Forschungsartikel

Expression, klinische Bedeutung und Rolle bei der Bewertung der Wirksamkeit der Immuntherapie des co-stimulatorischen Moleküls LLT1 bei Magenkrebs

614 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/68827

⸱

10. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Forschung untersucht LLT1 als prädiktiven Immuntherapie-Biomarker bei Magenkrebs durch Multi-Omics und klinische Analysen. Die Studie untersucht die Rolle von LLT1 bei der Immunevasion und der Modulation der Tumormikroumgebung, um präzise Immuntherapieansätze für verbesserte Behandlungsergebnisse zu ermöglichen.

Zusammenfassung

LLT1 ist ein neuartiges Immun-Checkpoint-Molekül und ein potenzielles therapeutisches Ziel. Die Immuntherapie hat die Ergebnisse bei fortgeschrittenem Magenkrebs verbessert; Viele Patienten sprechen jedoch nicht an oder entwickeln keine Resistenzen, und es fehlen prädiktive Biomarker. Die Rolle von LLT1 bei der Immunevasion bei Magenkrebs und seine Wirkung auf das Ansprechen auf die Immuntherapie sind nach wie vor unklar. Um dies zu beurteilen, wurde die LLT1-Expression im Cancer Genome Atlas (TCGA) Datensatz zum Magenadenokarzinom unter Verwendung mehrerer Algorithmen (TIMER, CIBERSORT und ESTIMATE) analysiert, um die Infiltration von Immunzellen zu quantifizieren. Die Proteinexpression wurde durch Immunhistochemie (IHC) in 268 Adenokarzinomproben des Magens und durch Multiplex-Immunfluoreszenz (MIF) in 115 Geweben nach der Immuntherapie validiert. Integrierte transkriptomische und proteomische Daten wurden auf Assoziationen mit Merkmalen der Tumormikroumgebung und klinischen Immuntherapieergebnissen analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass eine hohe LLT1-Proteinexpression signifikant mit weniger fortgeschrittenen Tumoreigenschaften assoziiert war (geringere Invasionstiefe und Knotenmetastasen; P < 0,05) und ein längeres Gesamtüberleben (P = 0,012). LLT1-mRNA- und Proteinspiegel korrelierten mit einer stärkeren Infiltration von CD8+-T-Zellen und M1-Makrophagen und einer erhöhten PD-L1-Expression in der Tumormikroumgebung. In der ersten Kohorte von 198 Patienten mit verfügbaren prognostischen Daten zeigten Patienten mit hoher LLT1-Expression (n=117) ein signifikant längeres Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten mit niedriger Expression (n=81). In der zweiten Kohorte von Patienten, die mit einer kombinierten Immun- und Chemotherapie behandelt wurden, hatten Tumoren mit hoher LLT1-Expression (n = 48) ein längeres progressionsfreies Überleben (P = 0,014) als solche mit niedriger LLT1-Expression (n = 67). Ein signifikanter Anstieg (P < 0,05) in PD-1+CD161+ Immunzellpopulationen wurde bei immuntherapeutisch wirksamen Patienten (n=62) im Vergleich zu behandlungsresistenten Patienten (n=53) beobachtet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LLT1-Expression ein vielversprechender Biomarker für eine günstige Prognose bei Magenkrebs ist. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die zeigt, dass die LLT1-Expression ein verbessertes Ansprechen auf eine kombinierte Chemotherapie und Immuntherapie bei Magenkrebs vorhersagt, was ihr Potenzial bei der Steuerung immuntherapeutischer Strategien untermauert.

Einleitung

Gastroösophagealer Krebs, insbesondere Magenkrebs (GC), ist die fünfthäufigste Krebsform weltweit und die fünfttödlichste. Globale Statistiken zeigen, dass jedes Jahr etwa 1 Million neue Fälle identifiziert werden, wobei Ostasien einen unverhältnismäßig großen Anteil der Krankheit schultert und mehr als die Hälfte der weltweiten Inzidenz ausmacht1. Für Patienten, bei denen eine GC im Frühstadium diagnostiziert wurde, sind die Überlebensaussichten signifikant günstig: Über 90 % erreichen nach endoskopischer submuköser Dissektion (ESD) oder radikalem chirurgischen Eingriff eine 5-Jahres-Überlebensrate2. Die subtile Darstellung von Erstsymptomen führt jedoch häufig zur Diagnose einer lokal fortgeschrittenen oder metastasierten Phase 3,4. Die Aussichten für Patienten in diesen fortgeschrittenen Stadien sind düster, da diejenigen, die unbehandelt bleiben, ein medianes Gesamtüberleben (OS) von knapp 6 Monaten haben. Selbst bei Verabreichung von Kombinations-Chemotherapien auf der Basis von Fluorouracil und Platin verlängert sich das mediane OS lediglich auf etwa ein Jahr5.

