Methodenartikel

Untersuchung des Mechanismus der β-Elemen-vermittelten LINC00511-Modulation zur Unterdrückung der Cisplatin-Resistenz bei Lungenkrebs

DOI:

10.3791/68825

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19. August 2025

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Cisplatin (DDP)-Resistenz schränkt die Wirksamkeit der Chemotherapie bei Lungenkrebs ein. Ziel dieser Studie war es, aufzuklären, wie β-Elemen(β-Ele) die Resistenz in A549/DDP-Zellen umkehrt, indem es LINC00511 herunterreguliert. In-vitro - und RNA-seq-Analysen zeigten, dass diese Regulation die aerobe Glykolyse und den Wnt/β-Catenin-Signalweg hemmt, was eine potenzielle Strategie zur Überwindung der Chemoresistenz darstellt.

Zusammenfassung

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Die Wirksamkeit der Chemotherapie bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs schränkt die Wirksamkeit der Chemotherapie erheblich ein, was die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung dieser Barriere erforderlich macht. Ziel dieser In-vitro-Studie war es, den Mechanismus aufzuklären, durch den β-Ele die Cisplatin-Resistenz in Lungenadenokarzinomzellen über die LINC00511-vermittelte Glykolyse und die Wnt/β-Catenin-Signalwege umkehrt. Die Cisplatin-resistente humane Lungenadenokarzinom-Zelllinie (A549/DDP), die entweder LINC00511 Überexpression oder Knockdown aufweist, wurde durch Plasmidtransfektion etabliert. Die Transfektionseffizienz wurde mittels quantitativer Reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bewertet, um LINC00511 Expressionsniveaus zu ermitteln. Die Beurteilung mittels des 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridins (EdU)-Assays zeigte eine signifikante β-Ele-vermittelte Hemmung der A549/DDP-Zellproliferation. Weitere RNA-seq-Analysen zeigten, dass die inhibitorische Wirkung von β-Elemen auf die Cisplatin-Resistenz eng mit der Interferenz der zellulären Glykolyse und der Unterdrückung der Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs verbunden war. Die Western-Blot-Analyse von Schlüsselproteinen, einschließlich des Glukosetransporters 1 (GLUT1), der Pyruvatkinase M2 (PKM2), der Laktatdehydrogenase A (LDHA), des β-Catenins und der Glykogensynthase-Kinase 3β (GSK-3β), zeigte, dass β-Elemen die Cisplatin-Resistenz umkehrte, indem es die aerobe Glykolyse hemmte und die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch Herunterregulierung der LINC00511 blockierte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass β-Elemen die Cisplatin-Resistenz bei Lungenkrebs überwindet, indem es auf LINC00511 und den damit verbundenen aeroben Glykolyse/Wnt/β-Catenin-Signalweg abzielt. Dies schafft einen theoretischen Rahmen für zukünftige präklinische und klinische Untersuchungen und zeigt gleichzeitig potenzielle therapeutische Ziele auf.

Einleitung

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Unter den bösartigen Tumoren weltweit weist Lungenkrebs außergewöhnlich hohe Inzidenz- und Sterberaten auf, die durch die maligne Transformation und das invasive Wachstum von Bronchialepithelzellen gekennzeichnetsind 1,2. Basierend auf histopathologischen Merkmalen wird Lungenkrebs entweder als nicht-kleinzelliges Karzinom (NSCLC) oder als kleinzelliges Karzinom (SCLC) kategorisiert3. Es ist erwähnenswert, dass NSCLC etwa 85 % der gesamten Lungenkrebsfälle ausmacht 4,5. Als chemotherapeutischer Erstlinienstandard bei NSCLC ist Cisplatin (DDP) klinisch unverzichtbar6. Klinische Beobachtungen haben jedoch gezeigt, dass Tumorzellen über mehrere Mechanismen Arzneimittelresistenzen entwickeln können, die in erster Linie die Aktivierung von Immunfluchtwegen, Mutationen in Zielgenen für Arzneimittel und eine Dysregulation der Arzneimittelstoffwechselwege betreffen 7,8,9.

Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNA) repräsentieren Transkripte > 200 Nukleotiden (nt), denen die proteinkodierende Kapazität fehlt10. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass lncRNA die Cisplatin-Resistenz in Tumorzellen durch mehrere Mechanismen umkehren kann, wie z. B. die Funktion als konkurrierende endogene RNAs (ceRNAs), um miRNAs zu schwammen und ihre Zielgene freizusetzen11, die Modulation der Apoptose-Signalwege12, die Beteiligung an der Reparatur von DNA-Schäden13 und die Regulierung der zellulären Autophagie14. Darüber hinaus sind mit dem Fortschritt der Forschung zur metabolischen Reprogrammierung von Tumoren substanzielle Beweise dafür aufgetaucht, dass lncRNA eine entscheidende regulatorische Rolle in diesem Prozess spielt. Der Warburg-Effekt, der die aerobe Glykolyse bezeichnet, stellt eine grundlegende metabolische Eigenschaft bösartiger Zellendar 15. Es liefert nicht nur Energie für eine schnelle Zellproliferation, sondern erzeugt auch Zwischenmetaboliten, die als Vorläufer für die Biosynthese dienen und die Protein- und Lipidsynthese unterstützen, um den Anforderungen des bösartigen Tumorwachstums gerecht zu werden16. Bei Lungenkrebs wurde bestätigt, dass lncRNA die Tumorprogression und die Chemotherapieresistenz signifikant beeinflusst, indem sie den aeroben Glykolyseweg reguliert17,18.

