Lebendzell-Bildgebung der Chromosomensegregation während der Meiose von Mäusen

Zusammenfassung

Im Folgenden fassen wir bildgebende Verfahren zur Untersuchung der Chromosomensegregation in Maus-Eizellen zusammen, wobei H2B-RFP für Chromatin und SiR-Tubulin für die Spindelvisualisierung verwendet werden. Wir beschreiben die Probenvorbereitung, Mikroinjektion, Kultur, den Aufbau der Bildgebung und die Analyse und bieten einen praktischen Leitfaden für eine hochauflösende und minimal phototoxische Bildgebung der meiotischen Chromosomendynamik.

Zusammenfassung

Eine genaue Chromosomensegregation während der Eizellmeiose ist unerlässlich, um eine ordnungsgemäße Embryonalentwicklung zu gewährleisten und Aneuploidie-bedingte Störungen zu verhindern. Die Bildgebung lebender Zellen in Kombination mit Fluoreszenzmarkierungstechniken hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung der meiotischen Chromosomendynamik mit hoher raumzeitlicher Auflösung entwickelt. In diesem Protokoll fassen wir die wichtigsten Methoden zur Visualisierung der Chromosomentrennung in lebenden Maus-Eizellen zusammen, wobei der Schwerpunkt auf der Verwendung von Histon H2B-RFP für die Chromatinmarkierung und SiR-Tubulin für die Spindelverfolgung liegt. Wir beschreiben die Verfahren für die Probenvorbereitung, die mRNA-Mikroinjektion, die Eizellkultur, die Einrichtung der Bildgebungskammer für lebende Zellen und die konfokalen Mikroskopieeinstellungen, die alle optimiert sind, um eine hochauflösende Bildgebung zu erreichen und gleichzeitig die Phototoxizität zu minimieren. Darüber hinaus beleuchten wir kritische experimentelle Überlegungen wie Phototoxizität, Bildverarbeitung und quantitative Analyse meiotischer Ereignisse. Durch eine umfassende Bewertung der aktuellen Methoden dient dieses Protokoll als praktischer Leitfaden für Forscher, die die Chromosomendynamik in lebenden Eizellen untersuchen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit meiotischer Studien verbessern möchten.

Einleitung

Eine genaue Visualisierung der Chromosomen- und Spindeldynamik während der Eizellmeiose ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die die weibliche Gametenreifung und das Aneuploidierisiko steuern 1,2,3,4,5. Säugetier-Eizellen durchlaufen eine hochgradig koordinierte Reihe von meiotischen Ereignissen, einschließlich des Abbaus der Keimbläschen (GVBD), der Chromosomenkondensation, der Spindelassemblierung und der asymmetrischen Teilung⁶. Die Bildgebung mit festen Zeitpunkten hat zwar wertvolle Momentaufnahmen dieser Prozesse geliefert, aber es fehlt ihr an zeitlicher Auflösung und sie kann keine vorübergehenden oder schnellen Ereignisse erfassen, die zwischen den Abtastintervallen auftreten. Im Gegensatz dazu bietet die Bildgebung lebender Zellen von fluoreszenzmarkierten Chromosomen und Mikrotubuli einen leistungsfähigen Ansatz, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu überwachen ^2,3,7. Dies ermöglicht die direkte Beobachtung des Zeitpunkts, der Dauer und der Abfolge meiotischer Ereignisse innerhalb einzelner Eizellen und ermöglicht die Identifizierung vorübergehender Ereignisse, die sonst in fixierten Proben übersehen werden könnten. Die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und physiologischen Integrität der Eizellen während der Mikroinjektion und Bildgebung erfordert jedoch eine sorgfältige Handhabung und optimierte Bedingungen⁸.

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Arbeitsablauf für die Mikroinjektion von Eizellen im Keimvesikel (GV)-Stadium von Mäusen mit H2B-RFP-cRNA, die eine Fluoreszenzmarkierung des Chromatins ermöglicht, gefolgt von einer konfokalen Bildgebung der Chromosomen und des Spindelverhaltens im Zeitraffer während der Meiose⁴. Die Methode integriert wichtige Schritte wie hormonelles Priming, Eizellisolierung, Mikroinjektion unter kontrollierten Temperaturbedingungen und Live-Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie mit Umweltkontrolle ^4,9. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, einen robusten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Echtzeit-Visualisierung der Chromosomen- und Spindeldynamik in lebenden Maus-Eizellen vorzustellen und eine Plattform für die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen zu bieten, die der meiotischen Regulation und dem Aneuploidierisiko zugrunde liegen.

