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Methodenartikel

Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

703 Aufrufe

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DOI:

10.3791/68814

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20. Februar 2026

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1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir führten eine neuartige Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine unvoreingenommene Bildgebung aller Zellen in Hirnproben auf Mesoskala ermöglicht und nahtlos in den Bildablauf der bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie an derselben Probe integriert werden kann.

Zusammenfassung

Das Verständnis der strukturellen und funktionellen Beziehungen innerhalb komplexer neuronaler Netzwerke im Gehirn erfordert die Erstellung von Hirnatlassen, die sowohl ein breites Sichtfeld als auch eine subzelluläre Auflösung besitzen. Allerdings haben aktuelle optische und elektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren jeweils Einschränkungen, was es erschwert, alle Zellen in einer einzigen Probe abzubilden. Dieses Protokoll führt eine Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine ununterschiedliche optische Bildgebung aller Zellen in Hirnproben ermöglicht, die nach der Elektronenmikroskopie-Probenvorbereitung hergestellt wurden, und so einen vollständigen Hirnatlas aller neuronalen Zellen rekonstruiert. Darüber hinaus kann die OMLIT-Bildgebung nahtlos in den Bildgebungsworkflow der automatisierten Bandaufnahme-Ultramikrotomie-Rasterelektronenmikroskopie (ATUM-SEM) integriert werden. Dies ermöglicht es Forschern, vor der Elektronenmikroskopie-Bildgebung mesoskalige strukturelle Informationen von Zellen zu erhalten, was die präzise Auswahl interessanter Bereiche erleichtert und die für hochauflösende Elektronenmikroskopie-(EM)-Bildgebung erforderliche Fläche und Datenvolumen erheblich reduziert. Wir validierten die Genauigkeit und Kompatibilität dieser Methode in tatsächlichen Proben aus dem erwachsenen Maushirnrinde und demonstrierten so ihre breiten Anwendungsmöglichkeiten im Multi-Skala-Hirnatlas-Bau.

Einleitung

Eine umfassende Kartierung neuronaler Schaltkreise in zellulärer und subzellulärer Auflösung ist unerlässlich, um die Struktur und Funktion des Gehirns aufzudecken. Traditionelle optische Bildgebungsverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie1, fluoreszenzmikrooptische Schnitttomographie (fMOST)2,3,4 und das VISoR-System5 haben mesoskalale neuronale Bildgebung und funktionelle Bildgebung in vivo ermöglicht. Aufgrund ihrer Abhängigkeit von spärlicher Markierung gelingt es ihnen jedoch nicht, die gesamte zelluläre Population zu erfassen. Labelfreie optische Bildgebungstechniken wie funktionelle photoakustische Mikroskopie (fPAM)6,7, optische Kohärenztomographie (OCT)8 und quantitative Phasenmikroskopie9 hingegen bieten das Potenzial, alle Neuronen im Sichtfeld gleichzeitig sichtbar zu machen. Dennoch sind diese Methoden typischerweise durch geringe axiale Auflösung und geringe Bildtiefe begrenzt, und ihre Hardwarekomplexität erschwert die breite Anwendung im Hirnatlas-Bau. Im Gegensatz dazu werden Serienschnitt-Elektronenmikroskopietechniken (ssEM), darunter serielle Blockflächen-SEM (SBF-SEM)10,11, fokussierter Ionenstrahl SEM (FIB-SEM)12,13,14 und automatisierte Band-Sammel-Ultramikrotomie SEM (ATUM-SEM)15,16,17 , dichte synaptische Konnektivitätsnetzwerke mit Nanometerauflösung offenbaren und so wesentliche Werkzeuge für hochauflösende Konnektomik bereitstellen. Diese Techniken leiden jedoch unter niedrigem Durchsatz, langen Erfassungszeiten, begrenzten Sichtfeldern sowie hohen Datenverarbeitungs- und Hardwarekosten18.

Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Bildgebungsmethode namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die eine kostengünstige und hochdurchsatzfähige Lösung für ununterschiedliche, kontrastreiche, weitfeldige Bildgebung aller Zellen auf ultradünnen Schnitten bietet und so eine Submikron-Auflösung über große Gewebeflächen erreicht. Gleichzeitig ist OMLIT von Natur aus kompatibel mit Serialschnitt-SEM-Workflows: Vor der hochauflösenden Elektronenmikroskopie liefert OMLIT strukturelle Informationen zu denselben Schnitten, was eine präzise ROI-Navigation ermöglicht und die für die nachfolgende EM-Bildgebung erforderliche Fläche sowie Datenvolumen erheblich reduziert. OMLIT bietet einzigartige Vorteile auf der Ebene der mesoskaligen Bildgebung und dient als entscheidende Brücke, die neuronale strukturelle Karten über verschiedene räumliche Skalen hinweg verbindet. Seine zerstörungsfreie Natur bewahrt das Potenzial für zukünftige Integration mit spezifischen Markierungsstrategien, wie etwa der Verwendung osmiumresistenter fluoreszierenderProteine 19 für die Probenvorbereitung und Bildgebung. Diese Methode ermöglicht eine mesoskalige Bildgebung ausgewählter Hirnregionen und ermöglicht so eine schnelle Erfassung neuronaler Morphologie, Menge, Verteilung und Dichte in den Regionen. Es erleichtert außerdem die quantitative Charakterisierung axonaler Projektionen und der Verteilung von Dendriten zwischen Neuronen in verschiedenen Hirnbereichen. Für bestimmte Bereiche von Interesse in den Bildgebungsergebnissen können ultrastrukturelle Details vor Ort mittels Elektronenmikroskopie weiter untersucht werden.

Das Bildgebungsprinzip von OMLIT wurde in der Arbeit von Hao Fan20 beschrieben. Kurz gesagt: Während der Bildgebung bilden der ultradünne Schnitt, die beschichtete Schicht, das Sammelband, das leitfähige Band und der Wafer eine mehrschichtige Dünnschichtstruktur. Wenn eine ebene Welle mit dieser Struktur interagiert, werden reflektierte Wellen an verschiedenen Grenzflächen erzeugt und überlappen sich im Detektionsraum, was zu optischen Interferenzen aufgrund von Unterschieden in Reflexion, Brechungsindex und Absorption zwischen den Materialien führt. Ein auf diesem Prinzip entwickeltes MATLAB-basiertes Simulationsprogramm zeigte eine angemessene Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen.

Das OMLIT-Bildgebungsschema kann je nach Bandverarbeitungsstrategie in zwei Typen eingeteilt werden. Die erste ist die Hochreflektivitätsstrategie, bei der Metalle wie Cr, Cu, Al oder Ag verwendet werden, um die Bandoberfläche zu beschichten, was zu höheren optischen Intensitäten in zytoplasmatischen Bereichen und harzgefüllten Gefäßlumen im Vergleich zu den umliegenden Bereichen führt. Die zweite ist die Niedrigreflektivitätsstrategie, bei der unbeschichtetes Kapton-Band, D-50-Tape oder CNT-beschichtetes PET-Tape verwendet werden. In diesem Fall ist das Ergebnis der optischen Bildgebung das Gegenteil des ersten: Harzreiche, membranfreie Regionen (z. B. Zytoplasma und Gefäßlumen) treten mit geringerer Intensität auf.