Unter diesen wurde berichtet, dass LINC00511, ein in den letzten Jahren umfassend untersuchtes lncRNA-Molekül, eng mit der Initiierung und Entwicklung verschiedener bösartiger Tumoren verbunden ist19. Diese Ergebnisse klären nicht nur die spezifischen Mechanismen der Beteiligung von lncRNA an der metabolischen Reprogrammierung von Tumoren auf, sondern bieten auch eine theoretische Grundlage für lncRNA-gezielte Tumorbehandlungsstrategien, die potenzielle therapeutische Wege eröffnen.

β-Ele wird aus den Rhizomen von Curcuma zedoaria gewonnen und ist ein bioaktives Sesquiterpenoid mit nachgewiesener antitumoraler Wirksamkeit. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass β-Ele als selektiver Inhibitor des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs dient und einen synergistischen Effekt mit Cisplatin erzeugt, indem es auf den Tumorstoffwechsel abzielt. Es unterdrückte das Tumorwachstum im NSCLC-Maus-Xenotransplantat-Modell20 signifikant. Nachfolgende Untersuchungen zeigen die Fähigkeit von β-Ele, die aerobe Glykolyse in NSCLC-Zellen durch Modulation der miR-301a-3p/AMPKα-Signalachse abzuschwächen, was zu onkostatischen Ergebnissen führt21. Basierend auf unseren früheren Ergebnissen haben wir bestätigt, dass LINC00511 die Cisplatin-Resistenz bei Lungenkrebs abschwächt; Der genaue molekulare Wirkmechanismus muss jedoch noch vollständig geklärt werden.

Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der aeroben Glykolyse bei der metabolischen Reprogrammierung von Tumoren und der entscheidenden Rolle der LINC00511 bei der Tumorentwicklung und -progression soll in dieser Studie untersucht werden, ob β-Ele die Cisplatin-Resistenz bei Lungenkrebs umkehren kann, indem es den LINC00511-vermittelten aeroben Glykolyseweg moduliert.

Frühere Hinweise deuten darauf hin, dass β-Ele die Cisplatin-Resistenz umkehren und seine Anti-Tumor-Wirkung verstärken kann, indem es apoptotische Signalwegeaktiviert 22, die Exosomensekretionreguliert 23 und den Zellzyklusstoppt 24. Diese bekannten Mechanismen zeigen jedoch in der Regel eine breite Wirkung und es fehlt an einer präzisen Regulation spezifischer molekularer Ziele, was ihre klinische Übertragbarkeit einschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf, neuartige Strategien zu erforschen, die gezielter sind, über klar definierte Mechanismen verfügen und ein starkes Potenzial für die klinische Umsetzung zur Überwindung der Cisplatin-Resistenz aufweisen. Im Gegensatz zu früheren Forschungen, die die unmittelbaren biologischen Wirkungen von β-Ele betonen, charakterisiert diese Studie den Einfluss von β-Ele auf den Warburg-Metabolismus und den Wnt/β-Catenin-Signalweg in A549/DDP-Zellen durch die Regulation von lncRNA-vermittelten molekularen Signalwegen, mit dem Ziel, einen neuen Mechanismus aufzuklären, der der Umkehrung der Chemosensibilisierung bei Lungenkrebs zugrunde liegt. Dieser Artikel enthüllt nicht nur einen neuen Ansatz für β-Ele zur Umkehrung der Chemoresistenz durch gezielte lncRNA, sondern bietet auch eine neue theoretische Grundlage und potenzielle Interventionsziele für die klinische Behandlung von Lungenkrebs. Diese Ergebnisse zeigen durch ihre detaillierte Aufklärung eines spezifischen molekularen Ziels (LINC00511) und wichtiger Signalwege (Warburg und Wnt/β-Catenin) ein signifikant erhöhtes klinisches Translationspotenzial. Es wird erwartet, dass sie eine solide wissenschaftliche Grundlage für die Verbesserung der Chemotherapie-Sensitivität bei Lungenkrebspatienten und die Verbesserung ihrer Lebensqualität bieten sowie die Entwicklung präziser Behandlungsstrategien für Lungenkrebs vorantreiben.

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Protokoll

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1. Vorbereitung des Lösungsmittels

