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Methodenartikel

Chemische Bildgebung mit ultrahohem Informationsgehalt mit Breitband-kohärenter Anti-Stokes-Raman- und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie

1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/68845

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7. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine multimodale Bildgebungsplattform vorgestellt, die breitbandige kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (BCARS), Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (TPEF) und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (2p-FLIM) kombiniert und so ein chemisches Bioimaging mit extrem hohem Informationsgehalt ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Raman-Fingerabdruckspektroskopie und die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung sind neue Werkzeuge für die Untersuchung von Stoffwechselprofilen biologischer Proben. Während die Raman-Fingerabdruckspektroskopie intrinsische molekulare Schwingungen erkennt, die die molekulare Zusammensetzung und die chemische Umgebung einer Probe widerspiegeln, misst die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung Änderungen in der Lebensdauer des angeregten Zustands von Fluorophoren, die empfindlich auf ihre Mikroumgebungen reagieren. Hier stellen wir eine multimodale Bildgebungsplattform vor, die breitbandige kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (BCARS) und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (2p-FLIM) kombiniert und biologisch relevante Raman-Fingerabdruckspektren und Fluoreszenzlebensdauersignale in vivo und gleichzeitig erfassen kann. Die enormen chemischen Informationen, die aus räumlich co-registrierten BCARS- und 2p-FLIM-Bildern gewonnen werden, ermöglichen es uns, die feinen Unterschiede zwischen subzellulären Kompartimenten zu charakterisieren und die potenziellen falsch-positiven Ergebnisse zu verifizieren, die allein durch die Fluoreszenzbildgebung erzeugt werden. Dies wird durch den direkten Vergleich der BCARS-, 2p-FLIM- und Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz-Signale (TPEF) demonstriert, die gleichzeitig von derselben farbstoffgefärbten Organelle in den lebenden, intakten C. elegans erhalten wurden, die einen grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Marker exprimieren. In dieser Arbeit stellen wir das BCARS/2p-FLIM/TPEF-Setup-Schema, die Bildaufnahmeschritte, die Datenverarbeitung und repräsentative Ergebnisse vor, die zeigen, dass die crossmodale Bildgebungsmethode eine rigorose Charakterisierung und in vivo Detektion bei subzellulärer Auflösung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die gleichzeitige chemische und Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung, um die Genauigkeit der biologischen Interpretation in komplexen lebenden Systemen zu verbessern.

Einleitung

Eine Herausforderung in biologischen Studien besteht darin, biologische Baustoffe in ihrem ursprünglichen Zustand und in der intakten Architektur von Zellen und Geweben genau nachzuweisen. Die Raman-Spektroskopie zeigt ein beispielloses Potenzial für den Nachweis von intrinsischen Metaboliten und chemischen Spezies in biologischen Proben und wurde kürzlich als aufstrebendes Werkzeug für die Erstellung von Stoffwechselprofilen biologischer Proben anerkannt1. Durch die Analyse der Peaks verschiedener Stoffwechselgruppen, die in Raman-Fingerabdruckspektren gezeigt werden, gibt es immer mehr Beweise dafür, dass die Fingerabdruckmerkmale zur Erkennung der frühen Stadien von Krankheiten wie Krebs 2,3,4, Herzerkrankungen 5,6 und neurodegenerativen Erkrankungenverwendet werden können 7,8 und besonders nützlich sind, um grundlegende biologische Probleme zu lösen 9,10 Dazu gehören die Abbildung intrazellulärer Strukturen ohne Markierungsstörung11, die Differenzierung verschiedener Zellzustände12,13 und die Zelltypklassifikation 14,15,16. Der größte Teil der chemischen Information ( > 90 %), die in den Raman-Spektren kodiert ist, befindet sich im Fingerabdruckbereich (500 bis 1800 cm-1), was diesen Bereich bei weitem am nützlichsten für die Unterscheidung chemischer Zusammensetzungen in biologischen Proben macht17. Das schwache Raman-Signal in diesem Frequenzbereich macht die Anwendung der Raman-Fingerabdruckspektroskopie in biologischen Studien jedoch zu einer Herausforderung, insbesondere für lebende, intakte biologische Proben1.

Kohärente Raman-Imaging-Ansätze (CRI) verkürzen die Erfassungszeit von Raman-Signalen erheblich, aber die meisten von ihnen erfassen relativ schmale Spektralsegmente und sind für die starken CH-Dehnungssignale zwischen 2800 und 3100 cm-1 optimiert. Schmalbandige CARS und stimulierte Raman-Streuung (SRS) (Abbildung 1A,B) verwenden zwei Pikosekundenpulse, in der Regel, um einen schmalen Teil des starken CH-Signals 18,19,20,21,22,23 zu erfassen. Multiplex-CRI-Ansätze, wie z. B. Multiplex-CARS (Abbildung 1C), verwenden eine Kombination aus einer Pikosekunde und ~100 fs-Impulsen, um einen moderaten Spektralbereich (normalerweise ≤ 400 cm-1) zu erhalten, der normalerweise im CH-Bereich 24,25,26,27,28,29,30 liegt. Die Erfassung eines gesamten biologisch relevanten Raman-Spektrums (von 600 - 3200 cm-1) pro Pixel mit diesen bildgebenden Ansätzen ist in der Regel unerschwinglich, da die meisten Fingerabdrucksignale 10-100 Mal schwächer sind als CH-Dehnungssignale31. Im Gegensatz zu den meisten CRI-Ansätzen ist die breitbandige kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (BCARS) für die Single-Shot-Breitbanderfassung optimiert, die den Fingerabdruck und die CH-Dehnungsbereiche 31,32,33 abdeckt. BCARS nutzt Intra-Puls-Wechselwirkungen eines ~10 fs-Impulses, um niederfrequente (Fingerabdruck-)Schwingungen effizient anzuregen (Abbildung 1D), und verwendet den gleichen Mechanismus wie Multiplex-CARS, die Kombination des fs-Impulses mit einem ps-Impuls, um Schwingungskohärenz im CH-Dehnungsbereich zu erzeugen (Abbildung 1C)32,33. Darüber hinaus sind die BCARS-Signale aufgrund ihrer Wechselwirkung mit dem nicht-resonanten Hintergrund (NRB) intrinsisch kalibriert, was zu einem quantitativen und instrumenteninvarianten vollen Raman-Spektrum pro Laserpuls an jedem Pixel 31 führt, mit der Fähigkeit, schnell Daten mit hohem Informationsgehalt von Zellen, intakten Geweben und lebenden biologischen Organismen zu erfassen32,34,35,36,37,38,39.