Wir fassen systematisch zusammen und etablieren standardisierte Protokolle, die auf zwei unterschiedliche Bildvormungsstrategien zugeschnitten sind. Die hier vorgestellten Protokolle bieten umfassende und detaillierte experimentelle Verfahren. Zusätzlich werden häufige Probleme, die während der Experimente auftreten, zusammen mit vorgeschlagenen Lösungen zusammengefasst. Wir konzentrieren uns darauf, einen Datensatz des Mauskortex mit der Low-Reflectivity-Strategie (805 × 857,5 × 11,66 μm³) zu präsentieren, der die charakteristischen Merkmale und Vorteile des OMLIT-Bildgebungsansatzes veranschaulicht.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Universität für Wissenschaft und Technologie Chinas sowie den entsprechenden nationalen Vorschriften durchgeführt. Die Probenvorbereitung für die OMLIT-Bildgebung folgt demselben Protokoll wie bei konventioneller EM, und das spezifische Verfahren, das wir angewandt haben, wurde an anderer Stellebeschrieben 21. Kurz gesagt: Nach der Anästhesie wurden die Mäuse sequentiell transkardiell mit Natriumkakodylatpuffer, künstlicher Libramarkalflüssigkeit (ACSF) und schließlich einem Fixativ mit Glutaraldehyd und Paraformaldehyd perfundiert. Das Gehirn wurde vorsichtig entfernt, und etwa 1 × 1 × 1 mm³ Gewebeblöcke wurden durchschnitten. Die Proben wurden dann chemisch fixiert, einem seriellen Schwermetallfärben unterzogen, dehydriert und in Harz eingebettet. Der allgemeine Arbeitsablauf des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf. (A) Im Protokoll erwähnte Sammelbänder (von links nach rechts: Polyimid, D-50 und CNT-beschichtete PET). (B) Serielle Sektionierung und Sammlung der geschnittenen Proben. (C) Montage von Bändern mit gesammelten Abschnitten auf einem kreisförmigen Siliziumwafer. (D) Lichtmikroskopie-Bildgebung, Maßstabsleiste 100 μm. (E) Kohlenstoffbeschichtung. (F) Die Elektronenmikroskopie-Bildgebung entspricht dem in Abbildung 1D beschriebenen Bereich, Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Bandvorbereitung

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einem Reinraum durchgeführt werden, um eine Bandkontamination durch Staub zu verhindern.

  1. Hochreflektivitätsstrategie
    1. Wählen Sie Kapton (im Folgenden Polyimidband mit 50 μm Dicke genannt) oder Panlite-Film (im Folgenden D-50, 50 μm Dicke) und montieren Sie sie auf das motorisierte Wicklungssystem. Hier wird das Polyimidband als Beispiel verwendet.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde ein motorisiertes Wickelgerät verwendet, das von einem Schrittmotor gesteuert wird, der über eine Arduino-Platine gesteuert wird, um das Band von einer Spule zur anderen durch den Sputter-Plasmakegel zu leiten. Um die zunehmende Liniengeschwindigkeit der Bandübertragung durch die Ansammlung von Band auf der treibenden Spule und den Durchmesser der Aufspule zu erhöhen, wurde ein Programm geschrieben, um die Winkelgeschwindigkeit der Aufspule nach jeder 360°-Drehung seriell abzustimmen.