  1. Herstellung einer Mediumlösung für A549/DDP-Zellen: Kultivieren Sie A549/DDP-Zellen in Hams F-12K-Komplettmedium (siehe Materialtabelle für Details), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, siehe Materialtabelle für Details), 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S, siehe Materialtabelle für Details) und 2 μg/ml Cisplatin (DDP, siehe Materialtabelle für Details).
    1. Herstellung der Komplettmediumlösung: Bereiten Sie eine Komplettlösung vor, indem Sie 50 mL FBS und 5 mL P/S zu 500 mL F-12K-Medium von Ham hinzufügen, gefolgt von gründlichem Mischen.
    2. Herstellung einer cisplatinhaltigen Komplettlösung: Wiegen Sie 1 mg Cisplatinpulver (DDP, siehe Materialtabelle für Details) und lösen Sie es in 1 mL doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) auf, um die Stammlösung herzustellen. 200 μl der Stammlösung zu 100 ml vollständigem Medium (hergestellt gemäß Schritt 1.1.1) geben und gründlich mischen, um eine Arbeitslösung aus vollständigem Medium herzustellen, die 2 μg/ml Cisplatin enthält.
      HINWEIS: Da Cisplatin eine zytotoxische Substanz ist, führen Sie alle Verfahren in einem Abzug oder einer Biosicherheitswerkbank durch und tragen Sie Schutzausrüstung wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille.
  2. β-Ele-Verabreichungslösung: Die in dieser Studie verwendete Wirkstoffkonzentration basierte auf den Ergebnissen früherer Experimente, die von unserem Forschungsteam durchgeführt wurden20,21. 1 mg β-Ele (Einzelheiten siehe Materialtabelle) in 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO, Einzelheiten siehe Materialtabelle) lösen, um die Stammlösung herzustellen. Verdünnen Sie die Stammlösung mit vollständigem Medium auf 25 mL, um eine 40 μg/ml-β-Ele-Arbeitslösung zu erhalten.
    HINWEIS: Da DMSO die Aufnahme anderer Substanzen über die Haut verbessern kann, führen Sie alle Arbeitsschritte in einem Abzug oder einer Biosicherheitswerkbank durch und tragen Sie Schutzausrüstung wie Handschuhe, Laborkleidung und Schutzbrille.

2. Zellkultur 

  1. In dieser Studie wird die Cisplatin-resistente Zelllinie des humanen Lungenadenokarzinoms (A549/DDP, Procell, siehe Materialtabelle für Details) verwendet. Vergewissern Sie sich, dass diese Zelllinie durch eine STR-Analyse (Short Tandem Repeat) identifiziert und erfolgreich mit Standardlinien in ATCC und anderen Datenbanken abgeglichen wurde.
    1. Für die STR-Analysemethode werden ca. 1 x 106 Zellen entnommen und genomische DNA mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit extrahiert (siehe Materialtabelle für Details).
    2. Verwenden Sie ein validiertes Multiplex-STR-System, das für die DNA-Typisierung geeignet ist, um 20 STR-Loci zusammen mit dem geschlechtsbestimmenden Locus zu amplifizieren. Die PCR-Amplifikation wird unter den folgenden Bedingungen des thermischen Zyklus durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 29 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 59 °C für 45 s und Verlängerung bei 72 °C für 45 s, mit einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min.
    3. Analysieren Sie die resultierenden PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese mit einem automatisierten genetischen Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hier wurde die Alleltypisierung mit einer Fragmentanalysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle für Details), wobei die Peak-Nachweisschwelle auf 150 relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) festgelegt wurde.
      HINWEIS: Das generierte 20-Locus-STR-Profil wurde mit Referenzprofilen von A549/DDP-Zelllinien verglichen, die in öffentlichen Datenbanken verfügbar sind. Eine Übereinstimmungsrate von mehr als 80 % wurde als Hinweis auf die Homologie angesehen. Das Fehlen von externen Allelpeaks bestätigte das Fehlen einer Kreuzkontamination.
  2. Holen Sie die Zellen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie in ein 37 °C heißes Wasserbad, um sie schnell aufzutauen, bis die Flüssigkeit vollständig geschmolzen ist. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie zwei Volumina der vollständigen Mediumlösung hinzu und resuspendieren Sie die Mischung vorsichtig. Nach dem Zentrifugieren (358 × g, 5 min, Raumtemperatur) ist der Überstand vorsichtig zu entsorgen.
    HINWEIS: Wenn Sie Kryokonservierungsröhrchen aus flüssigem Stickstoff verwenden, tragen Sie Frostschutzhandschuhe und entweder eine Schutzbrille oder eine Gesichtsmaske und richten Sie nicht auf die Röhrchenmündung.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vollständigem Medium durch vorsichtiges Pipettieren und verdünnen Sie die Suspension dann auf 10 mL, indem Sie 9 mL vollständiges Medium hinzufügen. Die Zellen werden in 100 mm Zellkulturschalen ausgesät und in einem Inkubator (siehe Materialtabelle für Details) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Das Zellpassagenverhältnis wurde zwischen 1:2 und 1:3 gehalten.
    HINWEIS: Cisplatin ist ein Platin-Chemotherapeutikum mit Zytotoxizität. Bei dieser Methode werden A549/DDP-Zellen mit cisplatinhaltigem Medium kultiviert. Sammeln Sie daher das cisplatinhaltige Abfallkulturmedium in einem speziellen Abfallflüssigkeitsfass und senden Sie es regelmäßig zur fachgerechten Entsorgung an das Sonderabfallbehandlungsunternehmen.

