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Methodenartikel

Vorbereitung von Schweineaugen für die konfokale Reflexionsmikroskopie zur Visualisierung des glasartigen Kollagenfasernetzwerks

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DOI:

10.3791/68823

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17. Oktober 2025

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1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Bei dieser Methode wird die native Struktur der Kollagenfasern im Glaskörper mittels konfokaler Reflexionsmikroskopie sichtbar gemacht.

Zusammenfassung

Der Glaskörper ist ein klares Gel, das den Raum zwischen Linse und Netzhaut ausfüllt. Seine Struktur wird durch ein Netzwerk von Kollagenfasern unterstützt, was wahrscheinlich die viskoelastischen Eigenschaften beeinflusst und zu Netzhauterkrankungen beiträgt. Die Organisation dieses Kollagennetzwerks ist jedoch nach wie vor schlecht charakterisiert, da die Abbildung des Glaskörpers in seinem nativen Zustand eine Herausforderung darstellt. Viele bildgebende Verfahren, die auf den Glaskörper angewendet werden, verursachen Dehydrierung und Verzerrung, und farbstoffbasierte Methoden können Artefakte oder unspezifische Markierungen einführen, was die Untersuchung des Kollagennetzwerks erschwert. In diesem Protokoll skizzieren wir: 1) eine Methode zum Präparieren von Schweineaugen für die Bildgebung; 2) eine Strategie zur Montage der Augen an einem inversen Mikroskop; 3) Richtlinien für die Bildgebung des glasartigen Kollagennetzwerks in seinem nativen Zustand mittels konfokaler Reflexionsmikroskopie; und 4) Anweisungen für die quantitative Bildanalyse von Netzwerk-Features. Wir zeigen häufige Fallstricke auf und betonen wichtige technische Punkte. Wir berichten über die Anwendung der konfokalen Reflexionsmikroskopie am Glaskörper. Im Vergleich zu früheren glasartigen Bildgebungsstrategien bewahrt dieser Ansatz die native Struktur, Ausrichtung und Verteilung der glasartigen Kollagenfasern ohne exogene Farbstoffe oder Dehydratisierungsartefakte. Die konfokale Reflexionsmikroskopie kann die strukturellen Grundlagen der Glaskörpergelsteifigkeit bei Gesundheit und Krankheit untersuchen.

Einleitung

Der Glaskörper ist die extrazelluläre Matrix zwischen Linse und Netzhaut im Auge. Die Traktion vom Glaskörper auf der Netzhaut spielt eine wichtige Rolle beim Verlust des Sehvermögens bei Erkrankungen wie Netzhautablösung, Makulaloch und Glaskörpertraktion 1,2,3,4. Die Fähigkeit des Glaskörpers, Zugkräfte auf die Netzhaut zu übertragen, wird durch seine Gelsteifigkeit bestimmt, die wiederum von den Eigenschaften seiner Hauptbestandteile Kollagen und Hyaluronsäure abhängt5. Die Gelsteifigkeit des Glaskörpers wird wahrscheinlich durch Merkmale des Netzwerks von Kollagenfasern beeinflusst, da die Steifigkeit von künstlichen Kollagengelen von Netzwerkeigenschaften wie Dichte, Ausrichtung und Faserbreite bestimmt wird6.

Das glasartige Kollagenfasernetzwerk ist aufgrund des hohen Wassergehalts und der niedrigen Kollagenkonzentration schwer abzubilden7, was zu einem künstlichen Verzug bei der Verarbeitung für die Mikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie führt. Traditionelle Histologie und Transmissionselektronenmikroskopie erfordern eine Bearbeitung, um den Glaskörper für Dünnschnitte zu härten. Die für die histologische Einbettung erforderliche Dehydratisierung führt dazu, dass sich die Glaskörperfasern zu einer Wabenkonfiguration8 aggregieren, und die Eiskristallbildung während des Einfrierens erhöht die Porengröße in der extrazellulären Matrix9. Die plastische Einbettung8 und das Schnellgefrieren10 wurden auf den Glaskörper aufgebracht, um das Artefakt zu minimieren, obwohl wahrscheinlich einige Restartefakte übrig bleiben. Die Phasenkontrastmikroskopie ist eine Methode, die keine Sektion erfordert und auf den Glaskörper angewendet wurde, bei der jedoch ein kleines Stück Glaskörper aus dem Auge entfernt werden muss, wodurch die ursprüngliche Position und Ausrichtung des Netzwerksverloren geht 11. In jüngerer Zeit wurde die quantitative polarisierte Lichtmikroskopie verwendet, um die durchschnittliche Orientierung von Fasern über ein grob geschnittenes Schweineauge zu kartieren, aber einzelne Fasern konnten nicht aufgelöst werden12. Darüber hinaus können farbstoffbasierte Markierungsansätze (z. B. Trypanblau, Picrosiriusrot, 5-(4,6-Dichlortriazinyl) Aminofluorescein) Artefakte oder unspezifische Markierungen einführen und wurden daher vermieden, um das native Kollagennetzwerk zu erhalten.