    2. Einen gleichmäßigen Dünnfilm aus Cr (oder anderen Metallen wie Al, Ag oder Cu) mit einem Magnetron-Sputtersystem (Doppelkopf-Sputter) auf die Bandoberfläche aufgetragen. Positionieren Sie das Band in einer Entfernung von 80 mm vom stotternden Ziel für eine optimale Ablage. Der Prozess wird unter Gleichstrom und bei einem Druck von 1,0 Pa durchgeführt, der durch 99,99 % Argongas reguliert wird.
    3. Stellen Sie die Bandwicklungsgeschwindigkeit auf 0,6 mm/s ein, um eine Metallbeschichtungsdicke von 50 nm zu erreichen. Nach der Abscheidung wird die Kammer langsam auf Raumtemperatur (RT) unter hohem Vakuum abgekühlt, um die Beschichtungsspannung zu minimieren.
      HINWEIS: Die optimale Beschichtungsdicke für dasselbe Band kann je nach verwendetem Metall variieren. Passen Sie die Übersetzungsgeschwindigkeit des Bandes an, um verschiedene Beschichtungsdicken wie 50, 70, 100, 150 und 200 nm zu erreichen.
    4. Bewerten Sie die Dicke und Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit einem Stylus-Profiler, einer Atomkraftmikroskopie oder einer Rasterelektronenmikroskopie.
    5. Reinigen und machen Sie das Band hydrophil mit einem Plasmareiniger mit 80 W Leistung und einer Bewegungsgeschwindigkeit von 7 mm/s. Nach der Behandlung sollten sich Wassertropfen, die auf der Bandoberfläche aufgetragen werden, schnell zu einem dünnen Film ausbreiten (Abbildung 2A).
  2. Strategie mit niedriger Reflexion
    HINWEIS: Dieses Protokoll erlaubt die Verwendung entweder von D-50-Band oder einem kommerziellen Kohlenstoffnanoröhren-(CNT)-beschichtetem Polyethylenterephthalat-(PET)-Band. Da letzterer während der Elektronenmikroskopie-Bildgebung etwas Hintergrundrauschen erzeugen kann – wenn auch nicht stark – könnte dies potenziell die Segmentierung von elektromagnetischen Bildern beeinflussen. Daher verwendet die folgende Beschreibung weiterhin das D-50-Band als Beispiel.
    1. Bereiten Sie die D-50-Filme vor und schneiden Sie das gesamte Blatt in Bänder von etwa 7 mm Breite. Verwenden Sie eine freiliegende Seite des Bandes zum Sammeln von Abschnitten, während Sie die andere Seite mit einer Schicht matter Folie schützen, um Kratzer und Kontaminationen zu vermeiden. Entfernen Sie die matte Folie während des folgenden Montageschritts des Siliziumwafers.
    2. Für größere Stückzahlen verbinden Sie verschiedene D-50-Bandabschnitte miteinander. Sichern Sie die Verbindungen zwischen den Bandsegmenten mit doppelseitigem Klebeband.
      HINWEIS: Beim Ankleben von Klebebandsegmenten sollten Sie sicherstellen, dass das führende Band das nachlaufende von oben nach unten über das doppelseitiges Band überlappt. Minimieren Sie den Klebebereich und lassen Sie einen Rand entlang der Bandkanten, um zu verhindern, dass der Kleber beim Wickeln des Bandes herausgedrückt wird, was das Band kontaminieren kann (Abbildung 2B).
    3. Reinigen und machen Sie das Band hydrophil mit einem Plasmareiniger, folgen Sie demselben Verfahren und erzielen Sie den zuvor beschriebenen Effekt.
      HINWEIS: Abgesehen von der Metallbeschichtung und dem Kohlenstoffstottern sind die anderen Schritte in beiden Strategien gleich.

