden Sie in der Materialtabelle.
    1. Bereiten Sie am Montag eine Arzneimittelverabreichungslösung vor, die aus Dexamethason, Vincristin und PBS besteht. Verabreichen Sie die Medikamente intraperitoneal.
    2. Bereiten Sie am Dienstag und Donnerstag eine Arzneimittelverabreichungslösung vor, die aus Dexamethason, L-Asparaginase und PBS besteht. Verabreichen Sie die Medikamente intraperitoneal.
    3. Bereiten Sie am Mittwoch eine Arzneimittelverabreichungslösung bestehend aus Dexamethason und PBS vor und verabreichen Sie diese intraperitoneal. Bereiten Sie eine zweite Verabreichungslösung vor, die aus Daunorubicin und PBS besteht. Verabreichen Sie es intravenös.
    4. Bereiten Sie am Freitag eine Arzneimittelverabreichungslösung vor, die aus Dexamethason und PBS besteht. Verabreichen Sie das Medikament intraperitoneal.
    5. Lassen Sie die Tiere an den Wochenendtagen ruhen. Wiederholen Sie den Behandlungszyklus für 4 Wochen.
      HINWEIS: Ein umfassender Behandlungsplan ist in der ergänzenden Tabelle 2 zu finden. Es ist wichtig klarzustellen, dass andere Protokolle, die bereits für die Behandlung von Mäusen etabliert waren, getestet wurden, aber zu einer hohen Toxizität für den NSG-Stamm führten. Daher wurde der vorgeschlagene Behandlungsplan zunächst einem Standardisierungsprozess zur Verringerung der Toxizität unterzogen, der zu den in diesem Protokoll angegebenen Dosen und Häufigkeit der Verabreichung führte. Es wird erwartet, dass der Prozentsatz von hCD45+ in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Prozentsatz von hCD45+ in der Kontrollgruppe aufgrund der Verabreichung der Behandlung abnimmt.
  4. Verabreichung von Medikamenten und Überwachung der Leukämiereaktion
    1. Halten Sie das Tier manuell mit der linken Hand fest, um Arzneimittel intraperitoneal zu verabreichen. Halten Sie das Tier mit dem ventralen Teil nach oben. Lokalisieren Sie im ventralen Teil den unteren rechten Quadranten.
    2. Verwenden Sie mit der rechten Hand eine sterile, scharfe Einweg-Injektionsnadel und injizieren Sie 100 μl der Arzneimittelverabreichungslösung in den unteren rechten Quadranten der Maus.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Tier festhalten. Es sollte kein schädlicher Eingriff für die Mäuse sein. Achten Sie wie bei der Blutentnahme auf Komplikationen bei den Atemwegen. Bei intraperitonealen Injektionen ist die Nadel immer senkrecht zu halten, um Organbohrungen zu vermeiden.
    3. Befolgen Sie die gleichen Anweisungen, die auch für die Transplantation von Leukämiezellen verwendet werden, um Medikamente intravenös zu verabreichen. Lassen Sie die Mäuse nach 4-wöchiger Behandlungsverabreichung bis zum Wiederauftreten ALLER Zellen ruhen, hier als erstes Rezidiv bezeichnet (Beleg1).
      HINWEIS: Trotz des Unterschieds im Verabreichungsweg wird bei der intravenösen Injektion das gleiche Volumen verwendet wie bei der intraperitonealen Injektion.
  5. Überwachung der Leukämiereaktion und Erkennung eines ersten Rezidivs (Beleg1)
    1. Brechen Sie die wöchentliche durchflusszytometrische Überwachung der Leukämie während der Behandlungs- oder Ruhephasen nicht ab.
      HINWEIS: In Anbetracht der Behandlung an 5 Tagen pro Woche wird dringend empfohlen, die Überwachung zu Beginn der Woche durchzuführen. In unserer Studie wurden die Blutentnahme, die Probenaufbereitung und die Analyse immer montags durchgeführt.
    2. Führen Sie die Blutentnahme und alle nachfolgenden Verfahren durch, die für die Überwachung gemäß den Schritten 1.4 - 1.11 erforderlich sind.
      HINWEIS: Nach der gegebenen Ruhephase werden R1-Zellen durch den plötzlichen Anstieg des Prozentsatzes von hCD45+ im peripheren Blut von Mäusen nachgewiesen. Der Zeitraum zwischen dem Ende der Behandlung und dem Auftreten eines Rezidivs ist variabel und kann bei jeder gescreenten Leukämie unterschiedlich sein. Bei der Detektion von R1 sollte die dritte und letzte Phase des vorgeschlagenen Mausmodells des Rezidivs durchgeführt werden. Um das Monitoring und die Ansprechanalysen zu verbessern, empfehlen wir, objektive Ansprechmaße wie fortschreitende Erkrankung, stabile Erkrankung, Grad der Ansprechbarkeit (teilweise, vollständig oder aufrechterhalten), Remission und Resistenz zu verwenden, gemäß den von Randall et al. (2024)16 beschriebenen Richtlinien.