Die aufgenommenen BCARS-Rohspektren enthalten einen starken sogenannten "non-resonanten Hintergrund" (NRB). Der NRB ist der Beitrag der elektronischen Reaktion auf die Laserpulse, der chemisch nicht spezifisch ist. Der NRB interferiert kohärent mit dem schwingungsschwingungsresonanten Signal, indem er als Heterodynverstärker32 wirkt. Der NRB verzerrt auch das zugrundeliegende Raman-Spektrum (Abbildung 2A), aber das Raman-Spektrum kann abgerufen werden, solange signifikante zusammenhängende Spektralabschnitte erfasst werden. Derzeit gibt es keine Nachbearbeitungsmethode, um das resonante CARS-Signal von der nicht-resonanten Komponente unter Verwendung eines schmalbandigen CARS-Ansatzes zu trennen. Die Gewinnung des Raman-Signals aus dem breitbandigen CARS-Signal kann unter Verwendung der Kramers-Kronig-Beziehung im Zeitbereich (oder der Hilbert-Transformation)33,40 (Abbildung 2B), der maximalen Entropie41,42 oder des maschinellen Lernens 43,44,45,46,47,48 erreicht werden Annäherungen. Beachten Sie, dass die ersten beiden Methoden die Phase (das resonante Raman-Signal) analytisch aus den rohen BCARS-Spektren abrufen, die Ansätze des maschinellen Lernens können stark von der Instrumentierung und den Trainingsmodellen abhängen.

Während die BCARS-Mikroskopie eine markierungsfreie Charakterisierung des metabolischen Profilings biologischer Proben ermöglicht, kann derselbe Superkontinuumslaser (950 - 1200 nm für den in dieser Arbeit vorgestellten BCARS-Aufbau), der für die BCARS-Signalerzeugung verwendet wird, auch eine breite Palette von Farbstoffen anregen, wie z. B. Rhodamin-basierte, Bodipy-basierte, Alexa-Fluor-basierte und Cyanin-basierte Farbstoffe sowie verschiedene fluoreszierende Proteine, einschließlich GFP und mCherry49. 50. Im Vergleich zur Einzelphotonen-Anregung mit sichtbaren Dauerstrichlasern (CW) bietet die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie, wie z. B. die Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (2p-FLIM) und die Zwei-Photonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie (TPEF), mit Nahinfrarotlicht (NIR) eine tiefere Probeneindringtiefe, intrinsische 3D-Schnittfähigkeit, kontrastreiche Bilder und eine gute Auflösung, die mit der modernen konfokalen Mikroskopie vergleichbar ist, was sie zu einem attraktiven Werkzeug für die biologische Forschung 51,52. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) unter Verwendung eines zeitkorrelierten Einzelphotonenzählverfahrens (TCSPC) detektiert die Fluoreszenzzerfallssignale, die wiederholt von einer zeitmodulierten Laserquelle angeregt werden53,54. Das Fluoreszenzspektrum eines bestimmten Fluorophors kann sich mit Umweltfaktoren wie der Polarität des Lösungsmittels ändern, aber diese Änderungen sind in der Regel subtil. Auf der anderen Seite variiert die Lebensdauer der Fluoreszenz oft um zwei oder mehr Faktoren mit Umweltänderungen wie pH-Werten55, Viskosität56, Polarität57 und Konzentration ionischer Spezies58,59, Bindungswechselwirkungen, dem Vorhandensein von Quenchern oder strukturellen Veränderungen53,54. Diese einzigartige Eigenschaft der Fluoreszenzlebensdauer sorgt für einen zusätzlichen Signalkontrast in der Fluoreszenzbildgebung und hat erfolgreich die Probleme der Autofluoreszenzinterferenz in der Zell- und Gewebebildgebung60 gelöst, die Entmischung mehrerer Fluorophore unter Verwendung eines spektral aufgelösten FLIM-Ansatzes61, die Überwachung der Krebsdiagnose und -behandlung62, die markierungsfreie Detektion zellulärer Heterogenität63 und metabolische Veränderungen64,65.

In dieser Arbeit stellen wir eine multimodale Bildgebungsplattform vor, die BCARS, 2p-FLIM und TPEF kombiniert. Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass eine Bildgebungsplattform vorgestellt wird, die gleichzeitige BCARS- und 2p-FLIM/TPEF-Bildgebung ermöglicht. Wir demonstrieren die in vivo Bildgebungsmöglichkeiten dieses Instruments anhand eines weit verbreiteten genetisch manipulierbaren Modellorganismus, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Wir zeigen, dass die BCARS-Spektren, die 2p-FLIM-Zerfälle von Nilrot (einem lebenswichtigen Lipidfarbstoff) und die Zwei-Photonen-Fluoreszenz-GFP-Signale eines berichteten Lipidmarkers (DHS-3::GFP) gleichzeitig in vivo von Nilrot-gefärbten Würmern erfasst werden können. Ein praktischer Leitfaden für den hier vorgestellten Bildgebungsansatz beinhaltet: (i) die Probe sollte optisch transparent sein und eine Dicke von typischerweise weniger als 100 μm aufweisen; (ii) Der Färbezustand kann je nach Farbstoff und Probe unterschiedlich sein. In den hier gezeigten Ergebnissen der Nilrot-Färbung von C. elegans liegt die Nilrot-Konzentration bei ~μM, und die Färbezeit kann von einigen Stunden bis über Nacht reichen66; (iii) Eine dunkle Probenumgebung ist erforderlich, um ein Eindringen von sichtbarem Licht in die 2p-FLIM/TPEF-Detektoren zu vermeiden. Diese Bildgebungsbedingungen sind identisch mit den Bildgebungsbedingungen der meisten nichtlinearen optischen und Fluoreszenzmikroskopie. Darüber hinaus kann unser hier demonstriertes System weiter eingesetzt werden, um neben Nilrot und GFP auch andere Farbstoffe und Fluoreszenzreporter zu detektieren, indem ein zusätzlicher Ti:Saphir fs-Laser eingeführt wird, der den Bereich von 700 bis 950 nm für die Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung abdeckt. Während also die in diesem Protokoll beschriebenen repräsentativen Ergebnisse die in vivo-Bildgebung von farbstoffgefärbten C. elegans , die GFP exprimieren, sind, hat die chemische Bioimaging-Plattform mit ultrahohem Informationsgehalt Anwendungen, die breit und weitreichend sind.

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Protokoll

1. C . elegans Probenvorbereitung und Nile Red Vital Färbung

HINWEIS: C. elegans wird aufgrund seiner Ganzkörpertransparenz häufig für mehrere bildgebende Verfahren verwendet. Die inneren Organe und Gewebe können am intakten Tier ohne Dissektion leicht abgebildet werden. Darüber hinaus ist für Forschungen mit C. elegans keine ethische Genehmigung erforderlich, da sie nicht als Wirbeltiere gelten und nicht den gleichen ethischen Vorschriften unterliegen wie höhere Tiere wie Nagetiere. Dieser Abschnitt beschreibt die Synchronisation von C. elegans-Würmern und die Vorbereitung von Nilrot-gefärbten Proben für die Fluoreszenzbildgebung. Synchronisierte adulte Würmer werden über ein Zwei-Generationen-Eiablageprotokoll gewonnen und mit frisch vorbereiteten Nile Red-OP50-Platten gefärbt.