In jüngster Zeit hat sich die Behandlung von Magenkrebs im Spätstadium aufgrund dieser neuen Medikamente, die als Immun-Checkpoint-Inhibitoren bezeichnet werden, erheblich verändert. Sie ähneln einer Wunderwaffe für Krebszellen, auf denen ein bestimmter Marker, PD-L1, auftaucht - mindestens ein Wert von 1 auf der Combined Positive Score (CPS)-Skala. Diese Behandlungen sind auch sehr wirksam bei Krebsarten, die alle in ihrer DNA verwechselt sind, was als hohe Mikrosatelliteninstabilität (MSI-H) bezeichnet wird. Dieser neue Ansatz macht einen Unterschied, da den Patienten mehr Zeit zur Verfügung steht 6,7. Zulassungsrelevante klinische Studien deuten darauf hin, dass innerhalb der PD-L1-positiven Kohorte Personen mit einem CPS von 10 oder höher nach der Behandlung mit monoklonalen PD-1-Antikörpern eine ausgeprägtere Verlängerung des Überlebens erzielen 8,9. Nichtsdestotrotz steht die derzeitige Immuntherapie immer noch vor mehreren klinischen Herausforderungen: objektive Ansprechraten (ORR) im Allgemeinen unter 20 %, sekundäre Resistenzraten von bis zu 40 % bis 60 %, unvollkommene Biomarker-Vorhersagesysteme (bestehende Biomarker können nur 30 % bis 40 % der potenziellen Begünstigten identifizieren) und Schwierigkeiten bei der Behandlung immunbedingter unerwünschter Ereignisse (irAEs)10,11,12,13,14. Obwohl eine duale Immun-Checkpoint-Blockade (z. B. kombinierte PD-1/CTLA-4-Hemmung) oder Chemoimmuntherapien die Ansprechraten auf 40 % bis 60 % erhöhen können, erreicht etwa die Hälfte der Patienten immer noch keinen nachhaltigen klinischen Nutzen15. Daher sind die Etablierung präziser Klassifizierungssysteme auf der Grundlage von Multi-Omics-Merkmalen, die Entdeckung neuartiger prädiktiver Biomarker und die Identifizierung neuer Immun-Checkpoints zu wichtigen Forschungsrichtungen für die Verbesserung der klinischen Ergebnisse der GC-Immuntherapie geworden.

Lectin-like Transcript 1 (LLT1) ist ein C-Typ-Lektin-verwandtes Protein mit CD161, einem Bestandteil der Rezeptorfamilie der natürlichen Killerzellen (NK), das als identifizierter Bindungspartner dient. Das CLEC2D-Gen, das für seine Synthese verantwortlich ist, führt durch alternative Spleißereignisse, die bestimmte Exons umgehen, zu fünf verschiedenen Isoformen. Variante 1, bekannt als LLT1, wurde als einzige Variante auf der Zellmembran validiert16,17. Die LLT1-Expression wird überwiegend in verschiedenen Immunzelltypen wie B-Lymphozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen (DCs), spezifischen T-Zellpopulationen (einschließlich aktivierter und regulatorischer T-Zellen), Monozyten und Makrophagen beobachtet und wird auch in bestimmten malignen Zellen und während entzündlicher Episoden beobachtet18. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass LLT1 in DCs und B-Zellen nach der Stimulation des Toll-like-Rezeptors (TLR) hochreguliert wird. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von LLT1 an CD161 die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität unterdrückt, was auf eine Beteiligung an der Modulation der Immunantwort hindeutet18. In B-Zellen wird die LLT1-Expression durch eine Virusinfektion oder entzündliche Stimulation hochreguliert. Bei der Funktion als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) übt die LLT1-CD161-Interaktion eine doppelte immunmodulatorische Wirkung aus, indem sie die NK-Zellfunktion unterdrückt, während sie die T-Zellproliferation oder die IFN-γ Produktion mitstimuliert19.

Es ist bekannt, dass LLT1 in einer Reihe von Krebszellen vorkommt, darunter dreifach negativer Brustkrebs, Glioblastom und B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom. Dieses Protein bindet an den CD161-Rezeptor, der sich auf NK-Zellen befindet, und blockiert effektiv deren Fähigkeit, Krebszellen zu zerstören, und hilft so bei der Umgehung der Immunantwort 20,21,22. Eine bemerkenswerte Beobachtung bei HPV-negativen oropharyngealen Plattenepithelkarzinomen ist die variable Expression von LLT1, die laut immunhistochemischen Studien auf eine positive prognostische Bedeutung hinweist, wenn sie in tertiären lymphatischen Strukturen (TLS) stark exprimiert wird, während ihr Vorhandensein auf Tumorzellen mit einem schlechteren Ergebnis verbunden ist23. Darüber hinaus wird LLT1 im Rahmen des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) nicht in den Krebszellen selbst nachgewiesen, sondern befindet sich in der Tumormikroumgebung (TME), und sein mRNA-Expressionsniveau ist mit einer besseren Prognose verbunden24.