3. Wiederholte Behandlungszyklen bis zum Auftreten resistenter Zellen

  1. Erkennung des ersten Rückfalls
    1. Verabreichen Sie einer Maus mit einem Leukämierezidiv (R1 genannt) eine volle Woche lang eine Induktionsbehandlung, d. h. wenn der Schwellenwert von 0,2 % hCD45+ im peripheren Blut erreicht ist. Befolgen Sie 1 Woche lang von Montag bis Freitag den Zeitplan für die Verabreichung des Arzneimittels, der für die 4-wöchige Induktionsbehandlung verwendet wird.
      HINWEIS: Die Verabreichung von nur 1 Woche Behandlung zu diesem Zeitpunkt zielt darauf ab, in vivo zu testen, ob die Leukämiezellen eine Resistenz gegen die Chemotherapie entwickelt haben, während die Leukämie schließlich im Laufe der Zeit unter dem Druck der Chemotherapie zu aufeinanderfolgenden Schüben fortschreitet. Wir haben uns entschieden, kein zweites 4-Wochen-Schema durchzuführen, um übermäßige Toxizität und den Verlust von Tieren zu vermeiden.
    2. Lassen Sie die Mäuse am Ende der vollen Woche der Arzneimittelverabreichung ruhen. Setzen Sie die wöchentliche Überwachung des Leukämieansprechens durch Durchflusszytometrie nach den Schritten 1.4 - 1.11 fort.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wird erwartet, dass die Leukämiezellen weiterhin auf die Behandlung ansprechen. Folglich sollte bei der Überwachung der Leukämie der Prozentsatz von hCD45+ in den Mäusen abnehmen und für einen bestimmten Zeitraum negativ bleiben.
  2. Überwachung des R2-Auftretens
    1. Warten Sie, bis ein Rezidiv R2 auftritt (hCD45+ Zellen ≥ 0,2%). Wenn es erscheint, zählen Sie die Zeit, die zwischen dem Ende der Behandlung und dem Auftreten von R2 verstrichen ist. Nennen Sie diese Periode Δt1.
    2. Fahren Sie mit einer zweiten vollen Woche der Induktionsbehandlung fort. Befolgen Sie die gleichen Richtlinien wie bei der ersten Verabreichung dieses Zeitplans.
    3. Lassen Sie die Mäuse am Ende der Behandlung ruhen. Setzen Sie die Leukämieüberwachung fort.
  3. Überwachung des R3-Auftretens
    1. Warten Sie, bis der Rückfall R3 angezeigt wird. Zählen Sie die Zeit auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.2.1. Nennen Sie es Δt2.
    2. Vergleichen Sie Δt1 und ΔT2. Wiederholen Sie die obigen Schritte N mal, um mehrere Leukämie-Schübe zu erhalten (R1, R2... RN), wenn die Δt-Periode gleich bleibt. Beenden Sie die Behandlungszyklen, sobald sich die Δt-Periode verkürzt.
      HINWEIS: Eine Abnahme von Δt bis zum Rückfall ist ein Hinweis auf eine Arzneimittelresistenz, die von den Leukämiezellen erreicht wird. Dieses Ergebnis unterstreicht die Fähigkeit des Mausmodells des Rezidivs, Chemotherapie-resistente ALL-Zellen zu erzeugen.
    3. Gewinnen Sie Leukämiezellen, wie in Schritt 4 unten beschrieben. Sie sind lebend durch Kryokonservierung oder durch Konservierungsmittel zu lagern, die mit den vorgesehenen nachfolgenden Analysen vereinbar sind.
      HINWEIS: Das empfohlene Ereignis für die Genesung von Leukämiezellen beträgt bis zu 25 % von hCD45+ im peripheren Blut, wie in der neueren Literaturbeschrieben 16.

