PCR-fluoreszierende Sondenerkennung von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii

Summary

Hier präsentieren wir ein klinisches Testprotokoll, das auf der PCR-Fluoreszenzsonde-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii basiert.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein standardisiertes Verfahren zur qualitativen Detektion von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii in klinischen Sputumproben mit einem PCR-fluoreszenten, fluoreszenten Probe-basierten Nukleinsäure-Nachweiskit. Das Verfahren umfasst klinische Probenentnahme, die Vorbehandlung der alkalischen Verflüssigung, die automatische Nukleinsäureextraktion und die Echtzeit-PCR-Detektion im multiplexischen Bereich. Aspergillus spp., C. neoformans und P. jirovecii werden mit zielspezifischen fluoreszierenden Sonden (FAM-, VIC- und CY5-Kanäle) nachgewiesen, wobei ein interner Kontrollkanal (ROX-Kanal) zur Qualitätssicherung integriert ist. Die Gültigkeit des Tests und die Interpretation der Probenergebnisse basieren auf definierten Zyklus-Schwellenwerten (Ct). Eine positive Regelung muss S-förmige Verstärkungskurven mit Ct ≤ 33,7 in allen Kanälen aufweisen, während die negative Regelung keine Verstärkung zeigen darf. Bei klinischen Proben zeigt ein Ct-Wert ≤ 33,7 im FAM-Kanal auf Positivität für Aspergillus-Arten hin, und ein Ct-Wert ≤ 36 im VIC- oder CY5-Kanal auf Positivität für C. neoformans bzw. P. jirovecii.

Introduction

Invasive Pilzinfektionen, wie die von Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii, stellen eine erhebliche Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar und führen zu hoher Morbidität und Mortalität. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist entscheidend, um eine angemessene Antimykotentherapie einzuleiten und die klinischen Ergebnisse zu verbessern¹. Konventionelle diagnostische Methoden, einschließlich Kultur, Mikroskopie und Antigennachweis, haben bemerkenswerte Einschränkungen. Die Kultur ist zeitaufwendig und weist eine geringe Sensitivität auf, die Mikroskopie vermisst die Artenidentifikation und ist vom Operator abhängig, während Antigentests (z. B. Galactomannan, β-D-Glucan) Kreuzreaktivität und inkonsistente Leistung zeigen können. Molekulare Diagnostik, insbesondere Echtzeit-PCR, kann einige dieser Lücken schließen, indem sie schnellere Bearbeitungszeiten und das Potenzial für hohe Empfindlichkeit und Spezifität bieten. Fortschritte in der multiplexen PCR ermöglichen zudem den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Krankheitserreger aus einer einzigen Probe, was die diagnostische Effizienz verbessert.

Dieses Protokoll beschreibt einen multiplexen fluoreszenten Probe-PCR-Test zur qualitativen Erkennung von DNA von Aspergillus spp., C. neoformans und P. jirovecii in menschlichen Sputumproben, indem konservierte Regionen des 18S rRNA-Gens (Aspergillus spp.), des ITS-Gens (C. neoformans) und des mtLSU rRNA-Gens (P. jirovecii) gezielt werden. Zu den wichtigsten Merkmalen dieser Methode gehören die definierte analytische Sensitivität: Der Nachweisgrenzwert für Aspergillus spp., C. neoformans und P. jirovecii beträgt 1.500 Kopien/mL; Primer/Probe-Spezifität: Zielspezifische Primer und Sonden minimieren die Kreuzreaktivität mit menschlicher DNA oder anderer häufiger Flora; robuste Kontaminationskontrolle: Die Integration von dUTP-UDG (Uracil-DNA-Glykosylase)-Systemen verhindert effektiv die Übertragung von Kontaminationen aus früheren PCR-Amplicons, ein entscheidendes Merkmal für die Zuverlässigkeit des Tests im klinischen Labor²; integrierte Prozesskontrolle: Eine endogene interne Kontrolle, die auf das menschliche RP (Ribosomalprotein) Gen abzielt und mit ROX-Fluorophor markiert ist, wird ko-amplifiziert, um die Integrität der Nukleinsäureextraktion zu überwachen und potenzielle PCR-Hemmungen zu identifizieren, wodurch falsch-negative Ergebnisse reduziert^{werden 3}. Dieser Ansatz wird durch etablierte Richtlinien zur Qualitätssicherung in molekularen Diagnostik^{unterstützt 4,5}. Das Protokoll ist in erster Linie auf Atemproben (Sputum/BALF) aus Hochrisikogruppen anwendbar, wie Hämatologie-Onkologie-Patienten oder Transplantationsempfänger. Mögliche Einschränkungen, darunter Fehlalarme durch Umweltkontamination oder verminderte Empfindlichkeit durch übermäßige Probenverdünnung, werden ebenfalls diskutiert, ebenso wie Maßnahmen.

Protocol

Die Verwendung klinischer Proben wurde vom zuständigen Ethikausschuss genehmigt (Genehmigungsnummer: ZYS-GCP-2025006). Alle Teilnehmer gaben eine breite informierte Zustimmung zur Nutzung ihrer Daten und Proben in der Forschung. Alle Reagenzien und Verbrauchsgüter, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind im Table of Materials aufgeführt.

1. Probenentnahme

1. Sammeln Sie 3–5 ml Sputum oder bronchoalveolare Spülflüssigkeit in sterilen Behältern und reichen Sie sie umgehend zur Untersuchung ein.