Wie von Mathewson et al. in der Gliomforschung gezeigt, verbessert die Blockierung von CD161 die T-Zell-vermittelte Abtötung von Gliomzellen in vitro und verbessert ihre Anti-Tumor-Funktion in vivo, was das therapeutische Potenzial von CD161 als Immun-Checkpoint-Ziel unterstreicht25. Angesichts der Tatsache, dass LLT1 der kanonische Ligand von CD16118 ist, sollte seine Rolle als immuntherapeutisches Ziel ernsthaft in Betracht gezogen werden. Analog zur kritischen Interaktion zwischen PD-1 und PD-L1 in der Immuntherapie ist die Untersuchung der biologischen Funktionen von LLT1 bei Magenkrebs und seiner Korrelation mit den Ergebnissen der Immuntherapie von erheblichem klinischem Wert.

Diese Studie bietet eine umfassende Analyse der LLT1-Expressionsmuster in der Mikroumgebung von Magenkrebstumoren, die sowohl mRNA- als auch Protein-Untersuchungen integriert. Es bewertet systematisch das Potenzial von LLT1 als prognostischer Biomarker bei fortgeschrittenem Magenkrebs und bewertet seinen prädiktiven Wert für die Wirksamkeit von Immuntherapien. Diese Erkenntnisse tragen zu einem tieferen Verständnis seines klinischen translationalen Potenzials bei.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Forschung am Menschen wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Soochow University geprüft und genehmigt (Zulassung Nr. 2019026). Das Ethikprüfungsgremium des First Affiliated Hospital der Soochow University hat eine Ausnahmegenehmigung für die ethische Überprüfung dieser Datennutzung genehmigt oder gewährt. Zusätzlich wurde von allen Teilnehmern eine Einverständniserklärung eingeholt.

Bioinformatik Datenanalyse
Nach einer gründlichen Pan-Krebs-Expressionsanalyse der Datenbanken TCGA und Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER) wurde das Verhalten von LLT1 bei verschiedenen Krebsarten untersucht, mit besonderem Schwerpunkt auf Magenkrebs. Die TISIDB-Datenbank wurde verwendet, um die Korrelation zwischen LLT1-Expressionsniveaus und verschiedenen molekularen Subtypen von Magenkrebs zu untersuchen. Die Korrelation zwischen den klinischen Merkmalen der Patienten und der LLT1-Expression wurde mit TCGA-Daten durch R-Programmierung weiter analysiert. GO- und KEGG-Analysen wurden eingesetzt, um die funktionelle Rolle von LLT1 bei der Magenkarzinogenese zu untersuchen. Der ESTIMATE-Algorithmus (Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data) wurde zusätzlich eingesetzt, um die Infiltrationsniveaus von Immun- und Stromazellen in Tumorgeweben gemäß LLT1-Expressionsmustern zu quantifizieren. Weitere Analysen mit dem CIBERSORT-Algorithmus wurden durchgeführt, um die Korrelationen zwischen den LLT1-Expressionsniveaus und spezifischen Infiltrationsmustern der Immunzellen in der Tumormikroumgebung zu bewerten. Eine umfassende bioinformatische Analyse wurde unter Verwendung von TCGA-Datensätzen und statistischer R-Programmierung (v4.4.1) durchgeführt, um mögliche Korrelationen zwischen LLT1-Expressionsprofilen und immunregulatorischen Biomarkern zu untersuchen. Schließlich wurde die TCIA-Datenbank (The Cancer Immunome Atlas) verwendet, um zu untersuchen, ob die LLT1-Expression das Ansprechen auf eine PD-1/PD-L1-Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie vorhersagen kann.

Konstruktion von GAC-Proben und Gewebe-Microarrays (TMA)
Zwei Datensätze von Gewebe-Microarray-Daten wurden wie folgt generiert:

Die erste Gruppe analysierte retrospektiv Proben von 268 Patienten mit GAC, die sich 2011 einer Operation unterzogen hatten. Pathologen wählten Paraffinblöcke aus, identifizierten Tumorkernregionen und konstruierten sie zu Gewebe-Microarrays. Jeder einzelnen Probenstelle wurde ein eindeutiger Identifikator zugewiesen, um die damit verbundenen klinischen Parameter wie Geschlecht, Alter, Neoplasmadimensionen, Grad der neoplastischen Differenzierung, Phase der Krebsprogression, Invasionstiefe, lymphatische Beteiligung und das Vorhandensein einer Fernausbreitung sorgfältig zu überwachen. Die Dauer des Gesamtüberlebens (OS) wurde definiert als das Intervall vom Beginn der Therapie bis zum Auftreten der Mortalität bzw. dem Stichtag Dezember 2017. Es sollte hervorgehoben werden, dass umfassende OS-Daten nur für eine Untergruppe von 198 Teilnehmern verfügbar waren.