4. Genesung von leukämischen Zellen durch Organraub

  1. Euthanasie von Mäusen mit einer Überdosis chemischer Betäubungsmittel
    1. Euthanasieren Sie Mäuse durch Überdosierung chemischer Anästhetika, gefolgt von einer Gebärmutterhalsdislokation zur Bestätigung der Euthanasie, wie unten beschrieben.
    2. Bereiten Sie eine Mischung aus drei Anästhetika vor, die in sterilem 1x PBS verdünnt sind, für eine tiefe Anästhesie. Verwenden Sie 150 μl kommerzielles Acepromazinmaleat, 50 μl kommerzielles Xylazin, 80 μl kommerzielles Ketamin und 220 μl PBS für jedes Tier, das eingeschläfert werden soll.
    3. 500 μl der zubereiteten Mischung durch intraperitoneale Injektion verabreichen. Befolgen Sie die gleichen Rückhalte- und Injektionsrichtlinien wie in Schritt 2.4 beschrieben.
    4. Unter der Wirkung einer Überdosis chemischer Betäubungsmittel legen sich die Mäuse auf den Boden des Käfigs. Beobachten Sie nach einigen Minuten, ob die Mäuse einen Atemstillstand haben. Wenn ja, warten Sie, bis die Atemanstrengung aufhört. Um zu überprüfen, ob das Euthanasieverfahren wirksam war, überprüfen Sie, ob ein unwillkürlicher Reflex vorhanden ist, indem Sie Druck auf eines der Hinterbeine des Tieres ausüben. Um die Euthanasie zu bestätigen, fahren Sie mit der Gebärmutterhalsluxation fort.
  2. Zervikale Luxation
    1. Halten Sie das Tier mit dem hinteren Teil des Körpers gegen das Futtergitter des Käfigs. Forme mit dem Zeige- und Daumenfinger der linken Hand die Form einer Pinzette. Lege die pinzettenförmigen Finger direkt unter den Kopf des Tieres. Drücke fest gegen den zervikalen Teil der Wirbelsäule.
    2. Fassen Sie mit der rechten Hand den Schwanz des Tieres. Ziehen Sie ihn mit einer festen und gleichmäßigen Bewegung zurück, bis der Kopf des Tieres vom Rest seines Körpers getrennt ist.
      HINWEIS: Die Zervixluxation ist eine der akzeptierten Methoden zur Bestätigung der Euthanasie 17,18,19. Andere Methoden, wie z. B. eine fortgesetzte Exposition gegenüber CO2 für mindestens 15 Minuten nach einem Atemstillstand, können als Alternative verwendet werden.
  3. Vorbereitung von Tieren für den Organraub
    1. Desinfizieren Sie die Mäuse, indem Sie 70% Alkohol auf ihren gesamten Körper auftragen. Legen Sie den Körper des Tieres mit dem ventralen Teil nach oben auf eine chirurgische Plattform für Nagetiere. Rasieren Sie den Bauchteil des Körpers.
      HINWEIS: Eine vollständige Beschreibung der chirurgischen Operationsplattform für Nagetiere finden Sie in der Materialtabelle.
  4. Milz-Entnahme
    1. Machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere und Pinzette einen kleinen Schnitt auf der Bauchhaut. Entfernen Sie es aus dem Bauchbereich und legen Sie das Bauchfell frei.
    2. Machen Sie einen kleinen Schnitt im Bauchfell. Schneiden Sie es, bis Sie vollständigen Zugang zu den Organen im Bauch haben.
    3. Lokalisieren Sie die Milz direkt unter dem Magen des Tieres. Entferne die Milz. Legen Sie es zur weiteren Verarbeitung in einen Behälter, der steriles 1x PBS enthält.
  5. Femur-Entnahme
    1. Fahren Sie mit dem Öffnen der Bauchhöhle fort, um Zugang zu den Hinterbeinen des Tieres zu erhalten.
    2. Lokalisieren Sie den Oberschenkelknochen. Entfernen Sie es, indem Sie an den Gelenken schneiden, die es mit dem Beckenknochen und mit dem Schien- und Wadenbein verbinden. Führen Sie diesen Vorgang für beide Oberschenkelknochen durch.