2. Serielle ultradünne Sektionierung und bandbasierte Sammlung

  1. Mit einer kleinen Schleifmaschine oder einem ähnlichen Schneidwerkzeug wird das Harz an der Seite der Probe grob zugeschnitten und das umliegende Blankharz entfernt, um die Probefläche freizulegen.
  2. Setzen Sie den mit Harz eingebetteten Block in den Probenhalter und ziehen Sie den Knopf des Halters fest, um den Block fest zu sichern.
  3. Montiere den Probenhalter am beweglichen Arm des Mikrotoms. Installieren Sie ein Glasmesser oder ein Diamant-Trimmmesser (im 45°-Winkel) am Messerhalter. Unter dem Mikroskop schneiden Sie die Probenoberfläche in eine Pyramidenform und glätten Sie die Oberfläche.
    HINWEIS: Die vorderen und hinteren Kanten des geschnittenen Probenblocks sollten so parallel wie möglich verlaufen (siehe Abbildung 2C).
  4. Schneiden und glätten Sie die vier Seiten des Probenblocks, um überschüssiges Harz an den Rändern zu entfernen und so mögliche Kollisionen mit dem Diamantmesser zu vermeiden. Drehen Sie den Knopf, um sicherzustellen, dass die vorderen und hinteren Kanten des zugeschnittenen Blocks in horizontaler Position ausgerichtet sind.
  5. Nehmen Sie das Trimmmesser heraus und ersetzen Sie es durch ein Diamantmesser, das im 45°-Winkel angelegt ist. Stellen Sie den Neigungswinkel der Mikrotombasis auf 6° ein. Bewegen Sie den Messerhalter langsam mit dem Knopf, bis die Vorderkante des Diamantmessers 1–2 mm von der Probeoberfläche entfernt ist.
  6. Beobachte das helle Band zwischen der Probenoberfläche und der Messerkante und passe den Neigungswinkel so an, dass das Band von oben nach unten und seitlich gleichmäßig ist. Das hilft sicherzustellen, dass der erste Abschnitt die gesamte Probenoberfläche umfasst und nicht nur eine Ecke.
  7. Injizieren Sie destilliertes Wasser in die Rille des Diamantmessers, damit der Flüssigkeitsstand steigt und die Klinge nass bleibt. Dann benutze eine Spritze, um etwas Wasser zu entfernen, bis der Flüssigkeitsstand sinkt und die Reflexion silbrig erscheint.
  8. Stellen Sie die Schnittdicke (Zuführung), die Schneidgeschwindigkeit und das Schneidfenster in der Steuereinheit ein. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf 0,6 mm/s ein und stellen Sie die Schnittdicke auf 60 nm ein (die genaue Geschwindigkeit und Dicke hängt von der Probenqualität ab).
  9. Beginnen Sie mit der Sektionierung. Sobald das Mikrotome stabil läuft und einheitliche Abschnitte hergestellt sind, wird der Schnittprozess pausiert. Benutze einen feinen Pinsel, um die geschnittenen Abschnitte und eventuelle Ablagerungen zu entfernen.
  10. Installieren Sie sowohl die beschichtete Bandspule als auch eine leere Aufnahmespule auf das automatische ultradünne Schnitt-Sammelsystem. Sichern Sie den Verriegelungsmechanismus und führen Sie einen Probelauf durch, um sicherzustellen, dass das Band sich mit konstanter Geschwindigkeit gleichmäßig bewegt und ordnungsgemäß auf der leeren Spule aufgenommen wird.
  11. Tauchen Sie den Sammelkopf des Bandsammelgeräts in das Wasserbad des Diamantmessers. Stellen Sie die Position des Sammelkopfes so ein, dass er parallel zur Messerkante ist, in einem Abstand von 1,5-fach der Stücklänge der Probe, und stellen Sie sicher, dass die Schnittabschnitte glatt auf das Band gesammelt werden. Sichern Sie das Sammelgerät und setzen Sie die Sektionierung fort, während Sie gleichzeitig das Bandsammelgerät ausführen.
  12. Nachdem eine ausreichende Anzahl kontinuierlicher Schnitte gesammelt wurde, pausieren Sie den Schnittvorgang. Schneiden Sie das Band in dem Bereich ab, in dem keine Abschnitte gesammelt wurden, und lassen Sie das Bandsammelgerät laufen, bis das gesamte verbleibende Band auf der Spule gesammelt ist.
  13. Entferne die Spule mit den gesammelten Abschnitten und stelle sie in einen elektronischen Trocknungsofen. Reinigen Sie das Tape-Sammelgerät und das Mikrotom und bringen Sie alle Zubehörteile an ihren richtigen Platz zurück.

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Abbildung 2: Vorbereitungen vor der Schnittteilung. (A) Wassertropfen auf der Oberfläche des D-50-Bandes vor (oben) und nach (unten) hydrophiler Behandlung. (B) Schaltplanansichten von oben und seitlich des Übergangsbereichs des D-50-Bandes. Blau: D-50 Band; Orange: doppelseitiger Kleber; Grüner Pfeil: Bandbewegungsrichtung. (C) Frontalansicht der Probe nach dem Trimmen, mit parallelen oberen und unteren Kanten. (D) Automatisches Bandsammelgerät. a: Bandspule für das D-50-Bandausfüttern; b: Bandspule zur Bandabfindung; Roter Pfeil: Richtung der Bandbewegung. (E) Position des Sammelkopfes am automatischen Bandsammelgerät. Das gelbe Feld unten rechts zeigt einen frisch geschnittenen Abschnitt an, der vom Gerät gesammelt werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Montage auf einem Siliziumwafer

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsplatz sauber ist, um eine Verunreinigung des Bandes durch Staub während der folgenden Schritte zu vermeiden.