Obwohl dieses Protokoll eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung bietet, beruht es auf der exogenen Reporterexpression, die die endogene Proteindynamik möglicherweise nicht vollständig repliziert und möglicherweise die nativen meiotischen Prozesse beeinträchtigen könnte, wenn sie überexprimiert wird. Forscher sollten diese Einschränkungen berücksichtigen und die Ergebnisse nach Möglichkeit mit komplementären Ansätzen validieren.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Studien zu unterstützen, die meiotische Mechanismen, Chromosomensegregationsfehler und die Auswirkungen genetischer oder umweltbedingter Störungen auf die Eizellqualität untersuchen. Es bietet eine robuste Plattform sowohl für die Grundlagenforschung als auch für translationale Anwendungen in der Reproduktionsbiologie.

Protokoll

Alle Versuche müssen in Übereinstimmung mit den von der örtlichen Tierethikkommission genehmigten Protokollen durchgeführt werden. Experimentelle Verfahren sollten sich strikt an die 3R-Prinzipien halten: Replacement, Reduction und Refinement. Die Mäuse müssen in einer akkreditierten Tierhaltung unter standardisierten Umgebungsbedingungen (22 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht werden.

1. Eizellentnahme und -vorbereitung

HINWEIS: Alle Geräte und Reagenzien müssen steril sein. Führen Sie die gesamte Handhabung der Eizellen mit einer Mundpipette unter einem Stereomikroskop durch (siehe Materialtabelle). Bedecken Sie alle Tröpfchen des Kulturmediums mit Mineralöl (Abbildung 1A-E).

1. Hormonelle Stimulation
   1. Injizieren Sie 3-4 Wochen alten weiblichen Mäusen intraperitoneal 5 internationale Einheiten (I.E.) Serumgonadotropin (PMSG; siehe Materialtabelle) der trächtigen Stute 46-48 Stunden vor der Eizellentnahme.
      HINWEIS: B6CBAF1 Mäuse (F1-Nachkommen von C57BL/6J × CBA/CaCrl) werden aufgrund der überlegenen Eizellausbeute und der günstigen Reifungseigenschaften bevorzugt.
2. Vorbereitung von Nährmedien
   1. Filtrieren Sie M2- und M16-Medien (siehe Materialtabelle) mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Ergänzen Sie mit IBMX bis zu einer Endkonzentration von 100 μM durch Verdünnung aus einem 100 mM-Stamm.
   2. Bereiten Sie 5-6 Tröpfchen M2-IBMX (jeweils ~30 μL) und 3 Tröpfchen M16-IBMX in 35-mm-Kunststoff-Gewebekulturschalen vor. Alle Tröpfchen mit Mineralöl überziehen. M2-IBMX-Schalen werden mindestens 30 Minuten vor der Eizellisolierung auf einen 37 °C heißen Block gestellt (Abbildung 1A) und M16-IBMX-Schalen in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ (Abbildung 1C).
   3. Bereiten Sie eine zusätzliche Schale mit 800-1.000 μl M2-IBMX (ohne Öl) für die Eierstockdissektion vor. Auf eine 37 °C heiße Heizplatte stellen, die über einem Stereomikroskop montiert ist (Abbildung 1B).
3. Isolierung von Eizellen
   1. Opfern Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation. Wischen Sie den Unterbauch mit 70% Ethanol ab und machen Sie dann einen kleinen horizontalen Schnitt in der Haut und im Bauchfell, um in die Bauchhöhle zu gelangen. Verlängern Sie den Schnitt, indem Sie die Ränder des Schnitts mit den Fingern auseinanderziehen.
   2. Fegen Sie mit einer Pinzette den Darm aus dem Weg, um die Eierstöcke im Oberbauch freizulegen, die sich am oberen Pol der Nieren befinden. Mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere die Eierstöcke vorsichtig herausschneiden, ohne das Gewebe zu schädigen. Übertragen Sie die Eierstöcke sofort in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 100-200 μl vorgewärmtem M2-IBMX-Medium.
   3. Übertragen Sie die Eierstöcke in 1 ml vorgewärmtes M2-IBMX-Medium und geben Sie es in einen beheizten Dissektionsmikroskoptisch (Abbildung 1B). Fettgewebe und Eileiterreste vorsichtig entfernen.
      HINWEIS: Behandeln Sie die Eierstöcke vorsichtig, um Schäden an Follikeln oder Eizellen zu vermeiden. Bewahren Sie die Eierstöcke während des Transports vom Tierraum in das Labor in einem warmen Medium auf.
   4. Setzen Sie Cumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) frei, indem Sie Follikel mit einer 27-G-Nadel punktieren (Abbildung 1A-B). Sammeln Sie COCs und übertragen Sie sie in 25-30 μl Tröpfchen M2-IBMX (Abbildung 1D).
   5. Dissoziieren Sie Kumuluszellen durch wiederholtes Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette aus Glas mit schmaler Bohrung (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Während das Mundpipettieren häufig für die Handhabung von Eizellen verwendet wird, bieten mechanische Pipettieren oder Mikromanipulatoren Alternativen, insbesondere in Umgebungen, in denen das Pipettieren im Mund eingeschränkt oder nicht durchführbar ist. Diese Alternativen wurden erfolgreich in ähnlichen Protokollen eingesetzt ^10,11.
   6. Identifizieren und selektieren Sie ausgewachsene Eizellen im GV-Stadium basierend auf einem größeren Durchmesser und einer zentral gelegenen GV mit einem Stereomikroskop bei 20- bis 40-facher Vergrößerung. Übertragen Sie es in frische 30 μl M2-IBMX-Tröpfchen auf einem 37 °C heißen Block, geschützt vor Licht.
      HINWEIS: Halten Sie die Eizellen während aller Eingriffe bei 37 °C, um die physiologische Integrität zu erhalten. Erwärmen Sie alle Medien vor und verwenden Sie temperaturgesteuerte Tische für alle mikroskopbasierten Handhabungen und Mikroinjektionen.
   7. Lassen Sie die Eizellen vor der Mikroinjektion 20 Minuten lang auf einem bei 37 °C beheizten Tisch erholen.