Wir übernahmen die Probenvorbereitungsmethode, die von Filas et al. für polarisierte Lichtmikroskopiestudien verwendet wird, d.h. die grobe Dissektion in einem Agaroseblock12, und bildeten die Probe mit Hilfe der konfokalen Reflexionsmikroskopie ab, die bisher nicht auf den Glaskörper angewendet wurde. Mit dieser Methode haben wir Bilder des glasartigen Kollagenfasernetzwerks in einem hydratisierten, nahezu physiologischen Zustand aufgenommen. Dies bietet mehrere Vorteile gegenüber früheren Methoden, einschließlich reduzierter Artefakte im Vergleich zu Gefrierbruch- oder Dehydratisierungsansätzen10,13. Dieses Protokoll erfordert ein inverses konfokales Mikroskop mit einem Immersionsobjektiv mit mindestens 30-facher Vergrößerung, einer numerischen Apertur von mehr als 0,9 und einem Arbeitsabstand von mehr als 200 μm. Wir enthalten wichtige Anleitungen für die Probenvorbereitung und Bildaufnahme, um eine klare Auflösung der Fasern zu ermöglichen. Durch die Beibehaltung eines nahezu nativen Zustands der glasartigen Kollagenmatrix ermöglicht dieser Ansatz den Forschern, die Faserorientierung, -dichte und -räumliche Verteilungsparameter quantitativ zu analysieren, die für das Verständnis der Glaskörpersteifigkeit und ihrer pathologischen Veränderungen wahrscheinlich entscheidend sind. Diese Technik eignet sich besonders für Forscher, die sich für das glasartige Kollagennetzwerk, seine Struktur und die Pathogenese von vitreoretinalen Erkrankungen interessieren.

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Protokoll

1. Gewebevorbereitung und -dissektion

HINWEIS: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. In unserer Einrichtung war für die Durchführung von Versuchen an ex vivo Schweineaugen keine Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee erforderlich.

  1. Beziehen Sie ex vivo Schweineaugen aus einem fleischverarbeitenden Betrieb. Benutze die Augen innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod.
    HINWEIS: Obwohl sich das Erscheinungsbild des Glaskörpers mit längerer postmortaler Zeit nicht verändert, verschlechtern sich die Netzhaut und die Aderhaut, was zu einer Dispersion von zellulären und pigmentierten Trümmern während der Dissektion führt. Diese Ablagerungen können die Bildgebung und Analyse der Faser beeinträchtigen.
  2. Überschüssige Muskeln und Bindegewebe aus dem Globus entfernen.
  3. Platzieren Sie den dreizackigen Sockel auf dem Boden einer Würfelform, z. B. einer extra großen Silikon-Eiswürfelform (Abbildung 1A und Abbildung 2).
  4. Platzieren Sie den Globus auf dem dreizackigen Sockel und positionieren Sie ihn so, dass der Limbus auf den Zacken ruht.
  5. Stellen Sie ein 3%iges Agarose-Gel her, indem Sie 3 g Allzweck-Agarose zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen und dann die Lösung erhitzen, bis sie sich aufgelöst hat. Sobald die Lösung auf etwa 37 °C abgekühlt ist, gießen Sie sie in die Form, bis das Auge in Agarose getaucht ist.
    HINWEIS: Dadurch wird das Auge in Agarosegel eingebettet, um das Auge für die Dissektion zu stabilisieren.
  6. Den Agarosewürfel mindestens 4 h kalt stellen.
    HINWEIS: Dies erhöht die Haftung des Gels am Auge und stellt sicher, dass das Auge während der Dissektion unbeweglich bleibt
  7. Nach dem Abkühlen den Agarosewürfel aus der Form nehmen. Entfernen Sie dann den Sockel vom Würfel (Abbildung 1B).
  8. Bauen Sie einen dreiseitigen Rahmen in den gleichen Abmessungen wie der Agarose-Würfel aus einer Kombination von 1 x 8 Legosteinen, Platten und Kacheln (Abbildung 3).
    HINWEIS: Dadurch wird der Würfel an Ort und Stelle fixiert und die Klinge während des Sezierens wird als Führung versehen. Die Höhe des Lego-Rahmens bestimmt die Stelle, an der das Auge geschnitten wird. Dies kann durch das halbtransparente Agarosegel sichtbar gemacht werden.
  9. Lege den abgekühlten Agarose-Würfel in den Lego-Rahmen. Halten Sie eine hochkarätige Mikrotomklinge an den stumpfen Kanten und richten Sie die Klinge an der Oberseite des Lego-Rahmens aus. Üben Sie einen sanften Druck nach unten auf die Oberseite des Würfels aus und ziehen Sie die Mikrotomklinge sanft durch den gesamten Würfel und das eingebettete Auge hin und her (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Dadurch entsteht ein Abschnitt des Augengewebes, der in die Agarose eingebettet ist und als "Augenkappe" bezeichnet wird.

