Method Article

Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

DOI:

10.3791/68814

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February 20th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In This Article

Summary

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Wir führten eine neuartige Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine unvoreingenommene Bildgebung aller Zellen in Hirnproben auf Mesoskala ermöglicht und nahtlos in den Bildablauf der bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie an derselben Probe integriert werden kann.

Abstract

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Das Verständnis der strukturellen und funktionellen Beziehungen innerhalb komplexer neuronaler Netzwerke im Gehirn erfordert die Erstellung von Hirnatlassen, die sowohl ein breites Sichtfeld als auch eine subzelluläre Auflösung besitzen. Allerdings haben aktuelle optische und elektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren jeweils Einschränkungen, was es erschwert, alle Zellen in einer einzigen Probe abzubilden. Dieses Protokoll führt eine Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine ununterschiedliche optische Bildgebung aller Zellen in Hirnproben ermöglicht, die nach der Elektronenmikroskopie-Probenvorbereitung hergestellt wurden, und so einen vollständigen Hirnatlas aller neuronalen Zellen rekonstruiert. Darüber hinaus kann die OMLIT-Bildgebung nahtlos in den Bildgebungsworkflow der automatisierten Bandaufnahme-Ultramikrotomie-Rasterelektronenmikroskopie (ATUM-SEM) integriert werden. Dies ermöglicht es Forschern, vor der Elektronenmikroskopie-Bildgebung mesoskalige strukturelle Informationen von Zellen zu erhalten, was die präzise Auswahl interessanter Bereiche erleichtert und die für hochauflösende Elektronenmikroskopie-(EM)-Bildgebung erforderliche Fläche und Datenvolumen erheblich reduziert. Wir validierten die Genauigkeit und Kompatibilität dieser Methode in tatsächlichen Proben aus dem erwachsenen Maushirnrinde und demonstrierten so ihre breiten Anwendungsmöglichkeiten im Multi-Skala-Hirnatlas-Bau.

Introduction

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Eine umfassende Kartierung neuronaler Schaltkreise in zellulärer und subzellulärer Auflösung ist unerlässlich, um die Struktur und Funktion des Gehirns aufzudecken. Traditionelle optische Bildgebungsverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie1, fluoreszenzmikrooptische Schnitttomographie (fMOST)2,3,4 und das VISoR-System5 haben mesoskalale neuronale Bildgebung und funktionelle Bildgebung in vivo ermöglicht. Aufgrund ihrer Abhängigkeit von spärlicher Markierung gelingt es ihnen jedoch nicht, d....

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Protocol

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Alle Tierverfahren wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Universität für Wissenschaft und Technologie Chinas sowie den entsprechenden nationalen Vorschriften durchgeführt. Die Probenvorbereitung für die OMLIT-Bildgebung folgt demselben Protokoll wie bei konventioneller EM, und das spezifische Verfahren, das wir angewandt haben, wurde an anderer Stellebeschrieben 21. Kurz gesagt: Nach der Anästhesie wurden die Mäuse sequentiell transkardiell mit Natriumkakodylatpuffer, künstlicher Libramarkalflüssigkeit (ACSF) und schließlich einem Fixativ mit Glutaraldehyd und Paraformaldehyd perfundiert. Das Gehirn....

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Results

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Der gesamte Arbeitsablauf des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit der Vorbereitung verschiedener Sammelbänder. Abbildung 1 zeigt die drei im Protokoll genannten Bandtypen (von links nach rechts: Kapton, D-50 und CNT-beschichtete PET), die unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, wenn sie auf demselben Hintergrundsubstrat platziert werden. Nach der Probenvorbereitung und dem Blockschnitt sollten zunächst einige Abschni.......

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Discussion

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Hier entwickelten wir einen optischen Bildgebungsansatz namens OMLIT, der mesoskopische Bildgebung ermöglicht und mit bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie-Workflows kompatibel ist. Mit der OMLIT-Methode kann eine optische Mikroskopie eingesetzt werden, um mesoskopische strukturelle Merkmale aus Hirnproben zu erfassen, darunter Blutgefäße, Zellkörper, Zellkerne, große dendritische Äste und einige große myelinisierte Axone. Darüber hinaus kann OMLIT nahtlos in die serielle S.......

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Disclosures

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Keine Interessenkonflikte angegeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation of China (32271430, 62361166631) und dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie Chinas (2023YFF0715904) unterstützt. Wir danken dem Öffentlichen Technischen Zentrum des Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology sowie der Brain Imaging Facility des Instituts für Künstliche Intelligenz, Hefei Comprehensive National Science Center, für ihre Unterstützung bei OMLIT und serieller EM-Bildgebung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Klebeband3MB5005094008Doppelseitiger Klebstoff
AtomkraftmikroskopBrukerDimensionssymbol
Automatisches Ultradünnschnitt-Sammelsystem LehuaAutoCUTS II
Leitfähiges KlebebandTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Diamantmesser zum SchneidenDiatomeDUJ3530Diatome-Jumbo-Messer
Diamantmesser zum TrimmenDiatomeDTB90Glasmesser
ElektronenmikroskopZeissMultiSEM505Alternative: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-Bit) Open Sourcehttps://fiji.sc
GlastrimmmesserSelfmade
BleicitratLeicaT534/2
LichtmikroskopOlympus VS200Alternative: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Lichtmikroskop Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
PlasmareinigerYidon TechnologiesHydro-S4Alternativen: Ted Pella Pelco oder ein anderer Plasmareiniger auf der Werkbank
PolymerbandMeltonKaptonDie Website des Unternehmens ist nicht mehr zugänglich. Wir empfehlen Forschern, lokal verfügbare KAPTON-Bänder auszuprobieren.
PolymerbandTeijinPEThttps://www.teijin.com/
PolymerbandTeijinD-50https://www.teijin.com/
SiliziumwaferSaichi912303Der Wafer ist auf einer Seite poliert.
Sputter Coater LeicaACE600Alternative: Doppelkopf-Stotter, Yujie
UltramikrotomLeicaUC7Alternative: RMC PT-PC
UranylacetatEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-Bit)Howard Hughes Medizinisches Instituthttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite ist ein kostenloses Werkzeug zur manuellen Annotation und Segmentierung großer 3D-Mikroskopiedatensätze.
ZEN-Software (v3.2, 64-Bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron ....

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