3. Transfektion von Plasmiden 

  1. Verwendung eines Plasmidkonstrukts für LINC00511 Überexpression und einer genspezifischen siRNA, die auf LINC00511 (Gen-ID: 400619; Transkript-ID: NR_033876.1) für die Zelltransfektion abzielt. Die verwendeten siRNA-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
siRNA-Sequenzen
NameSinn 5'-3'Antisense 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabelle 1: siRNA-Sequenzliste

  1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip A549/DDP-Zellen aus, die nach der Wiederbelebung in die dritte Generation überführt wurden, und inokulieren Sie sie gleichmäßig in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well. Jede Vertiefung wurde zufällig nummeriert, und die Vertiefungen wurden auf der Grundlage dieser Zufallszahlen Versuchsgruppen zugeordnet.
  2. Transfizieren Sie die Zellen mit einem Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle für Details), wenn ihre Dichte etwa 70 % erreicht.
    1. Bereiten Sie die siRNA-Transfektionslösung vor.
      1. Mischen Sie 250 μl optimiertes Minimum Essential Medium (Opti-MEM, siehe Materialtabelle für Details) mit 5 μl Transfektionsreagenz, wirbeln Sie es 3–5x sanft vortexen, um die Homogenität zu gewährleisten, und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      2. 5 μl siRNA (50 nM) in 250 μl Opti-MEM verdünnen, 3–5x vorsichtig vortexen, um gründlich zu mischen. Kombinieren Sie das verdünnte Transfektionsreagenz mit der siRNA-Lösung und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den siRNA-Transfektionskomplex zu bilden.
    2. Bereiten Sie die Plasmidtransfektionslösung vor.
      1. Mischen Sie 250 μl Opti-MEM mit 5 μl Transfektionsreagenz, wirbeln Sie es 3–5x sanft vortexen, um die Homogenität zu gewährleisten, und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      2. 2 μg Plasmid in 250 μl Opti-MEM verdünnen, 3–5x sanft vortexen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Das verdünnte Transfektionsreagenz wird mit der Plasmidlösung kombiniert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Plasmidtransfektionslösung herzustellen.
      3. Geben Sie die siRNA-Transfektionslösung bzw. die Plasmid-Transfektionslösung in die 6-Well-Platten. Geben Sie 1.500 μl vollständiges Medium in jede Vertiefung. Mischen Sie die Zellplatten vor und nach der Zugabe vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Die Platten werden vor der Analyse 24 Stunden nach der Transfektion bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

4. Nachweis der Transfektionseffizienz durch quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

HINWEIS: Entnehmen Sie die Zellen nach der Transfektion für 24 h in Schritt 3.3 für den qRT-PCR-Nachweis gemäß dem folgenden Verfahren. Alle Experimente wurden in drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

  1. RNA-Extraktion
    1. Verwenden Sie ein Extraktionskit für ultrareine RNA (siehe Materialtabelle für Details). Entsorgen Sie das Medium in der 6-Well-Platte gemäß den Anweisungen des Kits und waschen Sie die Zellen mit PBS. Geben Sie anschließend 500 μl Lysereagenzlösung auf Phenol-Guanidin-Basis in jede Vertiefung, blasen Sie die Zellen vorsichtig mit der Spitze der Pistole auf, um sie vollständig zu suspendieren, und überführen Sie die Mischung in ein Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie es 5 Minuten einwirken, um eine vollständige Lyse der Zellprobe zu gewährleisten.
    2. Fügen Sie 100 μl Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Lysereagenz hinzu, schütteln Sie es 15 s lang scharf und lassen Sie es 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zum Schluss wird die obere wässrige Phase vorsichtig abgesaugt, in die Adsorptionssäule überführt und bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
    3. Binden Sie RNA an die Kieselgelmembran. Waschen Sie es mit Buffer RW1 und Buffer RW2, um Proteine zu entfernen. Fügen Sie anschließend DNase I hinzu, um die verbleibende DNA zu verdauen, und führen Sie eine zweite Wäsche mit Puffer RW2 durch, um eine vollständige Entfernung von Verunreinigungen sicherzustellen. Sammeln Sie schließlich RNA-Proben, indem Sie RNA mit RNase-freiem Wasser eluieren und 1 Minute lang bei 13.400 x g zentrifugieren.
  2. Messen Sie die RNA-Konzentration.
    1. Geben Sie jeweils 1,5 μl der Proben-RNA-Lösung in einen Mikronukleinsäuredetektor (siehe Materialtabelle für Details) und lesen Sie die A260/A280-Werte ab.
      HINWEIS: Wenn die gemessenen A260/A280-Werte im Bereich von 1,8 bis 2,0 liegen und die RNA-Konzentration zwischen 20 ng/μL und 200 ng/μL liegt, bedeutet dies, dass die RNA-Qualität akzeptabel ist und für nachfolgende Experimente verwendet werden kann.
    2. Verdünnen Sie die RNA-Lösung auf der Grundlage der Messungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC), um konsistente RNA-Konzentrationen für alle Proben zu gewährleisten, wobei Sie die gemessene minimale RNA-Konzentration als Benchmark verwenden, gefolgt von PCR-Experimenten.
  3. Reverse Transkription von RNA
    1. Verwenden Sie die extrahierte Gesamt-RNA als Vorlage und synthetisieren Sie cDNA gemäß den Anweisungen des Reverse-Transkriptionskits (siehe Materialtabelle für Details). Bereiten Sie das Reaktionssystem gemäß den Anforderungen des Kits vor.
    2. Geben Sie die extrahierte RNA-Lösung und das Reaktionssystem in ein achtreihiges Röhrchen und setzen Sie zwei Replikatvertiefungen in jede Gruppe. Die Reaktion wird unter aufeinanderfolgenden Bedingungen eingeleitet: 15 min Inkubation bei 37 °C, 5 s Hitzedenaturierung bei 85 °C, 5 min Abkühlung bei 4 °C.
  4. PCR-Reaktion
    1. Führen Sie die PCR-Amplifikation auf einem quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-System durch (siehe Materialtabelle für Details) unter Verwendung des SYBR Green-basierten vorgemischten PCR-Mastermixes (siehe Materialtabelle für Details). Verwenden Sie GADPH als Referenzgen mit den in Tabelle 2 aufgeführten Primersequenzen und bereiten Sie das Reaktionsgemisch wie folgt vor: Geben Sie nacheinander 0,4 μl des entsprechenden Primers, 2 μl cDNA-Template und das Reaktionsgemisch in ein Acht-Well-Streifenröhrchen, um das endgültige Reaktionsvolumen zu erreichen.
    2. PCR-Amplifikation im Lauf: 95 °C 30 s (1 Zyklus), 95 °C 5 s (40 Zyklen), 60 °C 20 s (40 Zyklen). Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus von Zielgenen unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode 25. Wiederholen Sie unabhängig voneinander alle Experimente dreimal, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
      HINWEIS: Chemische Abfälle, die bei Versuchsverfahren anfallen, müssen in dafür vorgesehenen Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und von zertifizierten Entsorgungsdiensten für gefährliche Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
Primer-Sequenzen
FibelSequenz (5'-3')
Mensch-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
Mensch-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