  1. Verwenden Sie einen 4-Zoll-runden Siliziumwafer, vorgereinigt und hydrophilisiert in einem Plasmabehandlungssystem (bei 80 W Leistung, 3 Min).
  2. Zieh saubere Handschuhe an, lege den Siliziumwafer auf eine ebene Fläche und schneide ein Stück doppelseitiges, leitfähiges Carbonband auf eine passende Länge (mit 2–3 cm Überhang an beiden Enden). Lösen Sie die weiße Schutzschicht von einer Seite des doppelseitigen leitenden Bandes ab und tragen Sie sie von oben nach unten auf den Siliziumwafer auf.
    HINWEIS: Die beiden Seiten des leitenden Bandes sollten etwa 2 mm voneinander entfernt stehen, und die Ränder des Bandes sollten auf dem Siliziumwafer sichtbar sein. Für ein 25 mm breites, doppelseitiges leitfähiges Band können drei Bandsegmente auf einen 4-Zoll-Siliziumwafer aufgetragen werden.
  3. Zeichnen Sie eine Umrisse des 4-Zoll-Siliziumwafers auf der Werkbank und markieren Sie die ungefähre Länge jedes Bandsegments, das auf den Wafer aufgetragen wird. Schneiden Sie das Band, das die Abschnitte gesammelt hat, entsprechend den zuvor markierten Längen.
    HINWEIS: Das geschnittene Band darf die Kante des Siliziumwafers nicht überschreiten und nicht in die Abschnitte schneiden.
  4. Lösen Sie die transparente Schutzfolie vom doppelseitigen leitenden Band ab und entfernen Sie beim D-50-Tape an dieser Stelle die Schutzfolie auf der Rückseite des Bandes. Legen Sie das Band parallel zum doppelseitigen leitenden Band an. Tragen Sie bis zu drei Klebebandstücke auf jedes Stück doppelseitiges leitfähiges Klebeband auf.
    HINWEIS: Um das Risiko zu verringern, dass das D-50-Band falsch ausgerichtet ist oder durch Staub kontaminiert ist, bedecken Sie einen Teil des leitenden Bandes mit der zuvor abgetrennten transparenten Folie, sodass nur ein kleiner Teil des leitenden Bandes freibleibt, um das Ende des D-50-Bandes zu befestigen. Dies erleichtert die Anpassung der Bandrichtung. Anschließend wird die verbleibende transparente Folie langsam abgezogen, sodass der Rest des D-50-Bandes sanft abfällt und am leitenden Band haftet.
  5. Nachdem das Band montiert wurde, können sich zwischen dem Band und dem leitenden Band Luftblasen bilden, die den anschließenden Bildgebungsprozess stören können. Platzieren Sie den Siliziumwafer in eine Vakuumkammer (oder andere Vakuumgeräte) und wenden Sie ein Vakuum an. Nachdem der Vakuumvorgang abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Luftblasen verschwunden sind.

4. Nachfärbung

  1. Bereiten Sie 4 % Uranylacetat und 3 % Bleicitrat vor und erhitzen Sie sie mit einem Wasserbadetopf auf 50 °C vor.
    VORSICHT: Uranylacetat ist radioaktiv und hat eine erhebliche Toxizität für Leber und Nieren. Bleicitrat kann eine Bleivergiftung verursachen, die das Nervensystem, die Nieren und das hämatopoetische System beeinträchtigt. Die Arbeit mit diesen Reagenzien sollte mit einer Abzugshaube durchgeführt werden, und geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), darunter ein Laborkittel, Nitrilhandschuhe, Maske und Schutzbrille, sollte getragen werden. Bei Haut- oder Blickkontakt waschen Sie sich sofort mit großen Mengen Wasser, melden Sie sich bei den Sicherheitskräften im Labor und suchen Sie medizinische Hilfe auf.
  2. Platzieren Sie den Siliziumwafer, der abgesaugt wurde und frei von Blasen ist, in ein Plasma-Hydrophilisationssystem zur Hydrophilisierung und Reinigung.
  3. Mit einer 10-ml-Spritze ohne Nadel hängen Sie einen 0,22-μm-Spritzenfilter an und filtern Sie das 4%ige Uranylacetat. Lassen Sie die Lösung auf den Abschnitt fallen, bis die gesamte Oberfläche des Siliziumwafers bedeckt ist, und warten Sie dann 3 Minuten.
  4. Waschen Sie 3 Minuten mit destilliertem Wasser, wiederholen Sie sich dreimal und föhnen Sie anschließend die Probenoberfläche mit Stickstoff.
  5. Mit einer 10-ml-Spritze ohne entfernte Nadel befestigen Sie einen 0,22-μm-Spritzenfilter und filtern Sie das 3%ige Bleicitrat. Lassen Sie die Lösung auf den Abschnitt fallen, bis die gesamte Oberfläche des Schnitts auf dem Siliziumwafer bedeckt ist, und warten Sie dann 5 Minuten.
  6. Waschen Sie 3 Minuten mit destilliertem Wasser, wiederholen Sie sich dreimal und föhnen Sie anschließend die Probenoberfläche mit Stickstoff.