2. Einbettungsprobe für die Bildgebung

  1. Schneiden Sie mit der Mikrotomklinge ca. 1 mm Agarose von der gesamten Schnittfläche des Würfels ab (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Dadurch bleibt ein kleiner Abschnitt der Augenkappe übrig, der über die Schnittfläche des Agarosewürfels hinausragt
  2. Verwende ein Taschentuchtuch oder einen kleinen dreieckigen Zelluloseschwamm, um die Schnittfläche des Agarosewürfels zu trocknen, besonders im Bereich des Randes der Augenkappe.
  3. Gib etwa einen Teelöffel Allzweck-Silikondichtungsmasse in einen kleinen Sandwichbeutel und schneide ein 3 mm großes Loch in eine der unteren Ecken des Beutels, um einen Spritzbeutel für die Dichtungsmasse zu erstellen.
  4. Tragen Sie mit dem Spritzbeutel eine dünne Raupe Dichtungsmasse auf die Schnittfläche des Agarosewürfels auf, und zwar direkt am Rand der Augenkappe, so dass ein wasserdichter Rand um die Probe entsteht (Abbildung 4B). Dadurch wird verhindert, dass das Glaskörpergel aus der Augenkappe austritt.
  5. Setzen Sie ein großes Deckglas über die Augenkappe und drücken Sie es so nach unten, dass die Schnittfläche der Augenkappe ohne Luft- oder Flüssigkeitseinschlüsse mit dem Deckglas in Kontakt kommt (Abbildung 4C). Vergewissern Sie sich, dass die Silikonraupe eine durchgehende Abdichtung mit dem Deckglas bildet.
    HINWEIS: Wenn die Silikondichtungsmasse keine durchgehende Abdichtung bildet, kann Glaskörper austreten und Luft in die Probe eindringen lassen. Durch den Kontakt mit Luft schrumpft der Glaskörper, was zu helleren und dichteren Fasern sowie einem flüssigen Bereich ohne Fasern führt. Wenn der Glaskörper nicht mit dem Deckglas in Berührung kommt, ist es schwierig, ihn abzubilden.
  6. Während Sie den Agarosewürfel halten, drehen Sie die Probe um und legen Sie sie auf den großen Deckglasadapter für die Bildgebung an einem inversen Mikroskop (Abbildung 4D und Abbildung 5).