Tabelle 2: Primer-Sequenzen für PCR-Assays

5. EdU-Erkennung

  1. Bewerten Sie die Wirkung einer veränderten LINC00511 Expression auf die Proliferation von A549/DDP-Zellen mit einem EdU-Assay-Kit (siehe Materialtabelle für Details).
    1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip A549/DDP-Zellen aus, die nach der Wiederbelebung in die dritte Generation überführt wurden, und inokulieren Sie sie gleichmäßig in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Well.
      HINWEIS: Hier wurden alle Experimente in drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.
    2. Nummerieren Sie jedes Well nach dem Zufallsprinzip und ordnen Sie die Wells basierend auf diesen Zufallszahlen einer von vier Versuchsgruppen zu: Kontrollgruppe, β-Ele-Gruppe, β-Ele + LINC00511 Überexpressionsgruppe (β-Ele + OV-LINC00511) und β-Ele + LINC00511 Knockdown-Gruppe (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Wenn die Zelldichte etwa 70 % erreicht, ist eine Plasmidtransfektion und eine Interferenzbehandlung gemäß Schritt 3.3 durchzuführen. Nach 24 Stunden Transfektion verwerfen Sie das ursprüngliche Medium und geben Sie 1 ml einer Mediumlösung mit β-Ele (40 μg/ml) in jede Vertiefung der medikamentösen Behandlungsgruppe.
  3. Inkubieren Sie die Zellen mit EdU zur Markierung, nachdem Sie sie 24 Stunden lang mit 40 μg/ml β-Ele behandelt haben. Anschließend fixieren Sie die Zellen für 10 min mit 4% Paraformaldehyd und permeabilisieren Sie sie mit 0,5% Triton X-100.
  4. Geben Sie die Click-Reaktionslösung (hergestellt durch Auflösen eines Fläschchens des im Kit enthaltenen Click-Additiv-Reagenzes in 1,3 ml deionisiertem Wasser unter gründlichem Mischen) im Dunkeln und halten Sie die Reaktion im Dunkeln 30 Minuten lang aufrecht. Waschen Sie die Zellen mit PBS, nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, und färben Sie sie anschließend 5 Minuten lang mit Hoechst. Beobachten Sie abschließend die Ergebnisse mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung 2).
    HINWEIS: DMSO ist hochdurchlässig und eine brennbare Flüssigkeit. In diesem Schema enthält die β-Ele-Verwaltungslösung DMSO. Sammeln Sie daher die β-Ele Verabreichungslösung nach Gebrauch in einem speziellen Abfallflüssigkeitsfass und geben Sie es regelmäßig zur fachgerechten Entsorgung an den Sonderabfallbehandlungsbetrieb ab.

6. Nachweis des Glukosegehalts 

HINWEIS: Alle Experimente wurden an drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

  1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip A549/DDP-Zellen aus, die nach der Wiederbelebung in die dritte Generation überführt wurden, und inokulieren Sie sie gleichmäßig in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well. Nummerieren Sie die einzelnen Vertiefungen nach dem Zufallsprinzip und weisen Sie die Vertiefungen basierend auf diesen Zufallszahlen experimentellen Gruppen zu.
  2. Wenn die Zelldichte etwa 70 % erreicht, fahren Sie mit der Plasmidtransfektion und Interferenz fort, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Nach 24 h Transfektion behandeln Sie die Zellen in den behandelten Gruppen mit 40 μg/ml β-Ele.
  3. Nach 24 Stunden medikamentöser Behandlung wird das obere Kulturmedium aus den Zellen entnommen und 5 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert. Sammelt den Überstand ein. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen im Glukosetestkit (Einzelheiten siehe Materialtabelle ) die Reaktionslösung vor und mischen Sie sie gründlich mit dem Überstand.
  4. Legen Sie die Proben in 96-Well-Platten mit fünf Replikatwells pro Gruppe. Schütteln Sie die Platten vorsichtig und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 10 min. Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 505 nm und berechnen Sie den Glukosegehalt mit der im Testkit angegebenen Formel:
    figure-protocol-1
    Hierist C-Standard = 5,55 mmol/L, N = Verdünnungsfaktor.
    HINWEIS: Chemische Abfälle, die bei Versuchsverfahren anfallen, müssen in dafür vorgesehenen Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und von zertifizierten Entsorgungsdiensten für gefährliche Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