2. Reagenzvorbereitung

HINWEIS: Diese Schritte wurden im Raum zur Vorbereitung von Reagenzen durchgeführt.

1. Nehmen Sie das Detektionsset aus dem -28 °C Gefrierfach und tauten Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (25–30 °C) vollständig auf.
2. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Reaktionen (N): N = Anzahl der Testproben (n) + positive/negative Kontrollen (2) + 1
3. Bereiten Sie die Reaktionsmischung in einem sterilen Mikrozentrifugenrohr vor. Für eine einzelne Reaktion: 35 μL Nukleinsäure-Amplifikationsmischung + 5 μL Primer-Probe-Mischung, gründlich vortoben und kurz zentrifugieren.
4. Aliquot 40 μL der Reaktionsmischung in jedes PCR-Rohr (gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers) und in das Durchführfenster des Probenaufbereitungsraums übertragen.

3. Probenverarbeitung

HINWEIS: Diese Schritte wurden im Sample Processing Room durchgeführt. Abfallentsorgung: Entsorgen Sie Supernatant aus Schritt 3.2.2 und andere flüssige Abfälle mit NaOH in einen ausgewiesenen chemischen Abfallbehälter.

1. Verflüssigung
   1. Geben Sie Sputum/bronchoalveolare Spülflüssigkeit (BALF) zu einem 50-mL Schraubverschlussrohr.
   2. Fügen Sie 1–2 Volumen der 4%igen NaOH-Verdauungslösung hinzu (relativ zur Viskosität des Sputums).
      VORSICHT: NaOH ist korrosiv. Vermeiden Sie Kontakt mit Haut und Augen.
   3. Ziehe die Kappe fest, wirbe 1 Minute lang vor, und inkubiere sie 15–20 Minuten in einem Biosicherheitsschrank bei Raumtemperatur.
2. Anreicherung
   1. Zentrifugierte verflüssigte Proben bei 3.000 U/min für 5 Minuten.
   2. Entsorge das Überstandsmittel mit einer Pipette und behalte dabei 1.000 μL Sediment.
   3. Wirbeln Sie das Sediment gründlich vor.
3. Lysis
   1. Übertragen Sie 500 μL Sediment in ein Lyserohr. Vortex für 10 Minuten und kurz Zentrifuge.
4. Extraktion
   HINWEIS: Abfallentsorgung: Verwendete Extraktionsplatten, Spitzen und Schläuche, die mit biologischen Proben in Kontakt kamen, müssen in einen zugelassenen biogefährlichen Abfallbehälter entsorgt werden.
   1. Übertragen Sie alle Lysat-Supernatanten und 100 μL negative/positive Kontrollen auf Säule 2 der Extraktionsplatte.
   2. Führen Sie Nukleinsäureextraktion mit einem automatisierten Nukleinsäureextraktionssystem mit dem angegebenen Programm⁶ durch.
5. Probenladen
   1. Übertragen Sie 10 μL extrahierte Nukleinsäure (Säule 6) und Steuerung in PCR-Röhren. Zentrifugieren Sie kurz und übertragen Sie sie in das Durchgangsfenster des Verstärkungsraums.

4. Nukleinsäureamplifikation

HINWEIS: Diese Schritte wurden im Verstärkungsraum durchgeführt.

1. Laden Sie die PCR-Röhren in das automatisierte nukleare Amplifikationsinstrument und wählen Sie die passende Amplifikationsvorlage aus.
2. Erkennungskanäle zuweisen: Aspergillus spp.: FAM-Kanal; C. neoformans: VIC-Kanal; P. jirovecii: CY5-Kanal; Interne Kontrolle: ROX Kanal^{7, 8, 9}.
3. Setze Beispielnamen und führe das Programm aus.

Results

Repräsentative Verstärkungskurven, die mit diesem multiplex-fluoreszenten Probe-PCR-Test erhalten wurden, sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Die Validität des Tests wurde anhand vordefinierter Kontrollkriterien bestimmt. In einem gültigen Durchlauf erzeugte die positive Steuerung charakteristische S-förmige Verstärkungskurven in den FAM-, VIC-, CY5- und ROX-Kanälen, mit Zyklusschwellenwerten (Ct) ≤ 33,7 in allen De...

Discussion

Das in dieser Studie etablierte Multiplex-Echtzeit-PCR-Protokoll bietet ein standardisiertes Verfahren zur gleichzeitigen und schnellen Detektion von drei wichtigen invasiven Pilzpathogenen (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii) in klinischen Sputumproben. Diese Methode ermöglicht den direkten Nachweis von Pathogen-DNA aus klinischen Proben. Im Gegensatz zu traditionellen diagnostischen Ansätzen wie Kultur, Mikroskopie oder serologischen Antigentests unter...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & mu; L Filter-Tip sterile verlängerte Pipettenspitzen (gerackt)	Xiaorui Biotechnologie	S20221126
1000 & mu; L-Sterile Pipettenspitzen	Jiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd	241101
200 & mu; L Extended Filter sterile Pipettenspitzen	Xiaorui Biotechnologie	241001
Lyseröhren	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	F1040
Nukleinsäure-Nachweis-Kit für Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans und Pneumocystis jirovecii	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co.	CT8143-48T
Nukleinsäureextraktionsreagenz	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	CN8053-B40T
Probenverdünnungspuffer	Beijing ZC Biowissenschaften & Technology Co	SP7065