3. Bilderfassung

  1. Verwenden Sie ein inverses konfokales Mikroskop, bei dem es sich nicht um eine rotierende Scheibe handelt. Verwenden Sie ein Wasserobjektiv (mit Wasser oder Augenschmiergel als Kuppler) oder ein Ölobjektiv mit einer numerischen Apertur von mindestens 0,90, einer Vergrößerung zwischen 30x und 60x und einem Arbeitsabstand von mindestens 200 μm.
  2. Passen Sie die Strahlengangeinstellungen für das konfokale Mikroskop an, um Reflexionsbilder zu erhalten. Anstelle des dichroitischen Spiegels, der zur Umlenkung des angeregten Lichts und zur Übertragung des emittierten Lichts für die Fluoreszenzbildgebung verwendet wird, ist sicherzustellen, dass ein Strahlteilerspiegel vorhanden ist, der einen Teil des Beleuchtungslasers umlenkt und einen Teil des reflektierten Lichts durchlässt.
    HINWEIS: Das Reflexionssignal von glasartigen Kollagenfasern ist etwas schwach, so dass Hintergrundrauschen die Fähigkeit zur Abbildung von Fasern beeinträchtigen kann. Bei einer Wellenlänge von 473 nm wurde ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis beobachtet, aber wir konnten die glasartigen Kollagenfasern mit Wellenlängen von 405 nm bis 635 nm abbilden.
  3. Stellen Sie die Detektionswellenlängen so ein, dass sie die Wellenlänge des Beleuchtungslasers enthalten.
  4. Um die Z-Position innerhalb der Probe auszurichten, verringern Sie die Laserleistung auf die niedrigstmögliche Einstellung und identifizieren Sie den Blitz des reflektierten Lichts vom Deckglas. Dies geschieht am unteren und oberen Rand des Deckglases (Abbildung 6).
    HINWEIS: In der Nähe des Deckglases ist im Hintergrund ein erhebliches Reflexionssignal zu sehen. Abseits des Deckglases nimmt das Signal des reflektierten Lichts von den Kollagenfasern ab.
  5. Stellen Sie die z-Position so ein, dass sie sich über der Oberseite des Deckglases und innerhalb der Probe befindet.
  6. Erhöhen Sie die Laserleistung auf ein höheres Niveau, als es normalerweise für eine Fluoreszenzanwendung verwendet wird.
    HINWEIS: Es gibt ein reflektierendes Ringartefakt, das sich in der Mitte des Bildgebungsfelds befindet. Eine Kombination aus Vergrößern und Dezentrieren des Bildgebungsfelds kann dazu beitragen, dieses Artefakt auszuschließen (Abbildung 7).
  7. Verwenden Sie die Linienmittelung und erhöhen Sie die Pixelverweilzeit in den Bildaufnahmeeinstellungen, die Standardmethoden zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses in konfokalen Mikroskopen sind.

4. Bildanalyse der Faserbreite mit CT-FIRE 14

  1. Installieren Sie CT Fire gemäß den Anweisungen auf dieser Website: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
    HINWEIS: Die hier verwendeten Versionen waren "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" und die MATLAB-Runtime "MCR-2018b-win64". Beide müssen heruntergeladen werden, damit die Software funktioniert.
  2. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit-tif und öffnen Sie die 8-Bit-tif-Bilder in CT-FIRE.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Software in der oberen rechten Ecke auf CT-Fire eingestellt ist, und wählen Sie dann Ausführen aus.
  4. CT-FIRE lädt die Ergebnisse der Analyse automatisch in einen Ordner mit dem Namen "ctfireout" hoch, der sich im selben Ordner wie das Originalbild befindet. Untersuchen Sie die Qualität der Extraktion, indem Sie die Datei, die mit dem Namen "OL_ctFIRE" beginnt, mit dem Originalbild vergleichen. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die folgenden Standardeinstellungen für die Bildsegmentierung (d. h. die Identifizierung von Fasern): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15
    1. Wenn die Verbindungslinien nicht genau identifiziert werden, passen Sie die Parameter an, indem Sie auf die Schaltfläche Aktualisieren unter dem Parameterbereich in der oberen rechten Ecke klicken.
      HINWEIS: Eine Anleitung zum Einstellen der Parameter finden Sie auf Seite 20 im Abschnitt "3 Hinweise" des CT-FIRE-Handbuchs, das sich im CTFIRE-Anwendungsordner befindet. Weitere Tipps finden Sie im Artikel von Liu et al. in Abschnitt 3.5.215.
  5. Passen Sie die Ausgabeeinstellungen bei Bedarf an, um die Fasern zu begrenzen, die auf den Ausgabebildern angezeigt werden. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die folgenden Standardeinstellungen: Minimale Faserlänge [Pixel]: 30; Bildauflösung [dpi]: 300; Faserlinienbreite [0-2]: 0,5; Maximale Faserbreite [Pixel]: 15
  6. Um die Breiteneinheiten von Pixel in μm umzurechnen, öffnen Sie das Originalbild in Fidschi. Verwenden Sie die Abmessungen des Bildes, die sowohl in Pixel als auch in μm in der oberen linken Ecke des Anzeigefensters angezeigt werden, um ein Verhältnis zu berechnen.