    3. Reinige die Knochen, indem du alle verbleibenden Muskeln, Haut oder Gewebe entfernst. Legen Sie sie zur weiteren Verarbeitung in einen Behälter, der steriles 1x PBS enthält. Entsorgen Sie den Tierkadaver gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission.
      HINWEIS: Abhängig von den Zielen der Studie können ALLE Zellen auch aus der Leber, dem Zentralnervensystem, dem Thymus, den Lymphknoten usw. entnommen werden. In diesem Manuskript beschreiben wir beispielhaft die Entnahme ALLER Zellen aus der Milz und dem Knochenmark.
  6. Vorbereitung für die Organaufbereitung
    1. Sammeln Sie ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, zwei sterile 1-ml-Spritzen, eine sterile 25 mm x 0,6 mm-Injektionsnadel und zwei sterile 70-μm-Zellsiebe.
  7. Milz-Aufbereitung
    1. Legen Sie ein Zellsieb auf ein offenes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Milz auf die Oberfläche des Zellsiebs. Mazerieren Sie das Organ mit dem flachen Teil des Spritzenkolbens, bis keine großen Teile mehr sichtbar sind.
    2. Geben Sie steril 1x PBS in die mazerierte Milz. Führen Sie mit dem flachen Teil des Spritzenkolbens kreisende Bewegungen aus, um die Zellfiltration sicherzustellen.
      HINWEIS: Das PBS-Gießen kann schrittweise erfolgen. Das verwendete Endvolumen darf jedoch 6 ml nicht überschreiten. Nach Abschluss der Milzaufbereitung sollte das Zellsieb klar und frei von jeglichem Restgewebe sein. Im Falle einer Sättigung des Zellsiebs ist es möglich, ein alternatives Zellsieb einzusetzen. Der Inhalt des ersten Siebes kann in das zweite Sieb überführt werden, und die Verarbeitung kann dann fortgesetzt werden. Um an die Tumorlast in diesem Organ zu gelangen, kann ein Teil der Milz für die histopathologische Beurteilung abgetrennt werden.
  8. Knochenmarkaufbereitung
    1. Integrieren Sie ein neues Zellsieb für die Knochenmarkaufbereitung in das bereits verwendete Zentrifugenröhrchen. Schneiden Sie die Ränder des Oberschenkelknochens ab, bis die Knochenmarköffnungen zugänglich sind. Führen Sie die Injektionsnadel in eine neue Spritze ein. Geben Sie 1 ml steriles 1x PBS in die Spritze.
      HINWEIS: Abhängig von den Zielen der Studie sollten ALLE Zellen aus Milz und Knochenmark getrennt entnommen werden. In diesem Fall sollte für jedes Gewebe ein separates Zentrifugenröhrchen verwendet werden. Ein Teil des Femurs kann für die histopathologische Beurteilung abgetrennt werden, um die Tumorlast in diesem Organ zu beurteilen.
    2. Führen Sie eine Knochenmarkspülung über das Zellsieb durch. Führen Sie die Nadelspitze in eine Seite der Knochenmarköffnung ein. Drücken Sie den Spritzenkolben mit einer festen und konstanten Bewegung. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Oberschenkelknochen.
    3. Entkoppeln Sie die Nadel. Verwenden Sie den flachen Teil der Spritze, um das gespülte Knochenmark zu mazerieren. Geben Sie steril 1x PBS in das mazerierte Knochenmark. Führen Sie mit dem flachen Teil des Spritzenkolbens kreisende Bewegungen aus, um die Zellfiltration sicherzustellen. Nach Abschluss des Verarbeitungsverfahrens wird das 50-ml-Zentrifugenröhrchen ein Gesamtvolumen von 10 ml enthalten, das aus einer Mischung von Milz- und Knochenmarkzellen besteht, die in PBS verdünnt wurden.
      HINWEIS: Der PBS-Gießvorgang kann schrittweise ausgeführt werden. Es ist jedoch unbedingt darauf zu achten, dass das verwendete Endvolumen 2 ml nicht überschreitet.