2. H2B-RFP cRNA-Zubereitung

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Handschuhen in einer sauberen, RNase-freien Umgebung durch. Verwenden Sie nur RNase-freies Wasser und Reagenzien und arbeiten Sie vorzugsweise in Gegenwart von RNase-Inhibitoren.

1. Verifizierung des H2B-RFP-Plasmids (siehe Materialtabelle) durch Sanger-Sequenzierung mit Primern, die den Einsatz flankieren. Amplifizieren Sie das Plasmid, indem Sie kompetente E. coli (z. B. DH5α) transformieren, eine einzelne Kolonie auswählen und sie in LB-Bouillon mit geeigneten Antibiotika züchten. Reinigen Sie das Plasmid mit einem Standard-Midi- oder Maxi-Vorbereitungskit. Ausführliche Verfahren finden Sie in Green und Sambrook¹².
2. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
3. Linearisieren Sie 2-4 μg Plasmid-DNA stromabwärts des Inserts mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das einmal in das Vektorrückgrat schneidet (NotI wurde für H2B-RFP verwendet). Die Aufschlussreaktion wird mit dem entsprechenden Puffer und der entsprechenden Enzymkonzentration wie in Tabelle 1 beschrieben eingeleitet und 1-2 h lang bei 37 °C inkubiert. Bestätigen Sie die vollständige Linearisierung durch Agarose-Gelelektrophorese. Mehrere Banden weisen auf eine unvollständige Verdauung hin. Wenn Sie ein handelsübliches Kit verwenden, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Wählen Sie ein Restriktionsenzym, das präzise stromabwärts des Einsatzes und unter optimalen Verdauungsbedingungen schneidet. Überprüfen Sie die Linearisierung, indem Sie ein kleines Aliquot auf einem Agarosegel ausführen.
4. Entfernen Sie die RNase-Kontamination, indem Sie die Aufschlussreaktion 1 h lang mit 1 μl Proteinase K (10 μg/ml), 5,3 μl 10 % SDS und 50 μl nukleasefreiem Wasser bei 50 °C inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Beseitigung von RNase- und Proteinverunreinigungen unerlässlich. Verwenden Sie nur RNase-freie Reagenzien und sorgen Sie für saubere Arbeitsbedingungen.
5. Die verdaute DNA wird mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, gefolgt von einer Chloroform-Extraktion.
   HINWEIS: Um die Toxizität zu minimieren und die Probenhandhabung zu rationalisieren, können anstelle der Phenol-/Chloroform-Extraktion auch kommerzielle Säulen- oder Bead-basierte Reinigungsmethoden (z. B. Silica-Membran- oder magnetische Bead-Systeme) verwendet werden.
6. Ausfällung der DNA durch Zugabe von 3 M Natriumacetat und 100 % Ethanol. Bei -80 °C mindestens 2 h inkubieren.
7. Pelletieren Sie die DNA durch Zentrifugation bei 12.000-14.000 x g für 10 min bei 4 °C. Das Pellet mit 70 % Ethanol waschen, erneut bei gleicher Geschwindigkeit 5 min bei 4 °C zentrifugieren, kurz an der Luft trocknen lassen (2-5 min) und in 6 μL RNase-freiem Wasser resuspendieren.
   HINWEIS: Nach der Ethanolfällung und Zentrifugation sollte sich am Boden des Röhrchens ein sichtbares durchscheinendes oder weißes Pellet bilden. Wenn kein Pellet zu sehen ist, wiederholen Sie die Zentrifugation mit höherer Geschwindigkeit oder bewerten Sie die DNA-Konzentration neu.
8. Führen Sie eine In-vitro-Transkription mit dem T7 mMESSAGE mMACHINE-Kit (siehe Tabelle 2) gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
9. Die Transkriptionsreaktion wird mindestens 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Verlängern Sie die Inkubation, wenn die Transkriptlänge 5 KB überschreitet.
10. Entfernen Sie die Matrizen-DNA durch DNase-Behandlung mit 1 HE DNase I pro 10 μl Reaktionsvolumen, inkubiert bei 37 °C für 15 min.
11. Die synthetisierte cRNA wird durch Lithiumchlorid-Fällung^{gereinigt 13}. Nach der Fällung und Zentrifugation sollte sich am Boden des Röhrchens ein sichtbares durchscheinendes oder weißes Pellet bilden. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 70% Ethanol.
12. Resuspendieren Sie das endgültige cRNA-Pellet in 20 μl RNase-freiem Wasser. Messen Sie die RNA-Konzentration und bestätigen Sie das Vorhandensein und die Länge des Poly(A)-Schwanzes, indem Sie eine RT-PCR durchführen, gefolgt von einer Sequenzierung des PCR-Produkts. Aliquotieren Sie die cRNA in 1 μL-Volumen und lagern Sie sie bei -80 °C.