5. Bildanalyse von Faserdichte, Krümmung, Ausrichtung, Lakunarität, Hyphenwachstumseinheit und fraktaler Dimension mit TWOMBLI16

  1. Laden Sie TWOMBLI von https://github.com/wershofe/TWOMBLI herunter.
  2. Folgen Sie den Anweisungen in der Datei: TwombliDocumentation unter "Installation und Abhängigkeiten".
  3. Öffnen Sie den Ordner TWOMBLI_v1/Programme und ersetzen Sie AnamorfProperties.xml Datei durch AnamorfPropertiesEH.xml Datei (Ergänzende Datei 1).
  4. Ersetzen Sie im Ordner TWOMBLI_v1/programs die Datei Twombli_v1.ijm durch die Datei Twombli_v2.ijm (Ergänzende Datei 2).
  5. Erstellen Sie einen Ordner mit leeren Ordnern mit den Namen "test HDM", "test masks", "HDM" und "masks".
  6. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit-tif.
  7. Legen Sie 3-5 Bilder in einen Ordner "Test Set Input".
  8. Legen Sie alle zu analysierenden Bilder in einem einzigen Ordner ohne Unterordner ab, der als "eligible" bezeichnet wird.
  9. Klicken Sie in Fidschi auf Plugins | Makros | Laufen | Wählen Sie Twombli_v2.ijm in twombli/Programme.
  10. Folgen Sie den Anweisungen, um TWOMBLI auszuführen. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die folgenden Parameter: Kontrastsättigung, 0,35; Minimale Linienbreite, 3; Maximale Linienbreite, 3; Min. Krümmung Fenster, 40; Max Curvature Fenster, 40; Mindestlänge des Astes, 10; Maximale Anzeige HDM, 100; Minimaler Spaltdurchmesser, 0
    HINWEIS: Die Parameter für die Bilder müssen ggf. angepasst werden. Die Software führt den Benutzer durch die Auswahl der Parameter, und zusätzliche Anweisungen finden Sie in der Datei TwombliDocumentation.docx, die mit dem Programm geliefert wurde.

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Ergebnisse

Von drei jungen erwachsenen Schweinen (einem 4 Monate alten Weibchen, einem 5 Monate alten Männchen und einem 6 Monate alten Weibchen) wurde jeweils ein Auge aufgenommen, nachdem das Auge in einer axialen Ebene durch den unteren Limbus geschnitten worden war. Es wurden sechs Bildgebungspositionen in der X-Y-Schnittebene im Abstand von 4 mm aufgenommen. An jeder Bildgebungsposition wurde ein zusammenhängendes 4 x 4-Raster mit Bildern von 70 μm x 70 μm erhalten (Abbildung 8). Für jedes Schwein...

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Diskussion

Frühere bildgebende Verfahren zeigten eine künstliche Faseraggregation13, einen Verlust der Faserorganisation, -orientierung und -lage17 oder stützten sich auf eine viel höhere Auflösung mit einem kleineren Sichtfeld, was die Einblicke in die Faserverteilung10 einschränkte. Die konfokale Reflexionsmikroskopie von ex vivo, grob geschnittenem frischem Gewebe liefert Bilder von glasartigen Kollagenfasern im Mikrometerbe...

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Offenlegungen

Alle Autoren berichten von keinen relevanten Interessenkonflikten.

Danksagungen

National Institutes of Health Core Grant EY014800; Uneingeschränkter Zuschuss von Research to Prevent Blindness, New York, NY, an das Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah; NIH NEI K08 EY034549; Stiftung für das primäre Kinderkrankenhaus; E. Matilda Ziegler Stiftung; Wir danken Dr. Guillaume L. Hoareau und Dr. Austin Johnson für die Schweineaugen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose IVWR0710-500G
Allzweck-Silikon-1-Dichtmasse, klarGE2795576
Zelluloseschwamm (Weck-Cel Eye Spear)Biber – Visitec000865
Maßgeschneiderter 3-Zink-Sockel NANA
Maßgeschneiderter Adapter zur Montage von großem DeckglasNANA
Großes Deckglas, 1,42" x  2,36" Nr. 1Ted Pella260460-100
Lego (klassische Grundplatte, 1 x 8 Felder, 1 x 8 Steine, 1 x 6 Platte)Lego11023, 3008, 3666, 4162
Mikrotome-Klingen (High Profile) Lieca Biosystems14035838926
Olympus UPlanSApo 30x SilikonobjektivOlympUPLSAPO30XS
Silikon große Eiswürfelschale (Samuelworld)Amazonas713243280060
Gewebetücher (Kimwipes) Kimberly Clark34120

Referenzen

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