Die zweite Gruppe umfasste 115 behandlungsnaive Patienten mit fortgeschrittenem GC, die sich zwischen 2016 und 2023 im First Affiliated Hospital der Soochow University einer chirurgischen/endoskopischen Resektion unterzogen hatten. Die Pathologen untersuchten die Paraffinblöcke und konstruierten Gewebe-Microarrays mit einer genauen Nachverfolgung des Krankheitsverlaufs. Bemerkenswert ist, dass alle Proben vor jeder präoperativen Behandlung entnommen wurden, und die postoperative Behandlung bestand hauptsächlich aus monoklonalen PD-1-Antikörpern in Kombination mit einer Chemotherapie.

Alle chirurgischen Resektionsproben wurden aus dem Antrum des Magens entnommen. Alle Proben wurden in neutral gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Basierend auf der Auswertung von H&E-gefärbten Schnitten identifizierten zwei leitende Pathologen unabhängig voneinander die repräsentativsten Geweberegionen aus den in Paraffin eingebetteten Proben. Die Gewebe-Microarrays (TMAs) wurden mit Hilfe eines automatisierten Gewebearrayers konstruiert, wobei die Gewebekerne in den TMA-Blöcken nach vordefinierten Modulen präzise positioniert wurden. Schließlich wurden die fertigen TMA-Blöcke von einem erfahrenen Histotechnologen bei einer Dicke von 4 μm geschnitten.

Immunhistochemie (IHC) und Multiplex-Immunfluoreszenz (mIHC)
Immunhistochemische und Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays wurden an einem konstruierten Gewebe-Microarray durchgeführt. Die IHC-Färbung wurde in Übereinstimmung mit einer zuvor etablierten Methodikdurchgeführt 26. Der erste Satz von Microarray-Paraffinabschnitten wurde auf Objektträger übertragen und bei 72°C für 1 h gebacken. Nachdem die Schnitte mit Xylol entparaffinisiert und in sukzessive ansteigenden Ethanolverdünnungen rehydriert wurden, wurde die endogene Peroxidaseaktivität durch die Anwendung von Peroxidase-Blockierungslösung für 30 min blockiert. Die Antigengewinnung erfolgte durch Kochen der Objektträger bei 110 °C in Citrat-Antigen-Entnahmelösung (pH 6,0) für 3 Minuten. Nach der Blockierung mit 5 % BSA-Blockierungspuffer wurden die Schnitte mit monoklonalem Maus-Anti-Human-CLEC2D, Maus-Anti-Human-CD3-Monoklonal (gebrauchsfertig), Maus-Anti-Human-CD4-Monoklonal (gebrauchsfertig), Kaninchen-Anti-Human-CD8-Monoklonal (gebrauchsfertig), Maus-Anti-Human-CD11c-Monoklonal (1:50) Maus-Anti-Human-CD19-Monoklonal (gebrauchsfertig), Maus-Anti-Human-CD31-Monoklonal (gebrauchsfertig), Maus Anti-Human-CD56 monoklonal (gebrauchsfertig), Maus Anti-Human-CD68 monoklonal (gebrauchsfertig), Kaninchen Anti-Human-Foxp3 monoklonal (1:50), Maus Anti-Human-IL-17 monoklonal (1:50), Maus Anti-Human-IFN-γ monoklonal (1:50), Maus Anti-Human-Ki67 monoklonal (1:50), Maus Anti-Human-PD-L1 monoklonal (gebrauchsfertig) bei 4 °C über Nacht27,28. Die Objektträger wurden dann gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-markierten Sekundärantikörpern (Anti-Maus und Kaninchen) bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben gewaschen und das EnVision-Detektionssystem für die Immundetektion verwendet. Wenn unter dem Mikroskop braune Bereiche auf dem Chip erscheinen, ist eine sorgfältige Beobachtung erforderlich. Die chromogene Reaktion sollte gestoppt werden, sobald die braunen Bereiche nicht mehr zunehmen. Die Dias wurden mit Mayer's Hämatoxylin gegengefärbt und mit neutralem Kleber kaschiert. In der Negativkontrolle wurde Maus- oder Kaninchen-IgG anstelle des primären Antikörpers verwendet. Die Positivkontrolle war menschliches Mandelgewebe. Der zweite Satz von Microarray-Schnitten wird für die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC) verwendet. Unter Wiederverwendung der oben genannten Antigen-Retrieval- und Blockierungsbedingungen ist das Antikörper-Panel spektral wie folgt optimiert: PD-L1 (480 nm), CD161 (520 nm), LLT1 (570 nm), PD-1 (620 nm), CD8 (690 nm) und PAN-CK (780 nm). Die Primärantikörper wurden unter den gleichen Bedingungen wie im ursprünglichen Protokoll29 (mit Ausnahme von PANCK und CD161, die neu eingeführt wurden) in der empfohlenen Verdünnung von 1:100 inkubiert, gefolgt von einer Fluoreszenzfärbung mit Tyramidsignalamplifikation (TSA). Nach jeder Runde der Fluoreszenzfärbung wird ein Antikörperstripping durchgeführt, gefolgt von einer wiederholten Antigengewinnung, einer endogenen Peroxidase-Blockierung und einer unspezifischen Zielblockierung, bevor der nächste primäre Antikörper inkubiert wird. Bei der Durchführung der Multiplex-Immunhistochemie sind drei Punkte entscheidend: Für jeden Fluoreszenzfarbstoff müssen Vorversuche durchgeführt werden, stark exprimierte Antikörper sollten mit schwachen Fluoreszenzsignalen gepaart werden, während schwach exprimierte Antikörper mit starken Fluoreszenzsignalen gepaart werden sollten, und nach der Färbung jedes Fluoreszenzmarkers müssen die Färbeergebnisse unter lichtgeschützten Bedingungen unter einem Mikroskop beobachtet werden. Nach der Färbung mit dem 6. Fluoreszenzfarbstoff wird die DAPI-Gegenfärbung auf die Markierung der Zellkerne angewendet und die Objektträger werden eingefasst. Schließlich wurden alle Gewebe-Microarrays mit einem digitalen Pathologiescanner gescannt und mit einer KI-gestützten digitalen Pathologie-Bildanalysesoftware analysiert.