5. Isolierung von leukämischen Zellen durch Gradientenzentrifugation

  1. Vorbereitung für die Isolierung von Leukämiezellen
    1. Entnehmen Sie ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, sterile Einweg-Pasteurpipetten, das 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit den verarbeiteten Organen und das Dichtegradientenmedium für die Lymphozytenisolierung.
      HINWEIS: Das Medium erleichtert die Isolierung von mononukleären Zellen, indem es durch Zentrifugation einen Dichtegradienten erzeugt. Mononukleäre Zellen (Lymphozyten, Monozyten und ALL-Zellen) bilden eine Schicht an der Grenzfläche zwischen dem Medium und dem Plasma.
  2. Isolierung von Leukämiezellen
    1. Geben Sie 5 ml des Dichtegradientenmediums für die Lymphozytenisolierung mit einer Einweg-Pasteurpipette in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie nach und nach die 10 ml der Mischung aus Milz- und Knochenmarkzellen über die mittlere Schicht. Halten Sie das Röhrchen in einem flachen Winkel von etwa 30° oder weniger und fügen Sie das Zellgemisch langsam entlang der Röhrchenwand hinzu, so dass die Dichtemediumschicht nicht gestört wird.
      HINWEIS: Seien Sie während dieses Vorgangs vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Zellen nicht mit dem Dichtemedium vermischen. Störungen während dieses Prozesses können dazu führen, dass die Bildung von Dichtegradienten während der Zentrifugation nicht mehr möglich ist.
    2. Zentrifugieren Sie das 15-ml-Röhrchen bei 420 x g auf einem Ausschwingrotor für 30 Minuten, ohne Beschleunigung und ohne Pause, um eine Störung der gebildeten Phasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Leukämische Zellen bilden eine Schicht zwischen dem Dichtemedium und der wässrigen Phase.
    3. Entfernen und entsorgen Sie die obere wässrige Phase mit einer sterilen Einwegpipette von Pasteur. Entnehmen Sie die Schicht der leukämischen Zellen, die mit einer sterilen Einwegpipette von Pasteur gebildet wurde. Übertragen Sie es in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Machen Sie sich keine Sorgen, wenn ein Teil der mittleren Schicht mit geringerer Dichte zusammen mit den Leukämiezellen pipettiert wird.
  3. Waschen von Leukämiezellen
    1. Geben Sie steriles 1x PBS in das Röhrchen mit den entnommenen Zellen, bis der Grenzwert von 15 mL erreicht ist.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x gfür 5 min. Stellen Sie die maximale Beschleunigung und Bremsung wieder her. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in neuem sterilem Kältemittel 1x PBS.5.3.3.Fahren Sie mit der Überprüfung der Zelle und der Zellviabilität fort. Befolgen Sie die Standardrichtlinien für das Verfahren zur Zellzählung13. Die gewaschenen Zellen können mit Anti-Maus-CD45-Antikörpern (mCD45), Anti-Human-CD45-Antikörpern (hCD45) und Anti-Human-CD19-Antikörpern (hCD19) gefärbt werden, gefolgt von Waschschritten und Datenerfassung.
      HINWEIS: Bei der Verarbeitung der Milzzellen und der Knochenmarkzellen in verschiedenen Zentrifugenröhrchen kann ein Teil dieser Proben verwendet werden, um die Tumorlast in diesen Organen durch Durchflusszytometrie zu erfassen.
  4. Kryokonservierung von leukämischen Zellen
    1. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand. Halten Sie die Zellen auf Eis.
    2. Bereiten Sie ein Gefriermedium vor, das zu 90 % aus sterilem kaltem fötalem Rinderserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht. Verwenden Sie 1 ml dieser Lösung für jedes Kryokonservierungsfläschchen.
    3. Auf Eis die Zellen in der vorbereiteten Lösung in einer Konzentration von 2 x 107 Zellen/ml resuspendieren. Aliquotieren Sie die Zellen in die Kryokonservierungsröhrchen. Kryokonservierung von Zellen gemäß den Standardrichtlinien für die Kryokonservierung von Zellkulturen20.
      HINWEIS: Diese Zellen können für weitere Analysen verwendet werden. Anstatt lebensfähige Zellen einzufrieren, kann man Zellen auch aliquotieren und in verschiedenen Konservierungsmitteln für nachfolgende DNA-, RNA-, Protein- und Metabolitenanalysen konservieren.

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Ergebnisse

Im Rahmen unserer Studien wurden Vorläufer-B-Zell-ALL-Proben aus zwei Patientengruppen ausgewählt: eine, die ein günstiges Ansprechen zeigte, wie durch das Fehlen von Leukämiezellen im peripheren Blut am Tag 8 und das Fehlen von Restleukämiezellen im Knochenmark an den Tagen 15, 33 und 78/96 bestimmt wurde. Die andere Gruppe bestand aus ALLs, die mit den molekularen Untergruppen der vorherigen übereinstimmten und von Patienten stammten, die ein schlechtes...