  1. Bewahren Sie die C. elegans-Stämme (z. B. N2, LIU1, ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) auf Standardplatten mit Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) auf, die mit OP50-Bakterien besiedelt sind, bei 20 °C.
  2. Synchronisieren Sie die Würmer
    1. Pflücken Sie 10-20 trächtige adulte Würmer auf eine frisch hergestellte NGM-Platte mit OP50-Saat.
    2. Inkubieren Sie die Platte bei 20 °C für 1-3 Stunden, um die Eiablage zu ermöglichen.
    3. Entfernen Sie alle erwachsenen Würmer und lassen Sie nur die frisch gelegten Eier auf dem Teller liegen.
    4. Inkubieren Sie die Platte bei 20 °C, bis die Würmer das eintägige Erwachsenenstadium erreichen.
    5. Wiederholen Sie die obigen Schritte für eine weitere Generation, um die Synchronisationsgenauigkeit zu verbessern.
  3. Nilrote Stammlösung zubereiten
    1. Lösen Sie 15,92 mg Nilrot in 10 mL DMSO bis zu einer Endkonzentration von 5 mM.
    2. Bei Bedarf 10-30 Minuten beschallen, um die Auflösung zu unterstützen.
  4. Bereiten Sie Nile Red-OP50 Färbeplatten vor.
    1. Mischen Sie OP50 Bakterienschlämme gründlich mit der Nilrot-Brühe, um eine endgültige Nilrot-Konzentration von 5 μM pro NGM-Platte zu erreichen. Mischen Sie zum Beispiel 10 μl der Nilrot-Brühe mit 20 μl OP50-Bakterienaufschlämmung und tragen Sie dann sofort die gesamte Mischung auf eine unbesäte 6 cm (mit ~10 mL Volumen) NGM-Agarplatte auf, um eine endgültige Nilrot-Konzentration von 5 μM pro NGM-Platte zu erhalten.
    2. Die Mischung gleichmäßig auf unbesäte 6 cm NGM-Platten verteilen.
    3. Lagern Sie die Platten über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur, um das Bakterienwachstum und die Aufnahme von Farbstoffen zu ermöglichen.
  5. Fleckensynchronisierte Würmer
    1. Übertragen Sie 30-50 synchronisierte adulte Würmer an einem Tag auf jede vorbereitete Nile Red-OP50-Platte.
    2. Inkubieren Sie die Würmer im Dunkeln bei 20 °C für 1-2 h vor der Bildgebung.
  6. Immobilisierung von Würmern für die Bildgebung
    1. Tragen Sie einen Tropfen 100 mM Natriumazid auf ein 2%iges Agarose-Pad auf einen Objektträger auf (ca. 10-15 μl für 20 Würmer)
    2. Übertragen Sie die gefärbten Würmer in das Narkosemittel (Natriumazid), lassen Sie sie fallen und bedecken Sie die Würmer vor der Mikroskopie mit einem Deckglas.
      HINWEIS: Wenn Sie im ersten Schritt der Eiablagesynchronisation 10-20 trächtige adulte Tiere auf eine frisch hergestellte NGM OP50-Platte pflücken, pflücken Sie nur die adulten Tiere, aber keine streunenden Eier oder Larven. Damit soll sichergestellt werden, dass alle verbleibenden Eier auf den Tellern von den gepflückten Würmern innerhalb des Zeitfensters von 1-3 h für die Eiablage produziert werden. Darüber hinaus wird Natriumazid als Gefahrstoff eingestuft, obwohl es eine sehr geringe Menge für die Nematodenanästhesie benötigt. Die Verwendung und Entsorgung von Natriumazidabfällen muss den Richtlinien der institutionellen Abteilung für Umwelt, Gesundheit und Sicherheit entsprechen.

2. Erzeugung des Sondenstrahls

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung des Pikosekunden-Sondenstrahls (ps) unter Verwendung eines selbstgebauten optisch-parametrischen Oszillators (OPO), gefolgt von der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) mit einem selbst gebauten Signal-Feedback-Schleifensystem zur Stabilisierung der Ausgangsleistung des Sondenstrahls.

  1. Schalten Sie den 1030-nm-OPO-Pumplaser ein (Abbildung 3A oder der in Abbildung 4 gezeigte nahe 1ps, ~3 W OPO-Pumplaser) und warten Sie mindestens 2 Stunden für den thermischen Ausgleich. Ein stabiler Ausgang ist für den OPO-Betrieb von entscheidender Bedeutung.
  2. Führen Sie den Ausgang in den OPO-Hohlraum
    1. Wählen Sie die geeignete Polperiode auf dem OPO PPLN-Kristall (Abbildung 3A) aus, um sie an die Wellenlänge des Zielsignals anzupassen.
    2. Richten Sie den Strahl auf den ersten gekrümmten Spiegel (CM) (Abbildung 3A), der Teil eines linearen Hohlraums ist.
    3. Stellen Sie sicher, dass der Strahl durch den periodisch gepolten OPO-Pol-Lithium-Niobat-Kristall (PPLN) gelangt (Abbildung 3A), um die optisch-parametrische Abwärtskonvertierung zu erleichtern (Abbildung 3B).
    4. Stellen Sie sicher, dass der Strahl von einem zweiten gekrümmten Spiegel (CM) und dann vom Endspiegel (EM) reflektiert wird (Abbildung 3A), um die Hohlraumschleife zu bilden.
    5. Konfigurieren Sie den Ausgangskoppler (OC) (Abbildung 3A), um den erzeugten Signalstrahl aus dem Resonator zu extrahieren.
  3. Stellen Sie die Temperatur des OPO PPLN-Kristalls mit dem Temperaturregler (TC) (Abbildung 3A) ein, um die Signalwellenlänge auszuwählen. Eine typische Signalwellenlänge beträgt 1530 nm, was einer Ausgangsleistung von ca. 0,8 W entspricht, wenn sie mit 3 W bei 1064 nm gepumpt wird.
  4. Optimieren Sie die OPO-Ausrichtung
    1. Passen Sie die Position und Neigung von zwei CMs und EM an, um die Ausgangsleistung und Strahlqualität zu maximieren.
    2. Passen Sie die Kavitätenlänge an, um das Signalspektrum auf die gewünschte Frequenz zu verschieben.
  5. Leiten Sie den OPO-Signalstrahl durch eine Reihe von Kollimations- und Fokussieroptiken und leiten Sie ihn in die SHG-Stufe.
    1. Wählen Sie die geeignete Polperiode auf dem SHG PPLN-Kristall (Abbildung 3A), um sie an die Wellenlänge des Zielsignals anzupassen.
    2. Steuern Sie die Kristalltemperatur präzise mit einem Temperaturregler, um die SHG-Effizienz zu maximieren.
    3. Richten Sie den Strahl zur Erzeugung der zweiten Harmonischen in den SHG PPLN-Kristall und wandeln Sie das 1530-nm-OPO-Signal in 765 nm um (Abbildung 3C). Der typische SHG-Umwandlungswirkungsgrad beträgt unter optimalen Ausrichtungsbedingungen etwa 30 %.
    4. Setzen Sie nach dem SHG PPLN einen 1300-nm-Kurzpassfilter (SPF in Abbildung 3A, Spezifikationen in der Materialtabelle) ein, um das restliche 1530-nm-Grundlicht zu entfernen.
    5. Kollimieren Sie den resultierenden 765-nm-Strahl mit einer geeigneten Linse (wie L in Abbildung 3A).
  6. Implementieren Sie die Leistungsstabilisierung
    1. Verwenden Sie ein Keilfenster (WW), um den SHG-Strahl abzutasten und auf eine Fotodiode (PD) zu richten.
    2. Stellen Sie sicher, dass eine Rückkopplungsschleife das Fotodiodensignal (PD in Abbildung 3A) mit einem Referenzwert vergleicht und den Picomotor am Endspiegel (EM) ansteuert, um die OPO-Hohlraumlänge in Echtzeit anzupassen und so die SHG-Ausgangsleistung zu stabilisieren.
      HINWEIS: Um den Referenzwert zu ermitteln, scannen Sie zuerst die EM-Position mit dem Picomotor, während Sie die SHG-Ausgangsleistung aufzeichnen. Identifizieren Sie die Peakintensität in diesem Profil und legen Sie dann den Referenzwert auf 90 % des Peaks fest. Diese Wahl gewährleistet eine klare Richtung der Rückkopplungskorrektur, so dass das System sowohl steigende als auch abnehmende Leistungstrends ausgleichen und die Ausgangsleistung im Laufe der Zeit effektiv stabilisieren kann.