3. Vorbereitung und Mikroinjektion von Eizellen

HINWEIS: Halten Sie die Eizellen während des gesamten Eingriffs mit vorgewärmten Medien und temperaturgesteuerten Mikroskoptischen auf 37 °C, um die Eizellqualität zu erhalten.

1. Präparat
   1. H2B-RFP-cRNA-Aliquote auf Eis auftauen, kurz zentrifugieren und auf die gewünschte Konzentration (z. B. 250 ng/μl) verdünnen.
      HINWEIS: Die optimale cRNA-Konzentration kann je nach Konstrukt, Expressionssystem und experimentellen Zielen variieren. Wir empfehlen, die cRNA-Konzentration zu titrieren (z. B. im Bereich von 50-300 ng/μL), um Überexpressionsartefakte zu minimieren und gleichzeitig ein ausreichendes Signal zu gewährleisten. Die Anwenderinnen sollten auch die meiotische Progression (z. B. GVBD, Spindelbildung und Polkörperextrusion) als funktionelle Auslesung der Gesundheit und Lebensfähigkeit der Eizellen nach der Expression des Konstrukts überwachen. Es wurde berichtet, dass die Injektionskonzentrationen von cRNA typischerweise zwischen 0,2 und 1 μg/μl liegen, wobei optimale Ergebnisse oft bei 0,5 μg/μl erreicht werden 2,3,4,5,7,8,9.
   2. Bereiten Sie Mikroinjektionsnadeln aus Borosilikatglaskapillaren (OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm, Länge = 100 mm) mit einem Pipettenabzieher vor (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Wir verwenden einen vertikalen Pipettenabzieher (siehe Materialtabelle; Abbildung 2A). Optimieren Sie die Zugparameter empirisch. Die Nadelspitze sollte fein genug sein, um Eizellschäden zu minimieren, aber breit genug, um Verstopfungen zu vermeiden und eine reibungslose cRNA-Abgabe zu ermöglichen.
   3. Laden Sie 0,5-1,5 μl cRNA-Lösung mit RNase-freien Mikroladerspitzen in die Nadelspitze. Entfernen Sie alle Luftblasen vor der Injektion.
2. Einrichtung der Mikroinjektionsschüssel
   1. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsschale mit 100 μl M2-IBMX-Medium vor und überziehen Sie sie vollständig mit Mineralöl, um Verdunstung und Osmolaritätsverschiebungen zu verhindern.
3. Mikroinjektion von Eizellen
   1. Montieren Sie die Halte- und Injektionspipetten auf das Mikromanipulatorsystem (Abbildung 2B,C).
   2. Stellen Sie die Mikroinjektionsschale auf den Mikroskoptisch. Übertragen Sie die Eizellen mit einer Mundpipette in das M2-IBMX-Tröpfchen.
   3. Bringen Sie die Halte- und Injektionspipetten in die gleiche horizontale Ebene wie die Eizellen.
   4. Entnehmen Sie eine Eizelle durch sanftes Saugen mit der Haltepipette (Abbildung 2B und C).
   5. Führen Sie die Injektionsnadel durch die Zona pellucida und das Oolemma ein, wobei Sie auf das Zytoplasma abzielen und den Zellkern vermeiden.
   6. Verabreichen Sie H2B-RFP-cRNA mit einem kurzen Impuls negativer Kapazität durch ein intrazelluläres Elektrometer (Abbildung 2B-E). Halten Sie das Injektionsvolumen auf etwa 5% des Eizellvolumens. Eine erfolgreiche Injektion ist typischerweise als kleine, aber deutliche Ausbreitung von Zytoplasma sichtbar. Passen Sie den Injektionsdruck und den Injektionszeitpunkt an, um Membranschäden zu vermeiden.
   7. Ziehen Sie die Nadel schnell und sanft im gleichen Winkel zurück, um ein Reißen der Membran zu minimieren.
   8. Lösen Sie die Eizelle aus der Haltepipette und positionieren Sie sie an einem separaten Bereich der Schale, um injizierte von nicht injizierten Eizellen zu unterscheiden (Abbildung 2F). Organisieren Sie für diese Einrichtung den Arbeitsablauf, indem Sie nicht injizierte Eizellen oben in der Schale aufbewahren und injizierte nach unten verschieben.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4 bis 3.3.8 für alle verbleibenden Eizellen. Die Überlebensraten nach der Injektion variieren je nach Technik und mRNA-Eigenschaften. Erwarten Sie eine Rentabilität von 60 % bis 80 %.
4. Handhabung nach der Injektion
   1. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in ein frisches Tröpfchen M16-IBMX-Medium in einer sauberen Kulturschale.
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1-4 Stunden, um die H2B-RFP-Expression zu ermöglichen. Passen Sie die Inkubationsdauer basierend auf der cRNA-Konzentration, der Transkriptgröße und der Expressionseffizienz an.