7. Nachweis des Milchsäuregehalts 

HINWEIS: Alle Experimente wurden an drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

  1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip A549/DDP-Zellen aus, die nach der Wiederbelebung in die dritte Generation überführt wurden, und inokulieren Sie sie gleichmäßig in 6-Well-Platten (1 × 105 Zellen/Well). Nummerieren Sie die einzelnen Vertiefungen nach dem Zufallsprinzip und weisen Sie die Vertiefungen basierend auf diesen Zufallszahlen experimentellen Gruppen zu. Wenn die Zelldichte etwa 70 % erreicht, fahren Sie mit der Plasmidtransfektion und Interferenz fort, wie in Schritt 3.3 beschrieben. 24 h nach der Transfektion behandeln Sie die Zellen in den behandelten Gruppen mit 40 μg/ml β-Ele.
  2. Nach 24 Stunden medikamentöser Behandlung wird das obere Kulturmedium aus den Zellen entnommen und 5 Minuten lang bei 1000 x g zentrifugiert. Sammelt den Überstand ein. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen im Milchsäure-Testkit (Einzelheiten siehe Materialtabelle ) die Reaktionslösung vor und mischen Sie sie gründlich mit dem Überstand.
  3. Geben Sie insgesamt 250 μl Probe in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und stellen Sie fünf Replikatvertiefungen für jede Gruppe ein. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 10 min. Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 530 nm mit einem Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle für Details) und berechnen Sie den Laktatgehalt mit der im Testkit angegebenen Formel:
    figure-protocol-2
    Hier gilt: C-Standard = 3 mmol/L, N = Verdünnungsfaktor.
    HINWEIS: Chemische Abfälle, die bei Versuchsverfahren anfallen, müssen in dafür vorgesehenen Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und von zertifizierten Entsorgungsdiensten für gefährliche Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

8. Bulk-RNA-seq

  1. Einrichten einer Beispieldatenbank
    1. Wählen Sie A549/DDP-Zellen für das Experiment aus und teilen Sie sie in folgende Gruppen ein: Kontrollgruppe, DDP-Gruppe, β-Ele (40 μg/ml) + DDP (48 μM) Gruppe, β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 Gruppe und β-Ele + DDP +si-LINC00511 Gruppe. Nehmen Sie 3 Proben in jede Gruppe auf.
    2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus jeder Zellgruppe. Verwenden Sie ein magnetisches mRNA-Isolationskit auf Basis von Beads (siehe Materialtabelle für Details), um eukaryotische mRNA anzureichern, bei der Oligo(dT)-beschichtete Kügelchen selektiv über A-T-Basenpaarung an die Poly(A)-Schwänze der mRNA binden. Fragmentierungspuffer (1 μl/μg RNA, siehe Materialtabelle für Details) hinzufügen und 7 Minuten lang bei 94 °C inkubieren, um die mRNA in kurze Segmente zu fragmentieren.
    3. Fahren Sie mit der Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung von zufälligen Hexamer-Primern gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Für die cDNA-Synthese des zweiten Strangs fügen Sie geeignete Mengen an Reaktionspuffer, RNase H und DNA-Polymerase I hinzu, um den Prozess abzuschließen.
    4. Führen Sie eine Endreparatur und ein A-Tailing an doppelsträngiger cDNA durch, indem Sie 30 Minuten lang bei 25 °C inkubieren (Endreparatur), unmittelbar gefolgt von 72 ΰC für 30 Minuten (A-Tailing). Ligate-Sequenzierungsadapter für die endreparierten Fragmente.
    5. Aufreinigung und Größenauswahl ligierter Produkte mit carboxylmodifizierten magnetischen Siliziumdioxidkügelchen (siehe Materialtabelle für Details). Erstellen Sie schließlich die Sequenzierungsbibliothek durch PCR-Amplifikation.
    6. Analysieren Sie nach der Probenvorbereitung die Sequenzierungsbibliothek auf der DNBSEQ-T7-Plattform (siehe Materialtabelle für Details). Laden Sie die Probe zur Sequenzierung auf einen Patterned Array Microarray-Chip.
      HINWEIS: Das Gerät erfasste, las und identifizierte optische Signale mit einem hochauflösenden Bildgebungssystem, um die Sequenzinformationen einzelner Basen zu bestimmen. Führen Sie anschließend weitere Sequenzierungszyklen durch, um die Sequenz der folgenden Basen zu erhalten. Nach mehreren Zyklen wurden die Rohsequenzierungsdaten generiert.
  2. Bioinformatische Analyse
    1. Sequenzieren Sie die Proben auf dem Gerät, um die Rohdaten zu erhalten, die auch als externe Daten bezeichnet werden. Verarbeiten Sie außerdem die Sequenzierungsdaten mit fastp (v 0.21.0). Entfernen Sie Lesevorgänge, die 3'-Adaptersequenzen enthalten, und eliminieren Sie Lesevorgänge mit geringer Qualität mit einer durchschnittlichen Qualitätsbewertung unter Q20 als Teil der primären Filterkriterien. Führen Sie alle nachgelagerten Analysen auf der Grundlage der bereinigten, qualitativ hochwertigen Daten durch.
      HINWEIS: Führen Sie eine erste Filterung der Sequenzierungsdaten mit fastp durch. In der offiziellen Dokumentation für transkriptomische Datensätze (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) finden Sie die spezifischen Befehlszeilenparameter.
    2. Verwenden Sie FastQC (v 0.12.0), um die Qualität der bereinigten Sequenzierungsdaten zu bewerten. Die Qualitätsanforderungen lauten wie folgt: Mindestens 90 % der Basen müssen einen höheren Qualitätsfaktor als Q20 aufweisen, und der Prozentsatz der verbleibenden Adaptersequenzen sollte 1 % nicht überschreiten. Daten, die diese Kriterien erfüllen, gelten als qualifiziert und können für nachgelagerte Analysen verwendet werden.
      HINWEIS: Beurteilen Sie die Qualität der bereinigten Sequenzierungsdaten mit FastQC gemäß den offiziellen Richtlinien (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analyse der Genexpression
    1. Verwenden Sie die DESeq2-Software, um eine differentielle Expressionsanalyse zwischen den beiden Vergleichsgruppen durchzuführen.
      1. Geben Sie zunächst die Daten in die Software ein, um ein DESeq-DataSet zu erstellen. Filtern Sie dann Gene mit einer Gesamtanzahl von weniger als 10 in allen Proben heraus.
      2. Führen Sie abschließend die differentielle Genanalyse durch und extrahieren Sie die Ergebnisse. Die Bedingungen für das Screening differentiell exprimierter Gene sind wie folgt: die Faltungsänderung in der Expression |log2FoldChange| > 1 und die Signifikanz padj ≤ 0,05.
        HINWEIS: Detaillierte Betriebsschritte der DESeq2-Software finden Sie in den detaillierten Schritten auf der offiziellen Website: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Nachweis von Änderungen des Proteinexpressionsniveaus durch Western Blot (WB) 