Bewertung der IHC/mIHC-Färbung
Die Färbeergebnisse wurden von zwei erfahrenen Pathologen doppelblind interpretiert. Sie maßen die Tiefe der Färbung mit einem Hochleistungsobjektiv (200-fache Vergrößerung) oder einer passenden Fluoreszenzeinstellung (200-fach) und vergaben Werte von 0 (keine Färbung) bis 3 (intensive Färbung). Die Fraktionen von LLT1-positiven Zellen in Magenkarzinomproben wurden in vier Schichtungen eingeteilt: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) und 3 (>50%). Der Immunreaktivitäts-Score (IRS) wurde aus dem Produkt aus der Färbetiefe und dem Anteil der LLT1-positiven Zellen abgeleitet. Proben mit einem Wert von null wurden als negativ angesehen, während Werte von 1-4 eine schwache Expression, 5-7 eine moderate und 8-9 eine starke Expression anzeigten; Die gleichen Kriterien wurden angewendet, um die Expression anderer Marker wie Ki67 und CD3 zu bewerten. Basierend auf der Auswertungs- und Gruppierungsmethodik wurden die Stichproben als stark (IRS8-9), mäßig (IRS5-7), schwach (IRS1-4) oder ohne Ausprägung (IRS0) gekennzeichnet. Patienten mit den niedrigsten Werten (IRS≤4) wurden der Gruppe mit niedriger Expression zugeordnet, und Patienten mit höheren Werten (IRS≥5) wurden der Gruppe mit hoher Expression zugeordnet.

Für den PD-L1-Marker wurde jedoch ein anderer Ansatz unter Verwendung des CPS gewählt. Dieser Score wurde durch das Verhältnis von PD-L1-positiven Zellen (einschließlich Tumor-, Immun- und Stromazellen) zur Gesamtzahl lebensfähiger Tumorzellen bestimmt, die um den Faktor 100 hochskaliert wurden. Personen mit einem CPS von mehr als fünf wurden in die Kohorte mit hoher Expression eingeteilt, während Personen mit einem CPS von fünf oder weniger in die Kohorte mit niedriger Expression eingeteilt wurden.

Gruppierung des Immuntherapie-Ansprechens
In Übereinstimmung mit den Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Version 1.1 (RECIST 1.1) lässt sich die Bewertung von Zielläsionen bei Patienten in vier verschiedene Kategorien einteilen: (a) Vollständiges Ansprechen (CR): Alle Zielläsionen sind vollständig verschwunden, und die kurze Achse aller pathologischen Lymphknoten (sowohl Ziel- als auch Nicht-Ziellymphknoten) muss weniger als 10 mm messen; (b) Partielles Ansprechen (PR): Der kumulative Durchmesser aller messbaren Zielläsionen hat sich gegenüber den Ausgangsmessungen um mindestens 30 % verringert; c) Fortschreitende Erkrankung (PD): Diese Kategorie ist anwendbar, wenn der kumulative Durchmesser der Zielläsionen im Vergleich zum kleinsten während der Studie aufgezeichneten Wert um mindestens 20 % zugenommen hat (wobei der Ausgangswert als Referenz verwendet wird, wenn dieser den kleinsten Wert darstellt), wobei der absolute Anstieg nicht weniger als 5 mm beträgt; Darüber hinaus wird das Auftreten neuer Läsionen auch als progressive Krankheit (PD) eingestuft; (d) Stabile Erkrankung (SD): Der kumulative Durchmesser der Zielläsionen erreicht während der gesamten Studie weder die Reduktionskriterien für PR noch die Anstiegskriterien für PD. Es wurden zwei Schichtungstechniken implementiert. Die erste Methode beinhaltete die Segregation der Patienten nach ihrem Ansprechstatus, wobei PD (n=53) und SD (n=46) Patienten die Non-Responder-Gruppe (n=99) bildeten, während PR (n=15) und CR (n=1) Patienten die Responder-Gruppe bildeten (n=16). Der zweite Ansatz beinhaltete die Kategorisierung der Patienten nach Krankheitsverlauf, wobei CR-, PR- und SD-Patienten als immuntherapiewirksame Kohorte (n=62) und Parkinson-Patienten als immuntherapienicht wirksame Kohorte (n=53) klassifiziert wurden.