3. Generierung von Superkontinuum (SC) für BCARS

HINWEIS: Das vereinfachte Schema des BCARS-basierten multimodalen Systems ist in Abbildung 4 dargestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung des SC-Strahls.

  1. Passen Sie den Pre-Chirp (Group Delay Dispersion, GDD) an die Femtosekunden-Impulsausgabe (fs) (1030 nm, 150 fs, ~1 W) an, um eine ausreichend große SC-Bandbreite zu erhalten, die die Signale im Fingerabdruckbereich abdeckt (SC-Bandbreite ≥ 1800 cm-1). Erreichen Sie dies, indem Sie den Abstand eines Gitterpaares anpassen (siehe Abbildung 4), was eine präzise Kontrolle über die Dispersion ermöglicht.
    HINWEIS: Die Anwendung von vorkompensiertem GDD ist entscheidend für die Erzeugung des gewünschten Impulses und die Optimierung der SC-Erzeugung. Der erforderliche GDD-Wert kann je nach den spezifischen Eigenschaften des verwendeten Lasersystems variieren.
  2. Integrieren Sie ein Strahlteleskop, das aus zwei Linsen mit gleichen Brennweiten besteht, um die Divergenz des Pumpstrahls einzustellen.
    HINWEIS: Wenn der Strahl über Meter zurücklegt, bevor er in die Verbreiterungsfaser eintritt, ist eine präzise Steuerung der Strahldivergenz unerlässlich. Die Aufrechterhaltung eines kollimierten Strahls während dieser Distanz ist entscheidend für eine effiziente SC-Erzeugung.
  3. Richten Sie den Auto-Aligner (Abbildung 4) mit kinematischen Spiegelhalterungen ein, die mit Piezoaktoren für die Strahllenkung ausgestattet sind. Kombinieren Sie diese mit optischen Keilen und einem Positionsdetektor (PSD), um die Strahlausrichtung aktiv zu überwachen und zu korrigieren.
  4. Positionieren Sie die Komponenten so, dass der Abstand vom Keil zum ersten Spiegel dem Abstand vom Keil zum ersten PSD entspricht. Diese symmetrische Konfiguration gewährleistet die Stabilität der Strahlausrichtung in die Verbreiterungsfaser.
    HINWEIS: Die aktive Ausrichtung ist unerlässlich, um die Effizienz der spektralen Verbreiterung zu maximieren und das Risiko einer Beschädigung der Faserzufuhr zu minimieren.
  5. Verwenden Sie eine Halbwellenplatte (HWP) und einen Polarisationsstrahlteiler (PBS), um die Laserleistung zu steuern, bevor sie in die Faser eingekoppelt wird. Drehen Sie den HWP, um den Polarisationswinkel relativ zum PBS einzustellen und so die übertragene Leistung zu optimieren. Obwohl diese Komponenten in Abbildung 4 nicht dargestellt sind, sind sie für die sichere Ausrichtung und Leistungssteuerung von entscheidender Bedeutung.
  6. Einkoppeln Sie ca. 1 W Laserleistung mit einem Faserkoppler in eine 10 cm große LMA-PM-5 photonische Kristallfaser (Large-Mode-Area Polarization Keeping) mit einem Faserkoppler. Das Kopplungsverfahren ist wie folgt:
    1. Reduzieren Sie zunächst die Laserleistung während der ersten Ausrichtung auf ~20-50 mW, um Schäden an der Faser zu vermeiden.
    2. Richten Sie den kollimierten Strahl in die Faser und stellen Sie sicher, dass etwas Licht von der anderen Seite austritt. Optimieren Sie den Strahlengang, indem Sie seine Position anpassen, um die Ausgangsleistung zu maximieren.
    3. Setzen Sie die asphärische Linse ein (Abbildung 4), und stimmen Sie den Strahl erneut feinab, um die Ausgangsleistung zu maximieren.
    4. Passen Sie die Z-Position der asphärischen Linse an, um eine präzise Fokussierung auf die Faserfacette zu gewährleisten.
    5. Wiederholen Sie die Ausrichtungs- und Fokuseinstellungen iterativ, um die Kopplungseffizienz zu maximieren.
    6. Erhöhen Sie die Laserleistung für den Betrieb auf 1 W.
  7. Kollimieren Sie den resultierenden Breitband-Superkontinuumsausgang (SC) des PCF mit einem Off-Axis-Parabolspiegel (OAP) mit einer Brennweite f = 15 mm, wie in Abbildung 4 gezeigt.
    HINWEIS: Reflektierende Optiken, wie z. B. der OAP-Spiegel, werden für Breitbandstrahlen bevorzugt, um die chromatische Aberration durch refraktive Elemente zu minimieren.
  8. Führen Sie den Ausgang des kollimierten Breitband-Superkontinuums (SC) in einen Prismenkompressor (Abbildung 4), der aus einem Paar Schott Flint (SF10) Prismen besteht.
    1. Richten Sie den SC-Strahl auf die Spitze des ersten Prismas, um die spektrale Dispersion zu initiieren.
    2. Positionieren Sie das zweite Prisma so, dass der dispergierte Strahl durch seinen Scheitelpunkt eintritt.
    3. Montieren Sie beide Prismen auf einem Schienensystem, um eine Grobjustierung des Prismenabstands zu ermöglichen. Verschieben Sie das zweite Prisma entlang der Schiene, um die Länge des optischen Pfads und die Gesamtkompression anzupassen. Der Abstand für dieses System beträgt 44 cm.
    4. Montieren Sie das erste Prisma auf einem linearen Präzisionsverschiebetisch. Passen Sie die Einfügetiefe des ersten Prismas an, um die Dispersionskompensation fein abzustimmen.
    5. Passen Sie sowohl den Prismenabstand als auch die Einfügelänge des zweiten Prismas iterativ an, um eine optimale zeitliche Kompression des SC-Impulses zu erreichen. Bestimmen Sie die optimale zeitliche Kompression, indem Sie das experimentell beobachtete degenerierte DFWM-Signal (Degenerate Four-Wave Mixing) mit simulierten Ergebnissen abgleichen, die die Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) und die Dispersion dritter Ordnung (TOD) berücksichtigen. Dieser Ansatz beinhaltet die Durchführung einer Simulation des Superkontinuums-Erzeugungsprozesses unter Einbeziehung der Effekte von GDD und TOD, die eine Referenz für die erwarteten zeitlichen und spektralen Eigenschaften der optimal komprimierten SC-Pulse liefert. Passen Sie dann iterativ die Parameter des Prismenkompressors an, um die im System vorhandenen GDD und TOD zu kompensieren, bis das experimentelle DFWM-Signal mit den Simulationsvorhersagen übereinstimmt. Ein typisches Ergebnis des spektralen Profils des SC ist in Abbildung 5 dargestellt.
      HINWEIS: Die richtige Dispersionskompensation verbessert die spektrale Kohärenz des SC. Bei optimaler Ausrichtung hat der SC-Ausgang eine Leistung von etwa 150 mW, eine Mittenwellenlänge von etwa 1060 nm und erstreckt sich über einen Spektralbereich von 950 bis 1200 nm (entsprechend 1800 cm-1). Diese Werte können je nach Ausrichtung und Effizienz der Faserkopplung leicht variieren.
  9. Kombinieren Sie den Sonden- und den Superkontinuumsstrahl mit einem dichroitischen Spiegel (siehe DM in Abbildung 4). Richten Sie sie mit einem Paar Lochblenden aus, um sicherzustellen, dass beide Balken kollinear sind. Fokussieren Sie die kombinierten Strahlen auf eine Hochfrequenz-Fotodiode (1 GHz Bandbreite). Für eine optimale Signalqualität müssen beide Strahlen sowohl im räumlichen als auch im zeitlichen Bereich überlappt werden. Der Prozess ist wie folgt:
    1. Leiten Sie den Ausgang der Fotodiode auf ein Hochfrequenz-Oszilloskop (500 MHz Bandbreite). Verwenden Sie den Laserauslöser als Referenzuhr.
    2. Blockieren Sie den Sondenstrahl und messen Sie die SC-Impulse. Notieren Sie die zeitlichen Differenzen zwischen den SC-Pulsen und der Laserreferenz.
    3. Blockieren Sie den SC-Strahl und messen Sie die Sondenimpulse. Stellen Sie die mechanische Verzögerungsleitung (wie in Abbildung 4 gezeigt) so ein, dass sich die Sondenimpulse zeitlich mit den SC-Impulsen überlappen. Stellen Sie sicher, dass die beiden Strahlen gleichzeitig ihr Maximum erreichen.
    4. Entfernen Sie die Fotodiode und lassen Sie den Strahl in das Mikroskop wandern.
      HINWEIS: Die obigen Schritte beschreiben eine grobe Anpassung für die Balkenüberlappung. Weitere Optimierungen für eine präzisere Ausrichtung werden in den Schritten 6.1 bis 6.9 behandelt.