HINWEIS: Alle Experimente wurden an drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

  1. Führen Sie Western Blotting durch, um die Expression zellulärer Proteine zu quantifizieren.
    1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip A549/DDP-Zellen aus, die nach der Wiederbelebung in die dritte Generation überführt wurden, und inokulieren Sie sie gleichmäßig in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well.
    2. Nummerieren Sie jede Vertiefung nach dem Zufallsprinzip und ordnen Sie die Vertiefungen basierend auf diesen Zufallszahlen einer der sechs Versuchsgruppen zu: Kontrolle, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 und β-Ele + si-LINC00511.
    3. Wenn die Zelldichte etwa 70 % erreicht, führen Sie die Plasmidtransfektion und -interferenz durch, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Nach 24 Stunden Transfektion ist die Behandlungsgruppe β-Ele (40 μg/ml) auszusetzen, während der Kontrollgruppe frisches Medium zur Verfügung gestellt wird. Kultivieren Sie beide Gruppen für weitere 24 Stunden.
    4. Anschließend werden die Zellpellets durch Zentrifugation bei 1675 × g für 5 min gesammelt. Jede Zellgruppe wird 30 Minuten lang mit 500 μl RIPA-Lysepuffer mit 1 mM PMSF auf Eis lysiert (siehe Materialtabelle für Details).
  2. Die Zelllysate werden bei 13.400 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Messen Sie die Proteinkonzentrationen mit dem BCA Protein Concentration Assay Kit (siehe Materialtabelle für Details). Trennen Sie die gleichen Mengen an Proteinproben um 10 % SDS-PAGE und übertragen Sie sie mittels Elektrophorese auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen.
  3. Tauchen Sie die Membranen 2 h lang bei Raumtemperatur in eine Blockierungslösung (5 % Magermilch/Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST)) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen GLUT1, PKM2, LDHA, β-Catenin, GSK-3β (1:1000) und β-Aktin (1:2000, siehe Materialtabelle für Details).
    1. Waschen Sie die Membranen am nächsten Tag dreimal mit TBST, je 5 min, bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  4. Am nächsten Tag inkubieren Sie die Membranen mit sekundären Antikörperlösungen (HRP-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, 1:2000) und schütteln Sie sie 1 h lang leicht bei Raumtemperatur.
  5. Fügen Sie abschließend 0,1 ml/cm2 der im Handel erhältlichen chromogenen ECL-Lösung hinzu, um die PVDF-Membranen vollständig zu bedecken. Vor der Exposition 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Visualisieren und analysieren Sie die Banden mit einem verbesserten Chemilumineszenzsystem (siehe Materialtabelle für Details). Siehe Abbildung 4C und Abbildung 5B.
    HINWEIS: Chemische Abfälle, die bei Versuchsverfahren anfallen, müssen in dafür vorgesehenen Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und von zertifizierten Entsorgungsdiensten für gefährliche Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

10. Statistische Analyse 

HINWEIS: Alle Experimente wurden an drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

  1. Organisieren Sie die experimentellen Daten nach Gruppen und geben Sie sie in die GraphPad Prism Software ein (Version 8.0.2; siehe Materialtabelle für Details). Führen Sie Datenvisualisierung und statistische Signifikanzanalyse gemäß den Softwarerichtlinien durch. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels One-Way-ANOVA mit η² (eta-squared) Effektstärkeberechnung bewertet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest26. Betrachten Sie **P < 0,01 als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