Statistische Analyse
Die empirischen Auswertungen wurden mit der Rechnerplattform R (Version 4.4.1) und dem Softwarepaket SPSS Statistical (Version 27.0) durchgeführt. Die Disparitäten zwischen den Studienkohorten wurden mit Hilfe der Chi-Quadrat-Kontingenztabellenanalyse untersucht. Spearmans nicht-parametrische Korrelationstechnik wurde eingesetzt, um die Stärke und Richtung der Assoziationen zwischen Variablen zu untersuchen. Die Variationen der Überlebenszeit wurden durch die Konstruktion von Kaplan-Meier-Schätzern analysiert, die durch Log-Rank-Tests auf Signifikanz ergänzt wurden. Anschließend wurden Cox-Regressionsmodelle für proportionale Gefahren eingesetzt, um Faktoren zu identifizieren, die möglicherweise die Überlebensergebnisse der Patienten beeinflussen. Die statistische Signifikanz wurde als zweiseitiger p-Wert-Schwellenwert von <0,05 vordefiniert. Um die Robustheit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden umfassende Sensitivitätsanalysen durchgeführt, um potenzielle Störvariablen zu bewerten, wobei multivariate Modelle entsprechend angepasst wurden. Darüber hinaus wurden explizite Interpretationen der Hazard Ratios zur Verfügung gestellt, um das klinische Verständnis zu erleichtern und die praktischen Auswirkungen der identifizierten Risikofaktoren auf die Patientenprognose zu betonen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Assoziation zwischen der CLEC2D-mRNA-Expression und der Subklassifizierung/klinischen Parameter von Magenkrebs
Eine erste umfassende Krebsuntersuchung unter Verwendung des TCGA-Datensatzes, die durch die TIMER-Datenbank ermöglicht wurde, ergab einen bemerkenswerten Anstieg der CLEC2D-Transkriptspiegel in verschiedenen Krebsgeweben, wie in Abbildung 1A dargestellt. Diese Beobachtung impliziert, dass CLEC2D als al...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Unsere Studie zeigte eine höhere CLEC2D-mRNA-Expression in Tumorgeweben als in normalen Geweben. Immunhistochemische Ergebnisse von Magenkrebs zeigten, dass eine hohe LLT1-Proteinexpression in Tumorgeweben mit einer besseren Prognose verbunden war und positiv mit der Infiltration von Immunzellen in der Tumormikroumgebung korrelierte. Die Analyse von Geweben von Magenkrebspatienten, die eine Immuntherapie erhielten, zeigte, dass eine hohe LLT1-Expression ein besseres immuntherape...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Von den Autoren wird kein potenzieller Interessenkonflikt berichtet.