4. Einrichten der Fluoreszenzdetektion für 2p-FLIM und TPEF und Einführung eines zusätzlichen Ti:Sapphire fs-Lasers

  1. Schalten Sie den Ti:Saphir-Laser ein und lassen Sie ihn das thermische Gleichgewicht erreichen. Warten Sie ca. 2 Stunden, um eine stabile Ausgangsleistung und Strahlausrichtung zu gewährleisten.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden TPEF- und FLIM-Bildgebung mit der SC-Quelle durchgeführt, die eine breite spektrale Abdeckung und eine ausreichende Leistung für Fluorophore wie GFP und Nilrot bietet. Der Ti:Saphir-Laser ist als optionale Anregungsquelle für Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsspitzen unter 950 nm im System enthalten, die möglicherweise nicht effizient durch den SC angeregt werden.
  2. Aktivieren Sie den Modus-Locking-Mechanismus am Ti:Saphir-Laser. Bestätigen Sie die stabile Modussperre über den eingebauten Monitor.
  3. Pre-Chirp der Ti:Saphir-Pulse für eine optimale zeitliche Kompression an der Probe mit einem Prismenkompressor. Ordnen Sie die Prismen in einer ähnlichen Konfiguration wie in Schritt 3.8 beschrieben an und passen Sie die Einfügelänge des zweiten Prismas an, um die Impulsdauer fein abzustimmen.
    HINWEIS: Die richtige zeitliche Kompression gewährleistet eine Spitzenintensität und eine effiziente Zwei-Photonen-Anregung in der Probenebene.
  4. (Fakultativ) Einkoppeln Sie den Ti:Saphir-Strahl in eine polarisationserhaltende Singlemode-Faser, wenn sich der Laser auf einem separaten optischen Tisch befindet. Passen Sie die Eingangskopplungsoptik an und überwachen Sie den Faserausgang, um Kopplungsverluste zu minimieren.
  5. Kombinieren Sie den Ti:Saphir-Strahl mit dem Superkontinuum (SC) und den Sondenstrahlen unter Verwendung eines dichroitischen Spiegels (siehe den Kombinationspunkt bei PBS in Abbildung 3). Richten Sie die Strahlen sorgfältig aus, um eine räumliche Überlappung an der dichroitischen Seite und eine gemeinsame Ausbreitung in Richtung des Mikroskops zu gewährleisten.
  6. Führen Sie die kombinierten Strahlen zum Mikroskop und stimmen Sie ihre räumliche Überlappung fein ab. Verwenden Sie eine fluoreszierende Probe (z. B. einen Objektträger mit 1 μm fluoreszierenden Polystyrolkügelchen), um die Ausrichtung des Ti:Saphir-Strahls relativ zum BCARS-Anregungspfad zu überprüfen. Passen Sie die Ti:Saphir-Ausrichtungsspiegel an, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzemission mit dem BCARS-Brennpunkt innerhalb desselben Bildgebungsfelds kolokalisiert ist. Bestätigen Sie die Kolokalisierung, indem Sie die Überlappung zwischen den gleichzeitig erfassten BCARS- und TPEF-Bildern visualisieren, wobei der räumliche Versatz weniger als ein Pixel betragen sollte.
    HINWEIS: Das Erreichen einer räumlichen Überlappung zwischen Fluoreszenz- und BCARS-Signalen ist für die multimodale Bildregistrierung unerlässlich.
  7. Setzen Sie einen dichroitischen Spiegel vor den Mikroskopeingang ein, um die rückgestreute Fluoreszenz in Richtung des Detektionspfads zu reflektieren. Wählen Sie eine dichroitische Wellenlänge mit einer geeigneten Grenzwellenlänge, um die Fluoreszenz effizient von den Anregungsstrahlen zu trennen.
  8. Setzen Sie einen zweiten dichroitischen Spiegel stromabwärts in den Emissionspfad ein, um das Fluoreszenzsignal in zwei Detektionszweige aufzuteilen:
    1. Übertragen Sie Wellenlängen ≥ 550 nm an den FLIM-Detektor.
    2. Reflektieren Sie Wellenlängen ≤ 550 nm in Richtung einer Photomultiplier-Röhre (PMT) für die Detektion analoger Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz (TPEF).
      HINWEIS: Installieren Sie in jedem Detektionszweig Bandpassfilter, um das Restanregungslicht zu blockieren und bestimmte Emissionsbanden zu isolieren.
  9. Schließen Sie den PMT-Ausgang an einen Vorverstärker an und speisen Sie das verstärkte Analogsignal in ein Datenerfassungsgerät (DAQ) ein. Teilen Sie den globalen Synchronisationstrigger vom Field Programmable Gate Array (FPGA) mit dem Datenerfassungsgerät, um die zeitliche Ausrichtung über die Bildgebungsmodalitäten hinweg sicherzustellen (Abbildung 7).
  10. Verbinden Sie den FLIM-Detektorausgang mit einem TCSPC-Modul (Time-Correlated Single-Photon Count).
    1. Verbinden Sie das FLIM-Detektorsignal mit dem Starteingang des TCSPC-Moduls.
    2. Verbinden Sie den Synchronisationsausgang des Ti:Sapphire-Lasers (oder BCARS SC) mit dem Referenzeingang des TCSPC-Moduls.
    3. Verbinden Sie den globalen Kameraauslöser (vom FPGA generiert) mit dem Frame-Sync-Eingang des TCSPC-Moduls, um ihn mit der zeilengescannten Bildaufnahme zu synchronisieren.