4. Zeitraffer-Bildgebung von H2B-RFP-markierten Chromosomen während der Meiose

1. Vorbereitung von Geräten und Medien
   1. Den Konfokalmikroskoptisch-Inkubator und die Klimakammer vor der Verwendung ≥ 30 Minuten lang auf 37 °C vorwärmen (Abbildung 3A). Schalten Sie den Gasregler ein und initiieren Sie den Gasfluss, um die Kammer bei 5 % CO₂ und Umgebungs-O₂ zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Kammer befeuchtet ist, um die Gesundheit der Eizellen während der erweiterten Bildgebung von lebenden Zellen zu unterstützen.
   2. Kulturtropfen vorbereiten: Geben Sie 5-6 Tropfen mit 50 μl M16-Medium, ergänzt mit SiR-Tubulin (100 nM Endkonzentration), in eine 35-mm-Petrischale. Mit Mineralöl überziehen. In eine separate Bildgebungsschale mit Glasboden drei 5-μl-Tropfen M16 + SiR-Tubulin geben und mit Mineralöl überlagern. Beide Gerichte vor Gebrauch ≥ 30 min bei 37 °C vorwärmen.
2. Eizelltransfer und -waschung
   1. Waschen von Eizellen: Injizierte Eizellen nacheinander durch die 50 μL M16 + SiR-Tubulin-Tropfen übertragen, um verbleibende IBMX wegzuspülen (5 Wäschen empfohlen). Waschen Sie vorsichtig, um Eizellschäden zu vermeiden.
      HINWEIS: Rest-IBMX kann die Wiederaufnahme der Meiose hemmen, daher ist eine gründliche Reinigung von entscheidender Bedeutung.
   2. Abschließender Transfer: Nach dem Waschen werden 15-20 Eizellen in den 5 μl Tropfen M16 + SiR-Tubulin in die vorgewärmte Bildgebungsschale mit Glasboden überführt.
3. Aufbau des Mikroskops
   1. Montage der Bildgebungsschüssel: Stellen Sie die Glasbodenschale auf den konfokalen Mikroskoptisch (Abbildung 3A). Lassen Sie die Eizellen ~10 Minuten ruhen.
   2. Tischpositionierung: Mittels Hellfeld-Bildgebung die Eizellen im Sichtfeld zentrieren. Speichern Sie Positionen mit Hilfe der Mikroskopsoftware.
      HINWEIS: In dieser Studie haben wir ein konfokales Leica TCS SP8 Mikroskop mit einem HC PL APO 20x/1.0 NA Wasserimmersionsobjektiv verwendet. Je nach Verfügbarkeit können jedoch auch andere konfokale Systeme und Objektivlinsen mit ähnlichen Spezifikationen verwendet werden.
   3. Einrichtung der Wasserpumpe für Wasserimmersionsobjektive: Wenn Sie eine Wasserimmersionsobjektivlinse verwenden, betreiben Sie das Wasserpumpensystem so, dass es in Abständen von 5-10 Minuten intermittierend Wasser zuführt. Dieser periodische Fluss hält die Wassersäule zwischen der Linse und der Bildgebungsschale mit Glasboden aufrecht, verhindert ein Austrocknen und sorgt für stabile Bildgebungsbedingungen bei Langzeitexperimenten. Für Ölimmersionslinsen ist diese Wasserdurchflusseinstellung nicht erforderlich.