Danksagungen

Wir danken der TCGA-Datenbank für die Bereitstellung von Datenunterstützung. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81974375) und Grants of Suzhou Science and Technology Development Plan (SKY2022129) unterstützt. Die Studie orientiert sich an den ARRIVE-Richtlinien.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 % BSA-BlockierungspufferBeijing Solarbio Wissenschaft & Technology Co., Ltd., ChinaSW3015
Anti-CD11c ZSGB-BIO,China5D11
Anti-CD161Abcam, Cambridge, Vereinigtes KönigreichArtikel-Nr.: ab302564
Anti-CD19   ZSGB-BIO,ChinaEPl69
gegen CD3 ZSGB-BIO,ChinaLNl0
Anti-CD31ZSGB-BIO,China  UMAB30
Anti-CD4ZSGB-BIO,ChinaUMAB64
gegen CD56 ZSGB-BIO,ChinaUMAB83
Anti-CD68 ZSGB-BIO,ChinaKP1
Anti-CD8ZSGB-BIO,ChinaEP334
Anti-CLEC2DAbcam, Cambridge, Vereinigtes KönigreichArtikel-Nr.: ab197341
Anti-Foxp3Forschung & Forschung D Systems, USANr. 1054C
Anti-IFN-& Gamma;  Santa Cruz BiotechnologieSC-74108
gegen IL-17Forschung & Forschung D Systems, USA  MAB317 
Anti-Ki67 ZSGB-BIO,China8H5 Uhr
Anti-Pan-Cytokeratin Abcam, Cambridge, Vereinigtes KönigreichAB7753
Anti-PD-1Abcam, Cambridge, Vereinigtes KönigreichArtikel-Nr.: ab137132
Anti-PD-L1DAKO,Dänemark22C3
Automatisierte Gewebe-Array-AusrüstungEstigen OU, Tartu, EstlandBeecher ATA 27Dieses Instrument wird hauptsächlich für den Aufbau von Gewebe-Microarrays verwendet.
Citrat-Antigen-EntnahmelösungAladdin Biochemical Technology Co., Ltd , ChinaC752119
DAB-Chromogen-Kit AiFang Biological, ChinaAFIHC004
Digitaler Scanner für PathologieNingbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd, ChinaKF-FL-020Dieses Instrument wird hauptsächlich zum Scannen von Immunhistochemie- und Multiplex-Immunhistochemie-Chips verwendet.
GraphPad Prism 10GraphPad Software, Vereinigte Staaten von Amerikav10.0.3Diese Software ist für das Plotten von Kaplan-Meier-Kurven (mit statistischer Analyse des Log-Ranks), die Visualisierung wissenschaftlicher Daten und die Erstellung von Abbildungen.
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd , ChinaP743267
Peroxidase-BlockierungslösungAiFang Biological, ChinaAFIHC012
Polymer-HRP konjugierter Ziegen-Anti-Maus/Kaninchen-SekundärantikörperAiFang Biological, ChinaAFIHC001
Sechsfarbiges Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbekit mit sieben MarkernAiFang Biological, ChinaAFIHC037Dieses Reagenzienkit ist für die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC) konzipiert
SPSSIBM Corporation, USAIBM SPSS Statistik 27Die Software wurde für die statistische Analyse der Daten eingesetzt.
Das R-ProjektR-KernteamVersion 4.4.1Alle R-Pakete, der zugehörige Code und die Originaldateien wurden in die öffentliche Datenbank hochgeladen.
VISIOPHARM SoftwareVisiopharm, Dänemark2025.02.2.18022 x64Diese Software ist in erster Linie für die quantitative Analyse pathologischer Bilder konzipiert.