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Diskussion

Das Verständnis der biologischen Mechanismen, die neoplastischen Erkrankungen zugrunde liegen, ist für die Entwicklung wirksamerer Therapien und die Verbesserung der Patientenergebnisse von entscheidender Bedeutung. Bei Erkrankungen wie der pädiatrischen akuten lymphatischen Leukämie sind diese Untersuchungsansätze nicht nur für die Erhöhung der Heilungsraten relevant, sondern auch für Patienten von besonderem Wert, bei denen die Standardtherapien an die Grenzen der Therapieintensität un...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken dem Centro Infantil Boldrini und allen Patienten, die ihre Proben für die Studie gespendet haben. Manuella M. Hoff erhielt ein Stipendium der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) der São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes erhielt ein Produktivitätsstipendium des Nationalen Rates für technologische und wissenschaftliche Entwicklung (CNPq, 308399/2021-8). Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel des brasilianischen Gesundheitsministeriums im Rahmen des PRONON-Programms (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL  SpritzeBD #309628Organentnahme
10 ml steriles Wasser zur InjektionHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Arzneimittelrekonstitution
10-fache RBC-Lysis-LösungBioLegend#420302Verarbeitung von Mäuseblutproben
5-Kanal-ZellanalysatorBD Biosciences658226R1Durchflusszytometer 
70 uM ZellsiebFalcom#352350Organentnahme
Acepromazin-Malat Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Mäusenarkose
APC anti-human CD45 – Isotyp-Maus IgG1 – HI30-KlonBioLegend#304037Lymphozytengärbung
Asparaginase 10000 UAginase/Medac#88660100Mäusebehandlung
Brilliant-Violet 605 Anti-Maus CD45 – Isotyp-Maus IgG2 – 30-F11-KlonBioLegend#103139Lymphozytengärbung
DaunorubicinFarmarin#116880025Mäusebehandlung
DexamethasonAch&eakut;#00000066Mäusebehandlung
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich#589569Lymphozyten-Kryokonservierung
Einwegnadel – 0,60 x 25 mm (23G x 1') ’)BD#300388Organentnahme
Esterile Einweglanzette  Yancheng Huida Medizinische Instrumente https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Mäuseblutsammlung
EthylendiamintracetiksäureLebenstechnologien#15576-O28EDTA-Lösung
Fetales RinderserumCultilab#F083Lymphozyten-Kryokonservierung
Analyse von Flowzytometrie-Software – Version 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Flowzytometrie-Analyse
Analyse von Graphen und Plottsoftware – Version 9.5.1Dotmatikhttps://www.graphpad.com/featuresGraphenzeichnung und -analyse
Insulinspritze mit befestigter Nadel 1 ml FX 12,7 mm x 0,33 mmDescarpacke0342101Mäusetransplantation und Medikamentenverabreichung
Ketamin InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Mäusenarkose
Multifunktionale chirurgische Plattform für NagetiereKent Wissenschaftliche Gesellschafthttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Mäusechirurgische Eingriffe
PE anti-menschlicher CD19 – Isotyp Maus IgG1 – HIB19-KlonBioLegend#302208Lymphozytengärbung
KaliumchloridSigma-AldrichP3911-1KGPBS-Lösung
Kaliumphosphat-dibasischSigma-AldrichP0662-1KGPBS-Lösung
Reagenz zur LymphozytenisolierungCytiva#17-1440-02, Paket von 6 & Times; 100  MlLymphozytenisolierung aus entnommenen Organen
NatriumchloridSigma-AldrichS9888-1kgPBS-Lösung
Natriumphosphat-Dibasisk Sigma-AldrichS9763-1KGPBS-Lösung
Sterile anatomische Dissektions-Pinzette – 12 cm ABC 0170Lab Lí der120Chirurgische Mäuseeingriffe
Sterile Schere 12 cm – ABC 0321Lab Lí der136Chirurgische Mäuseeingriffe
VincristinLibbs#7896094208483Mäusebehandlung
Xylazin InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Mäusenarkose

Referenzen

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

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Patientenabgeleitetes XenograftArzneimittelresistenzDurchflusszytometrieperiphere Blutblastenminimale Residualerkrankungleuk mische Zellisolierung
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