5. Datenerfassung

  1. Optische Mikroskopie
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Research Slide Scanner (VS200, Olympus) als Beispiel für die optische Mikroskopie verwendet. Andere Mikroskope, wie das Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Deutschland), eignen sich ebenfalls für die hier beschriebene optische Bildgebung. Die Schritte für andere optische Mikroskope sind im Allgemeinen gleich.
    1. Legen Sie den Siliziumwafer auf die Stufe des optischen Mikroskops und sichern Sie ihn mit rücksichtsfreiem Klebeband.
    2. Verwenden Sie ein 5x-Objektivobjektiv, um ein Übersichtsbild des Siliziumwafers, des Bandes und der Probe zu erhalten.
    3. Im Übersichtsbild umrisse jeden Abschnitt und sortiere sie, dann füge Fokuspunkte und Belichtungspunkte hinzu, um eine automatische Bildgebung mit 20- oder 50-facher Vergrößerung über den gesamten Siliziumwafer mit allen Abschnitten durchzuführen.
    4. Nach Abschluss der Aufnahme speichern Sie die Bilder und prüfen Sie dann die Bildqualität. Wenn es unscharfe oder schlechte Bilder gibt, fokussieren Sie neu und bilden Sie es neu.
  2. Elektronenmikroskopie
    HINWEIS: Mehrere Arten von Elektronenmikroskopen können kontinuierliche Bildgebung ultradünner Schnitte auf Siliziumwafern durchführen. Hier wird der Multibeam 505 (Zeiss) als Beispiel verwendet.
    1. Führen Sie eine Kohlenstoffbeschichtung auf der Probeoberfläche mit einem Hochvakuum-Sputter-Beschichtungsmittel mit einer Kohlenstoffdicke von 5,7 nm durch.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann bei Bändern übersprungen werden, die mit einer hochreflektiven Strategie metallbeschichtet oder mit Kohlenstoffnanoröhren (CNT) in einer niedrigreflektiven Strategie beschichtet wurden.
    2. Verwenden Sie ein optisches Mikroskop (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss), um die optische Navigationskarte des Siliziumwafers zu erfassen.
    3. Platzieren Sie den Siliziumwafer in die Probekammer des SEM. Verknüpfen Sie die optische Navigationskarte mit dem Elektronenmikroskopbild, indem Sie die beiden verschachtelten L-förmigen Marker auf der Probenstufe nacheinander identifizieren.
    4. Verwenden Sie das SAT-Modul in der Mikroskopiesoftware (v3.2, 64-Bit), um die Schnittpositionen und Bildgebungsbereiche anhand der optischen Navigationskarte halbautomatisch zu identifizieren.
    5. Setze die Bildpixelgröße auf 4 nm, die Verweilzeit auf 0,8 μs, Fokuspunkte und -positionen sowie Speicherorte.
    6. Beginnen Sie mit kontinuierlicher Bildgebung.

6. Datenverarbeitung

HINWEIS: Das 2D-Stitching von OMLIT-Bildern wird automatisch von der Software durchgeführt. Für die großflächige 3D-Registrierung und Segmentierung von OMLIT-Bildern stehen andere, leistungsfähigere KI-Algorithmen zur Verfügung. Hier werden, um den meisten Laboren die Überprüfung des Prozesses zu erleichtern, das Nähen, die Registrierung und Segmentierung mit Fiji (v1.54p, 64-Bit) und VAST (v1.5.0, 64-Bit) demonstriert.

