PCR-fluoreszierende Sondenerkennung von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii

Summary

Hier präsentieren wir ein klinisches Testprotokoll, das auf der PCR-Fluoreszenzsonde-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii basiert.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein standardisiertes Verfahren zur qualitativen Detektion von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii in klinischen Sputumproben mit einem PCR-fluoreszenten, fluoreszenten Probe-basierten Nukleinsäure-Nachweiskit. Das Verfahren umfasst klinische Probenentnahme, die Vorbehandlung der alkalischen Verflüssigung, die automatische Nukleinsäureextraktion und die Echtzeit-PCR-Detektion im multiplexischen Bereich. Aspergillus spp., C. neoformans und P. jirovecii werden mit zielspezifischen fluoreszierenden Sonden (FAM-, VIC- und CY5-Kanäle) nachgewiesen, wobei ein interner Kontrollkanal (ROX-Kanal) zur Qualitätssicherung integriert ist. Die Gültigkeit des Tests und die Interpretation der Probenergebnisse basieren auf definierten Zyklus-Schwellenwerten (Ct). Eine positive Regelung muss S-förmige Verstärkungskurven mit Ct ≤ 33,7 in allen Kanälen aufweisen, während die negative Regelung keine Verstärkung zeigen darf. Bei klinischen Proben zeigt ein Ct-Wert ≤ 33,7 im FAM-Kanal auf Positivität für Aspergillus-Arten hin, und ein Ct-Wert ≤ 36 im VIC- oder CY5-Kanal auf Positivität für C. neoformans bzw. P. jirovecii.

Introduction

Invasive Pilzinfektionen, wie die von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii, stellen eine erhebliche Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar und führen zu hoher Morbidität und Mortalität. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist entscheidend, um eine angemessene Antimykotentherapie einzuleiten und die klinischen Ergebnisse zu verbessern¹. Konventionelle diagnostische Methoden, einschließlich Kultur, Mikroskopie und Antigennachweis, haben bemerkenswerte Einschränkungen. Die Kultur ist zeitaufwendig und weist eine geringe Sensitivität auf, die Mikros....

Protocol

Die Verwendung klinischer Proben wurde vom zuständigen Ethikausschuss genehmigt (Genehmigungsnummer: ZYS-GCP-2025006). Alle Teilnehmer gaben eine breite informierte Zustimmung zur Nutzung ihrer Daten und Proben in der Forschung. Alle Reagenzien und Verbrauchsgüter, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind im Table of Materials aufgeführt.

1. Probenentnahme

1. Sammeln Sie 3–5 ml Sputum oder bronchoalveolare Spülflüssigkeit in sterilen Behältern und reichen Sie sie umgehend zur Untersuchung ein.

2. Reagenzvorbereitung

Results

Repräsentative Verstärkungskurven, die mit diesem multiplex-fluoreszenten Probe-PCR-Test erhalten wurden, sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Die Validität des Tests wurde anhand vordefinierter Kontrollkriterien bestimmt. In einem gültigen Durchlauf erzeugte die positive Steuerung charakteristische S-förmige Verstärkungskurven in den FAM-, VIC-, CY5- und ROX-Kanälen, mit Zyklusschwellenwerten (Ct) ≤ 33,7 in allen De.......

Discussion

Das in dieser Studie etablierte Multiplex-Echtzeit-PCR-Protokoll bietet ein standardisiertes Verfahren zur gleichzeitigen und schnellen Detektion von drei wichtigen invasiven Pilzpathogenen (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii) in klinischen Sputumproben. Diese Methode ermöglicht den direkten Nachweis von Pathogen-DNA aus klinischen Proben. Im Gegensatz zu traditionellen diagnostischen Ansätzen wie Kultur, Mikroskopie oder serologischen Antigentests unter.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & mu; L Filter-Tip sterile verlängerte Pipettenspitzen (gerackt)	Xiaorui Biotechnologie	S20221126
1000 & mu; L-Sterile Pipettenspitzen	Jiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd	241101
200 & mu; L Extended Filter sterile Pipettenspitzen	Xiaorui Biotechnologie	241001
Lyseröhren	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	F1040
Nukleinsäure-Nachweis-Kit für Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co.	CT8143-48T
Nukleinsäureextraktionsreagenz	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	CN8053-B40T
Probenverdünnungspuffer	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	SP7065