5. Einrichten des BCARS-Erkennungspfads

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines degescannten Detektionspfads für die hyperspektrale Zeilenabtastung. Der 1D-Galvospiegel tastet den Anregungsstrahl entlang der y-Achse mit einer Verweilzeit von 2-4 ms pro Pixel ab, um eine ausreichende Signalintegration zu gewährleisten. Nach jedem Zeilenscan bewegt sich der Probentisch einen Schritt entlang der x-Achse. Das Descanning mit einem synchronisierten sekundären Galvospiegel ist unerlässlich, um eine konsistente räumliche Registrierung des spektralen Signals auf der Kamera während der schnellen Strahlabtastung aufrechtzuerhalten, das Signalübersprechen zwischen benachbarten Pixeln zu eliminieren und die räumlich-spektrale Genauigkeit zu erhalten39.

  1. Führen Sie das Superkontinuum (SC) und die Sondenstrahlen in einen eindimensionalen (1D) Galvo-Scanner ein (wie in Abbildung 4 und weitere Details in Referenz39 gezeigt). Positionieren Sie das Galvospiegelkonjugat an der hinteren Öffnung des Fokussierobjektivs, um eine genaue Strahlabtastung über das gesamte Sichtfeld zu ermöglichen.
  2. Erweitern Sie jeden Strahl mit einem reflektierenden Strahlaufweiter (wie in Abbildung 4 gezeigt), um der hinteren Apertur des Anregungsobjektivs zu entsprechen. Dies sorgt für eine optimale Fokussierung und maximale räumliche Auflösung in der Probenebene.
    HINWEIS: Verwenden Sie reflektierende Optiken, um chromatische Aberrationen zu minimieren und den breitbandigen spektralen Gehalt des SC-Strahls zu erhalten.
  3. Platzieren Sie ein Ausrichtungsziel in der hinteren Blendenebene des Anregungsobjektivs. Stellen Sie den SC- und den Sondenstrahl so ein, dass beide durch die Mitte des Ziels verlaufen, um eine gemeinsame Ausrichtung entlang der optischen Achse zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die präzise räumliche Überlappung maximiert die BCARS-Signalstärke und gewährleistet eine maximale räumliche Auflösung im Fokuspunkt.
  4. Fokussieren Sie die Strahlen auf die Probe mit einem Anregungsobjektiv mit hoher NA (z. B. 1,2 NA, 60x Wasser-Immersionsobjektiv), das an einem inversen Mikroskop montiert ist.
  5. Bereiten Sie eine Ausrichtungsprobe vor, indem Sie einen Tropfen Wasser zwischen zwei Deckgläser legen, um einen versiegelten Objektträger zu erstellen. Legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Probe sichtbar wird.
  6. Sammeln Sie das erzeugte Anti-Stokes-Signal in der Übertragung mit Hilfe eines Sammelobjektivs, das gegenüber dem Anregungspfad platziert ist.
  7. Implementierung eines 4f-Descanning-Systems (wie in Abbildung 4 gezeigt), um die räumliche Zuordnung des Anti-Stokes-Signals auf feste Reihen des Detektors zu erhalten.
    1. Leiten Sie die hintere Brennebene (BFP) des Sammelobjektivs mit einem optischen 4f-System auf die Achse des Descanning-Galvospiegels. Diese besteht aus zwei Präzisionstubuslinsen (siehe Materialtabelle), die so angeordnet sind, dass:
      1. Das erste Objektiv wird eine Brennweite (200 mm) nach dem BFP des Sammelobjektivs platziert.
      2. Die zweite Linse wird eine Brennweite vor dem Galvospiegel platziert.
    2. Synchronisieren Sie den Descan-Galvo mit dem Scanning-Galvo mithilfe eines FPGA-gesteuerten Wellenformgenerators.
    3. Integrieren Sie ein digitales 7-Bit-Potentiometer in das FPGA-Steuerungssystem, um die Einstellung der Descan-Galvoamplitude zu ermöglichen.
      HINWEIS: Der Descan-Galvospiegel kompensiert die Winkelauslenkungen, die durch den primären Scan-Galvo verursacht werden. Durch die dynamische synchrone Anpassung seines Winkels wirkt es der Strahlbewegung entgegen und stellt sicher, dass das Anti-Stokes-Signal entlang der optischen Achse ausgerichtet bleibt, die in das Spektrometer führt. Diese Stabilisierung ist unerlässlich, um die räumliche Registrierung auf dem Detektor aufrechtzuerhalten und eine seitliche Verschiebung des Spektralbildes während des Scannens zu verhindern.
  8. Konfigurieren Sie das FPGA-System (siehe Materialtabelle), um Galvo-Scannen und Kamera-Triggern zu synchronisieren.
    1. Erzeugen Sie analoge Ausgänge für die Scan- und Descan-Galvos.
    2. Akzeptieren Sie einen Eingabestufen-Trigger, um den Beginn jedes Zeilenscans zu markieren.
    3. Der Ausgangsframe erfasst Triggersignale an die wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Kamera (sCMOS) an jeder Scanposition.
    4. Steuern Sie die Descan-Amplitude unabhängig voneinander, um unterschiedliche Sammelziele zu berücksichtigen.
      HINWEIS: Eine typische FPGA-Impulsfolge umfasst ein scannendes Galvo-Treibersignal, ein descannierbares Galvo-Antriebssignal, einen Stage-Trigger-Eingang und einen Pixeltakt für synchronisiertes Frame-Timing.
  9. Das kollimierte Anti-Stokes-Signal wird durch zwei Kurzpassfilter geleitet, um das Restpumpen- und SC-Anregungslicht zu blockieren.
  10. Fokussieren Sie das gefilterte Anti-Stokes-Signal durch den Eingangsschlitz des Spektrometers auf den sCMOS-Detektor. Passen Sie die Winkel sowohl des Scan- als auch des Descan-Galvos an, um sicherzustellen, dass der Strahl parallel zur Längsachse des Schlitzes gescannt wird, wobei die optische Bildebene mit dem Spalt ausgerichtet wird. Diese präzise Ausrichtung maximiert die spektrale Auflösung und minimiert das laterale Signalübersprechen über die Detektorreihen.
  11. Konfigurieren Sie das Spektrometer so, dass das Anti-Stokes-Spektrum vertikal entlang der Kamerareihen verteilt wird. Wählen Sie ein geeignetes Gitter (z. B. 300 Linien/mm, gebrannt bei 700 nm) für eine optimale spektrale Abdeckung.