  1. Öffnen Sie den Bilddatensatz in Fiji, indem Sie den Ordner mit allen Bilddateien in die Fiji-Oberfläche ziehen, und wählen Sie bei Aufforderung Virtual Stack aus.
  2. Verwenden Sie das Rechteck-Tool, um den Bereich von Interesse (ROI) auszuwählen, und schneiden Sie dann den Datensatz über Image > Crop zu.
  3. Richten Sie den Bildstack mit dem Register Virtual Stack Slices-Plugin aus (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
  4. Speichere den ausgerichteten Datensatz im TIFF-Format (Datei > Speichere als > Tiff).
  5. Importieren Sie den TIFF-Bildstapel in VAST22 mit Import > Import Image Volume from Images in . VSV-Datei.
    HINWEIS: Für ein ausführlicheres Tutorial siehe bitte die Website: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
  6. Indem Sie ein externes Tablet anschließen, verwenden Sie das Pinselwerkzeug im Zeichensegment-Modus , um manuelle Segmentierung und Nachverfolgung zu starten (verwenden Sie die Tasten A und Z, um schnell zwischen Bildschnitten zu navigieren).
  7. Visualisieren Sie die segmentierte Struktur in 3D mit Window > 3D Viewer > View > Update.
  8. Speichere die Segmentierungsergebnisse über File > Save Segmentation.

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Ergebnisse

Der gesamte Arbeitsablauf des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit der Vorbereitung verschiedener Sammelbänder. Abbildung 1 zeigt die drei im Protokoll genannten Bandtypen (von links nach rechts: Kapton, D-50 und CNT-beschichtete PET), die unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, wenn sie auf demselben Hintergrundsubstrat platziert werden. Nach der Probenvorbereitung und dem Blockschnitt sollten zunächst einige Abschni...

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Diskussion

Hier entwickelten wir einen optischen Bildgebungsansatz namens OMLIT, der mesoskopische Bildgebung ermöglicht und mit bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie-Workflows kompatibel ist. Mit der OMLIT-Methode kann eine optische Mikroskopie eingesetzt werden, um mesoskopische strukturelle Merkmale aus Hirnproben zu erfassen, darunter Blutgefäße, Zellkörper, Zellkerne, große dendritische Äste und einige große myelinisierte Axone. Darüber hinaus kann OMLIT nahtlos in die serielle S...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation of China (32271430, 62361166631) und dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie Chinas (2023YFF0715904) unterstützt. Wir danken dem Öffentlichen Technischen Zentrum des Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology sowie der Brain Imaging Facility des Instituts für Künstliche Intelligenz, Hefei Comprehensive National Science Center, für ihre Unterstützung bei OMLIT und serieller EM-Bildgebung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Klebeband3MB5005094008Doppelseitiger Klebstoff
AtomkraftmikroskopBrukerDimensionssymbol
Automatisches Ultradünnschnitt-Sammelsystem LehuaAutoCUTS II
Leitfähiges KlebebandTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Diamantmesser zum SchneidenDiatomeDUJ3530Diatome-Jumbo-Messer
Diamantmesser zum TrimmenDiatomeDTB90Glasmesser
ElektronenmikroskopZeissMultiSEM505Alternative: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-Bit) Open Sourcehttps://fiji.sc
GlastrimmmesserSelfmade
BleicitratLeicaT534/2
LichtmikroskopOlympus VS200Alternative: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Lichtmikroskop Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
PlasmareinigerYidon TechnologiesHydro-S4Alternativen: Ted Pella Pelco oder ein anderer Plasmareiniger auf der Werkbank
PolymerbandMeltonKaptonDie Website des Unternehmens ist nicht mehr zugänglich. Wir empfehlen Forschern, lokal verfügbare KAPTON-Bänder auszuprobieren.
PolymerbandTeijinPEThttps://www.teijin.com/
PolymerbandTeijinD-50https://www.teijin.com/
SiliziumwaferSaichi912303Der Wafer ist auf einer Seite poliert.
Sputter Coater LeicaACE600Alternative: Doppelkopf-Stotter, Yujie
UltramikrotomLeicaUC7Alternative: RMC PT-PC
UranylacetatEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-Bit)Howard Hughes Medizinisches Instituthttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite ist ein kostenloses Werkzeug zur manuellen Annotation und Segmentierung großer 3D-Mikroskopiedatensätze.
ZEN-Software (v3.2, 64-Bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

Referenzen

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  3. Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
  4. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  5. Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
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