Referenzen

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Suzuki, H., et al. Long-term survival after endoscopic resection for gastric cancer: Real-world evidence from a multicenter prospective cohort. Clin Gastroenterol Hepatol. 21 (2), 307-318.e2 (2023).
  3. Ma, S., et al. Clinical application and detection techniques of liquid biopsy in gastric cancer. Mol Cancer. 22 (1), 7(2023).
  4. Ugai, T., et al. Is early-onset cancer an emerging global epidemic? Current evidence and future implications. Nat Rev Clin Oncol. 19 (10), 656-673 (2022).
  5. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8 (8), Cd004064(2017).
  6. Chao, J., et al. Assessment of pembrolizumab therapy for the treatment of microsatellite instability-high gastric or gastroesophageal junction cancer among patients in the keynote-059, keynote-061, and keynote-062 clinical trials. JAMA Oncol. 7 (6), 895-902 (2021).
  7. Lee, K. W., et al. Association of tumor mutational burden with efficacy of pembrolizumab±chemotherapy as first-line therapy for gastric cancer in the phase III Keynote-062 study. Clin Cancer Res. 28 (16), 3489-3498 (2022).
  8. Wainberg, Z. A., et al. Efficacy of pembrolizumab monotherapy for advanced gastric/gastroesophageal junction cancer with programmed death ligand 1 combined positive score ≥10. Clin Cancer Res. 27 (7), 1923-1931 (2021).
  9. Zhao, J. J., et al. Low programmed death-ligand 1-expressing subgroup outcomes of first-line immune checkpoint inhibitors in gastric or esophageal adenocarcinoma. J Clin Oncol. 40 (4), 392-402 (2022).
  10. Zhu, Q., Zhang, R., Zhao, Z., Xie, T., Sui, X. Harnessing phytochemicals: Innovative strategies to enhance cancer immunotherapy. Drug Resist Updat. 79, 101206(2025).
  11. Khosravi, G. R., et al. Immunologic tumor microenvironment modulators for turning cold tumors hot. Cancer Commun (Lond). 44 (5), 521-553 (2024).
  12. Gibney, G. T., Weiner, L. M., Atkins, M. B. Predictive biomarkers for checkpoint inhibitor-based immunotherapy. Lancet Oncol. 17 (12), e542-e551 (2016).
  13. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  14. Naidoo, J., et al. Toxicities of the anti-PD-1 and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies. Ann Oncol. 27 (7), 1362(2016).
  15. Yang, M., Lin, W., Huang, J., Mannucci, A., Luo, H. Novel immunotherapeutic approaches in gastric cancer. Precis Clin Med. 7 (4), pbae020(2024).
  16. Germain, C., et al. Characterization of alternatively spliced transcript variants of clec2d gene. J Biol Chem. 285 (46), 36207-36215 (2010).
  17. Boles, K. S., Barten, R., Kumaresan, P. R., Trowsdale, J., Mathew, P. A. Cloning of a new lectin-like receptor expressed on human NK cells. Immunogenetics. 50 (1-2), 1-7 (1999).
  18. Rosen, D. B., et al. Cutting edge: Lectin-like transcript-1 is a ligand for the inhibitory human nkr-p1a receptor. J Immunol. 175 (12), 7796-7799 (2005).
  19. Germain, C., et al. Induction of lectin-like transcript 1 (llt1) protein cell surface expression by pathogens and interferon-γ contributes to modulate immune responses. J Biol Chem. 286 (44), 37964-37975 (2011).
  20. Marrufo, A. M., et al. Blocking llt1 (clec2d, ocil)-nkrp1a (cd161) interaction enhances natural killer cell-mediated lysis of triple-negative breast cancer cells. Am J Cancer Res. 8 (6), 1050-1063 (2018).
  21. Germain, C., et al. Lectin-like transcript 1 is a marker of germinal center-derived B-cell non-Hodgkin's lymphomas, dampening natural killer cell functions. Oncoimmunology. 4 (8), e1026503(2015).
  22. Roth, P., et al. Malignant glioma cells counteract antitumor immune responses through expression of lectin-like transcript-1. Cancer Res. 67 (8), 3540-3544 (2007).
  23. Sanchez-Canteli, M., et al. Lectin-like transcript 1 (llt1) checkpoint: A novel independent prognostic factor in hpv-negative oropharyngeal squamous cell carcinoma. Biomedicines. 8 (12), 535(2020).
  24. Braud, V. M., et al. Expression of llt1 and its receptor CD161 in lung cancer is associated with better clinical outcome. Oncoimmunology. 7 (5), e1423184(2018).
  25. Mathewson, N. D., et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis. Cell. 184 (5), 1281-1298.e26 (2021).
  26. Guo, L., et al. Association of increased B7 protein expression by infiltrating immune cells with progression of gastric carcinogenesis. Medicine (Baltimore). 98 (8), e14663(2019).
  27. Quan, Q., et al. Expression and clinical significance of PD-L1 and infiltrated immune cells in the gastric adenocarcinoma microenvironment. Medicine (Baltimore). 102 (48), e36323(2023).
  28. Varaden, D., Moodley, J., Onyangunga, O. A., Naicker, T. Morphometric image analysis of placental c-type lectin domain family 2, member d (clec2d) immuno-expression in hiv associated pre-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol X. 3, 100039(2019).
  29. Chen, S., et al. B7-h3 and CD47 co-expression in gastric cancer is a predictor of poor prognosis and potential targets for future dual-targeting immunotherapy. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (18), 16609-16621 (2023).
  30. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature. 513 (7517), 202-209 (2014).
  31. Cristescu, R., et al. Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med. 21 (5), 449-456 (2015).
  32. Thorsson, V., et al. The immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830.e14 (2018).
  33. Tumeh, P. C., et al. Pd-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  34. Lopez De Rodas, M., et al. Biological and clinical significance of tumour-infiltrating lymphocytes in the era of immunotherapy: A multidimensional approach. Nat Rev Clin Oncol. , (2025).
  35. Myojin, Y., et al. Multiomics analysis of immune correlatives in hepatocellular carcinoma patients treated with tremelimumab plus durvalumab. Gut. , (2025).
  36. Marvel, D., Gabrilovich, D. I. Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: Expect the unexpected. J Clin Invest. 125 (9), 3356-3364 (2015).
  37. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J., Fridman, W. H. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 19 (6), 307-325 (2019).
  38. Ye, Z., et al. Gastric cancer-derived exosomal let-7 g-5p mediated by serpine1 promotes macrophage m2 polarization and gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 2(2025).
  39. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  40. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  41. Xiong, S., Dong, L., Cheng, L. Neutrophils in cancer carcinogenesis and metastasis. J Hematol Oncol. 14 (1), 173(2021).
  42. Mantovani, A., Locati, M. Tumor-associated macrophages as a paradigm of macrophage plasticity, diversity, and polarization: Lessons and open questions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1478-1483 (2013).
  43. Niu, X., et al. Autophagy in cancer development, immune evasion, and drug resistance. Drug Resist Updat. 78, 101170(2025).
  44. Ikeda, H., et al. Immune evasion through mitochondrial transfer in the tumour microenvironment. Nature. 638 (8049), 225-236 (2025).
  45. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol. 9 (3), 162-174 (2009).
  46. Pan, Y., et al. The protective and pathogenic role of Th17 cell plasticity and function in the tumor microenvironment. Front Immunol. 14, 1192303(2023).
  47. Smyth, M. J., et al. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma. J Exp Med. 192 (5), 755-760 (2000).
  48. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  49. Galon, J., Bruni, D. Approaches to treat immune hot, altered, and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov. 18 (3), 197-218 (2019).
  50. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

LLT1 ExpressionImmun CheckpointTumormikroumgebungImmunzellinfiltrationPD L1 ExpressionCD8 T ZellenImmunhistochemieMultiplex Immunfluoreszenz

Verwandte Artikel