6. Signaloptimierung und Kalibrierung der spektralen Auflösung

  1. Starten Sie die selbstentwickelte Erfassungssoftware und beginnen Sie mit der Echtzeit-Signalüberwachung von der sCMOS-Kamera. Die Erfassungssoftware ist in Python 3.8+ (Windows 10) selbst entwickelt und verfügt über Abhängigkeiten wie Hamamatsu DCAM-API und Measurement Computing Universal Library-Treiber, die Daten im HDF5-Format ausgeben. Software ist auf begründete Anfrage des entsprechenden Autors erhältlich.
  2. Bereiten Sie eine spektrale Kalibrierungsprobe vor, indem Sie einen Tropfen Benzonitril zwischen zwei Deckgläser geben, um einen versiegelten Objektträger zu bilden. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und bringen Sie ihn mit dem Anregungsobjektiv in den Fokus.
  3. Lokalisieren Sie das BCARS-Signal an der sCMOS-Kamera. Passen Sie die Z-Position des Sammelziels an, um die Intensität des Anti-Stokes-Signals zu maximieren.
  4. Passen Sie die seitliche Position des Sammelobjektivs an, um sicherzustellen, dass das Anti-Stokes-Licht durch den Eintrittsschlitz des Spektrometers korrekt fokussiert wird. Diese Ausrichtung sorgt für eine optimale Einkopplung in das Spektrometer und eine verbesserte spektrale Wiedergabetreue.
  5. Optimieren Sie die räumliche Überlappung zwischen dem Superkontinuum (SC) und den Sondenstrahlen in der Probenebene. Verwenden Sie Spiegel im Sondenstrahlengang, um die laterale Position und den Einfallswinkel fein einzustellen.
  6. Verschieben Sie die optische Verzögerungslinie im Sondengang, um eine zeitliche Überlappung mit den SC-Impulsen sicherzustellen. Überwachen Sie die Signalintensität und passen Sie sie an, bis das Anti-Stokes-Signal maximiert ist, um die korrekte zeitliche Synchronisation zu bestätigen.
  7. Identifizieren Sie einen starken, scharfen Raman-Peak in Benzonitril (z. B. 1002 cm-1) auf dem sCMOS-Bild.
  8. Notieren Sie die Sondenwellenlänge und die entsprechende Pixelposition auf der Kamera. Verwenden Sie die Rayleigh-Linie (0 cm-1 bei der Sondenwellenlänge) und die bekannten Benzonitril-Raman-Peaks bei 1002 cm-1 und 3073 cm-1 , um ein lineares Pixel-zu-Wellenzahl-Mapping über den sCMOS-Detektor zu erstellen. Die Rayleigh-Linie liefert die Null-Wellenzahl-Referenz, während die Benzonitril-Peaks das Wellenzahlinkrement pro Pixel bestimmen.
    HINWEIS: Da für die Analyse nur relative Wellenzahlinformationen benötigt werden (Abbildung zwischen Pixelposition und Raman-Verschiebung), ist eine absolute Wellenlängenkalibrierung mit Emissionslampen nicht erforderlich.
  9. Geben Sie die Pixel-Wellenzahl-Zuordnung in die Erfassungssoftware ein. Diese Kalibrierung sollte gültig bleiben, es sei denn, es werden Änderungen am Strahlengang, an der Gittereinstellung im Spektrometer oder an der Ausrichtung vorgenommen.

7. Signalerfassung

  1. Legen Sie die in den Schritten 1.1 bis 1.6 vorbereitete C. elegans-Probe auf den Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie einen interessierenden Bereich und bringen Sie ihn mithilfe des Anregungsziels in den Fokus.
  2. Identifizieren Sie einen Bereich auf dem Objektträger, der kein Raman-aktives Signal aufweist (Wasserhintergrund oder ein Deckglas aus blankem Glas), der als Referenz für den nicht-resonanten Hintergrund (NRB) dienen soll.
  3. Lokalisieren Sie das BCARS-Signal auf dem sCMOS-Detektor. Passen Sie die Z-Position des Sammelziels an, um die Intensität des Anti-Stokes-Signals zu maximieren.
  4. Passen Sie die seitliche Position des Sammelobjektivs an, um sicherzustellen, dass das Anti-Stokes-Licht durch den Eingangsschlitz des Spektrometers richtig ausgerichtet ist.
  5. Starten Sie das synchronisierte Scannen und Descann von Galvo-Spiegeln mit dem FPGA. Die Amplitude des Descan-Galvo wird mit dem digitalen Potentiometer so lange eingestellt, bis die Winkelabweichung vom Primärscan vollständig kompensiert ist. Das Anti-Stokes-Signal sollte über den gesamten Scanbereich innerhalb von ~12 Reihen auf der Kamera beschränkt bleiben.
  6. Definieren einer zeitlichen Erfassungssequenz
    1. Erfassen Sie ein Kreuzkorrelationssignal zwischen dem SC und den Sondenimpulsen, indem Sie den Sondenimpuls verzögern. Um dies zu erfassen, wird das integrierte dreifarbige BCARS-Signal gegen die Zeitverzögerung des Sondenpulses aufgetragen. Das stärkste Signal erscheint zum Zeitpunkt 0, wenn sich die Impulse SC und Sonde zeitlich überlappen.
      HINWEIS: Da die Erkennungssysteme FLIM und TPEF denselben Auslöser wie BCARS verwenden, werden ihre Signale während dieses Zeitpunkts gleichzeitig erfasst.
    2. Aufzeichnung bei einer späteren Verzögerung des Sondenstrahls (z. B. 1-2 ps) für BCARS und einer späteren Verzögerung des SC-Strahls bei nicht-resonantem Hintergrund (NRB-Spektren in Abbildung 6A). Wenn eine Zeitverzögerung an den schmalbandigen Impuls (Sonde) angelegt wird, kann der NRB in dem dreifarbigen CARS-Signal wirksam unterdrückt werden, und somit kann das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert werden67.
    3. Erfassen Sie ein dunkles Bild ohne zeitliche Überlappung zwischen dem SC und der Sonde, um das Rauschen des Basisliniendetektors (Dunkelreferenz) zu erfassen.
    4. Speichern Sie alle BCARS-, NRB- und Dark-Bilder, einschließlich der Metadaten, in einer einzigen h5-Datei.
  7. BCARS-Signalverarbeitungsprotokoll
    1. Öffnen Sie die CRIkit2-Software68.
    2. Laden Sie alle erforderlichen Datasets mit dem Open HDF-Werkzeug, wie in Abbildung 6B gezeigt: Laden von BCARS-Hyperspektraldaten, NRB-Referenz und Dunkelreferenz. Wählen Sie mit dem Freq-Fenster-Tool den Frequenzbereich innerhalb der BCARS-Signalerzeugungsbandbreite aus (von 400 cm-1 bis ≥ 3200 cm-1 für das hier gezeigte BCARS-System).
    3. Führen Sie die Vorverarbeitungsschritte durch:
      1. Verwenden Sie das Anscombe-Werkzeug (wie in Abbildung 6B gezeigt), um die Varianzstabilisierung der BCARS- und NRB-Datasets vorzunehmen.
      2. Verwenden Sie das Werkzeug "Rauschen entfernen ", um eine Singulärwertzerlegung (SVD) durchzuführen: Behalten Sie die Hauptkomponenten basierend auf der visuellen Inspektion bei. Bewahren Sie Komponenten mit räumlichen Verteilungen, die der Morphologie der Probe entsprechen, und verwerfen Sie Komponenten, die von unstrukturiertem oder fleckenartigem Rauschen dominiert werden. Dieser Rauschunterdrückungsschritt verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), insbesondere bei spektralen Merkmalen mit geringer Intensität.
      3. Verwenden Sie das Inverse Anscombe-Tool , um die Daten in ihrer ursprünglichen Domäne wiederherzustellen.
        HINWEIS: Diese Schritte können übersprungen werden, wenn bei der Erfassung eine Echtzeitverarbeitung durchgeführt wird.
    4. Abrufen von Raman-ähnlichen Spektren mit der Kramers-Kronig (KK)-Transformation:
      1. Öffnen Sie das KK-Tool (siehe Abbildung 6B).
      2. Aktivieren Sie Norm to NRB , um eine angemessene spektrale Referenznormalisierung zu gewährleisten.
      3. Legen Sie Parameter wie NRB-Bias, Pad-Faktor und Kantenpixel-Mittelung fest.
      4. Führen Sie die KK-Transformation aus, um die abgerufenen Raman-Spektren zu erhalten.
    5. Durchführen von Fehlerkorrekturen nach KK
      1. Korrigieren von Phasenfehlern mit der Savitzky-Golay-Glättung: Öffnen Sie das Phasenfehlerkorrektur-Tool (Abbildung 6B). Passen Sie die Größe des Glättungsfensters und die Polynomreihenfolge an. Überprüfen Sie die ursprünglichen vs. korrigierten Spektren mithilfe des Vorschaufensters .
      2. Korrigieren von Skalierungsfehlern: Öffnen Sie das Tool zur Korrektur von Skalenfehlern (Abbildung 6B). Normalisieren Sie Spektren, um die relative Intensitätsskalierung im gesamten Datensatz zu korrigieren. Stellen Sie die Konsistenz über räumliche und spektrale Dimensionen hinweg sicher.
    6. Spektralachse kalibrieren (optional, wenn falsch ausgerichtet): Öffnen Sie das Kalibrierungswerkzeug (Abbildung 6B). Vergleichen Sie die gemessenen Wellenzahlen mit den bekannten Referenzpeaks. Wenden Sie die korrigierte Steigung/den korrigierten Schnittpunkt an, um die Spektralachse neu auszurichten.
    7. Definieren und Extrahieren von Daten aus interessanten Regionen (ROIs)
      1. Verwenden Sie den ROI-Spect. oder Pt Spect. (Abbildung 6B), um räumliche Interessenbereiche oder Points of Interest im BCARS-Bild zu markieren.
      2. Visualisieren und vergleichen Sie den spektralen Gehalt verschiedener ROIs.
      3. Exportieren Sie die abgerufenen Spektren für weitere quantitative oder chemometrische Analysen.