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β-Ele unterdrückt die Proliferation von A549/DDP-Zellen signifikant

In diesem Experiment wurden die Verabreichungskonzentrationen von β-Ele und DDP auf Basis der Ergebnisse unserer vorangegangenen Studienbestimmt 20,21. A549/DDP-Zellen wurden allein oder in Kombination mit DDP mit β-Ele behandelt, um dessen Einfluss auf die DDP-Chemoresistenz zu untersuc...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie konzentrierte sich auf das kritische klinische Problem der Cisplatin-Resistenz bei Lungenkrebs. Lungenkrebs, der für die weltweit höchste Zahl von Krebstodesfällen verantwortlich ist, hat nach wie vor eine Fünf-Jahres-Überlebensrate von unter 20 %29,30. Cisplatin, als Eckpfeiler platinbasierter Chemotherapeutika, ist ein wirksames Breitband-Antikrebsmittel, das die DNA-Replikation hemmt, um seine krebshemmende Wirkun...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Finanzierung dieser Studie wurde von der Jilin Provincial Natural Science Foundation unter der Preis-Nr. YDZJ202401058ZYTS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A549/DDP-ZellenProcellCL-0519URLs:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Eine außergewöhnlich saubere WerkbankSuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDURLs:http://www.sz-antai.com
BCA-Proteinkonzentrations-Assay-KitSolarbio GmbHPC0020URLs:https://www.solarbio.com
Tisch-ZentrifugeThermoPico17URLs:https://www.thermofisher.com
ZellkulturkammerThermo3111URLs:https://www.thermofisher.com
ZellkulturschaleBIOFILTCD000100URLs:http://www.biofil.com.cn
Chemilumineszenz-AnalysatorQinxiang Instrumente 4300URLs:https://www.clinx.cn/about_us
CisplatinAladdinC295225-250mgURLs:https://www.aladdin-e.com/
DNBSEQ-T7 Instrument zur GensequenzierungMGI Tech CO., LtdT7URLs:https://www.mgitech.cn/
EasyPure  Mikrogenomisches DNA-KitTransGen BiotechEE181-01URLs:https://www.transgen.com/
ECL chromogene LösungSolarbio GmbHPE0010URLs:https://www.solarbio.com
EDU-Nachweis-KitBeyotimeNr. C0071SURLs:https://www.beyotime.com
Enzymmarkiertes InstrumentAusrüstung entziehenHBS-1096AURLs:https://www.detiebio.cn/
Fötales Rinderserum FBS)CLARKFB15015URLs:https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime-Puffer Yeasen11277ESURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  Software  6ThermoVariante 6Software zur Analyse von Fragmenten. URLs:https://www.thermofisher.cn/   
GenReader-PlattformBeijing Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlAutomatisierter genetischer Analysator für die Kapillarelektrophorese
Glukose-TestkitJiancheng BiografieNr. A154-1-1URLs:http://www.njjcbio.com
GLUT1 Polyklonaler AntikörperProteintech-GruppeArtikel-Nr.: 21829-1-APURLs:https://www.ptglab.com
GraphPad PrismaGraphPad-SoftwareVersion 8.0.2URLs:https://www.graphpad.com
GSK-3β AntikörperAffinitätNr. AF5016URLs:https://www.affbiotech.com
Hams F-12KProcellPM150910URLs:https://www.procell.com.cn/
Hieff NGS DNA-Selektion PerlenYeasen12601ESURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA-Isolierung Master KitYeasen12603ZHURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP-markiertes Anti-Kaninchen-IgG mit Ziegen-EtikettServicebiografieGB23303URLs:https://www.servicebio.cn
Laktat-TestkitJiancheng BiografieNr. A019-2-1URLs:http://www.njjcbio.com
LDHA-spezifischer polyklonaler AntikörperProteintech-GruppeArtikel-Nr.: 19987-1-APURLs:https://www.ptglab.com
Leichter Cycler 96RocheLC96URLs:https://lifescience.roche.com
Lipofectamin 2000Invitrogen11668-019URLs:https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco31985-070URLs:https://www.thermofisher.com/gibco
Penicillin-Streptomycin(P/S)BioscharfBL505AURLs:https://www.biosharp.cn/
PKM2-spezifischer polyklonaler AntikörperProteintech-GruppeArtikel-Nr.: 15822-1-APURLs:https://www.ptglab.com
PMSF BeyotimeST506URLs:https://www.beyotime.com
PrimeScript RT Reagenzien-Kit (Perfekte Echtzeit)TakaraRR037AURLs:https://www.takarabio.com
RIPA-LysatBeyotimeP0013BURLs:https://www.beyotime.com
SequenzierungsplattformBGIDNBSEQ-T7URLs:https://www.bgi.com/global
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420AURLs:https://www.takarabio.com
Spuren-Nukleinsäure-TesterAosheng InstrumentNano-100URLs:http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SURLs:https://www.canvaxbiotech.com
TrypsinBioscharfBL501AURLs:https://www.biosharp.cn/
Hochreines RNA-Kit (DNase I)Canvax BiotechCW0597SURLs:https://www.canvaxbiotech.com
β-Aktin AntikörperProteintech-Gruppe60008-1-IGURLs:https://www.ptglab.com
β-Catenin Antikörper AffinitätDF6794URLs:https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGURLs:https://www.sigmaaldrich.com

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

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