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Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt die gemessenen Spektren der Schmalbandsonde und der Breitband-Superkontinuum (SC)-Pulse, die für die BCARS-Anregung verwendet werden. Der Sondenpuls, der durch die Erzeugung einer zweiten Harmonischen eines ~1530 nm-Signals von einem selbstgebauten optisch-parametrischen Oszillator (OPO, Abbildung 3) erzeugt wird, ist bei 764,2 nm zentriert und hat eine volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) von 0,2 nm, was eine spektrale Auflösung von...

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Diskussion

Diese Arbeit demonstriert die Architektur von BCARS und der 2p-FLIM/TPEF-Bildgebungsplattform im Detail. Während in unserem aktuellen Aufbau ein 1030-nm-Laser mit zwei Ausgängen verwendet wird, können die meisten Hochleistungs-fs-1030-nm-Faserlaser als Master-Laserquelle für den Bau eines BCARS-Mikroskops verwendet werden. Durch die sorgfältige Auswahl der Länge und Periode von OPO/SHG-PPLN-Kristallen ist die Erzeugung eines Sondenpulses von wenigen ps mit einer OPO-Pumpe von 1030 nm unt...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen und haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

W-W.C. bedankt sich für die Unterstützung durch NIH (R21AG086974). M.T.C. bedankt sich für die Unterstützung durch das U.S. Department of Energy (DOE BERDE-SC0022121).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
KameraHamamatsuORCA-FusionsCMOS, 2304 mal; 2304 Pixel
Zweck der Sammlung  Olymp  LUMPLFLN60XW  Eintauchen in Wasser, 1,0 NA
Datenerfassung  Fleißig  MCC USB-1208HS  Datenerfassungskarte
Verzögerungsleitung  Newport  DL225  Mechanische Verzögerung für den Sondenimpuls
Dichroitische  Semrock  FF925-DI01  Kombination von Sonde und SC
Dichroitische  Semrock  FF705-DI01  Detektion von Epi-Mode-Fluoreszenz
Dichroitische  Thorlabs  DMLP550R  Trennung des FLIM-Signals und des TPEF-Signals
Ziel der Anregung  Olymp  UPLSAPO60XWIR  Eintauchen in Wasser, 1,2 NA
Filter  Semrock  FF01-1326/SP-25  Lehnen Sie den fundamentalen Laser nach SHG ab
Filter  Semrock  FF01-758/SP  Ablehnen des fundamentalen Lasers vor der BCARS-Kamera
Filter  Thorlabs  FESH0650  Den fundamentalen Laser vor der Fluoreszenzmodalität verwerfen
FLIM PMT  PicoQuant  PMA-Hybride  FLIM-Einzelphotonen-Detektor
FPGA (Englisch)  Rotpitaya  STEMlab 125-14  Scan-Synchronisierung und Triggerung
Galvo  Thorlabs  GVS101  Zum Scannen und Descannen
Gitter  Kohärent  LightSmyth 1040nm  1000 Rillen/mm, pre-chirp für SC
Halbwellen-Platte  Thorlabs  AHWP05M-980  Polarisationskontrolle
K-Würfel  Thorlabs  KPA101 PSD-Treiber für den Auto-Aligner
Laser  Prospektive Instrumente  FSX-Dual  Femtosekundenlaser mit zwei Ausgängen
Laser  Kohärent  Mira-900  Femtosekundenlaser zur Fluoreszenzanregung
PBS  Thorlabs  PBS255  Strahlkombination für SC und Sonde
PCF  Thorlabs  LMA-PM-5  10 cm photonische Kristallfaser für die SC-Erzeugung
PD  Thorlabs  PDA100A2  OPO-Feedback-Schleife
Piezo-Spiegelhalterung  Thorlabs  POLARIS-K1S2P  Piezoelektrischer Einsteller für den Auto-Aligner
Vorverstärker  EdmundOptics  59-179  TPEF-Vorverstärker
Prisma  Lambda Research Optiken  EQP-30SF10  SC-Kompression
PSD (Englisch)  Thorlabs  PDQ80A  Positionsempfindlicher Detektor für den Auto-Aligner
Spektrometer  Teledyne Princeton Instrumente  IsoPlane 160  300 g/mm Gitterrost, zentriert bei 700 nm
Bühne  ASI  MS-2000  Motorisierter 3-Achsen-Tisch
TCSPC  PicoQuant  MultiHarfe 150  Photonenzählgerät für FLIM
TPEF PMT  Hamamatsu  Nr. H9305-03  TPEF-Detektor
Tubus-Linse  Thorlabs  TL200-2P2  Wird im Descan-System verwendet

Referenzen

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

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