4. Imaging-Einstellungen
   1. Wechseln Sie in den Laserscan-Modus. Stellen Sie die Laserintensitäten wie folgt ein: 561 nm bei 0,5 % (~100 μW am Objektiv) für H2B-RFP (Chromosomen); 633 nm bei 3% (~300 μW am Objektiv) für SiR-Tubulin (Spindel-Mikrotubuli; Abbildung 3B,E).
      HINWEIS: Befolgen Sie die entsprechenden Lasersicherheitsrichtlinien. Minimieren Sie die Laserbelastung, um die Lebensfähigkeit der Probe zu schützen.
5. Z-Stack-Erfassung
   1. Erfassen Sie Z-Stapel mit einer Spannweite von 30 bis 50 μm und einer Schrittweite von 2 bis 4 μm (Abbildung 3B, C).
   2. Nehmen Sie Bilder in Intervallen von 5 bis 10 Minuten mit einer Scangeschwindigkeit von 600 Hz auf (Abbildung 3B,D). Die Gesamtdauer der Bildgebung kann je nach überwachtem meiotischem Stadium 12-16 Stunden betragen und ist durch Phototoxizität und Eizelltoleranz bei längerer In-vitro-Kultur begrenzt.
6. Sequenzielle Bilderfassung
   1. Führen Sie an den Mikroskopsystemen sequentielles Scannen mit zwei HyD-Detektoren durch: H2B-RFP: Anregung bei 561 nm; Emission bei 580-630 nm gesammelt; SiR-Tubulin-Anregung bei 633 nm; Emission bei 650-700 nm gesammelt (Abbildung 3E).
7. Initiieren der Zeitraffer-Bildgebung
   1. Bevor Sie mit der Langzeit-Zeitraffererfassung beginnen, überprüfen Sie die Signalqualität, indem Sie ein Testbild aufnehmen. Fluoreszierende Signale sollten gleichmäßig verteilt sein: H2B-RFP sollte das Chromatin eindeutig markieren, und SiR-Tubulin sollte Mikrotubuli-Strukturen ohne übermäßigen Hintergrund hervorheben. Bestätigen Sie die Stabilität des Autofokus und minimales Photobleaching in kurzen Vorab-Bildgebungsläufen.
   2. Starten Sie das Zeitraffer-Imaging, indem Sie auf Start klicken.
      HINWEIS: Der GVBD, der den M-Phaseneintritt markiert, tritt in der Regel 60 bis 90 Minuten nach dem IBMX-Auswaschen auf (Abbildung 4A). In diesem Aufbau extrudieren C57BL/6-Eizellen den ersten Polkörper etwa 8-9 h nach der GVBD (Abbildung 4A). Der Zeitpunkt kann je nach Mausstamm und Kulturbedingungen variieren.

5. Verarbeitung nach dem Imaging

1. Öffnen Sie die Imaging-Datei in einer Bildanalysesoftware, indem Sie Datei > Öffnen und dann die .lif-Datei aus der Imaging-Sitzung auswählen.
2. Generieren Sie Z-Projektionen für die Kanäle H2B RFP und SiR-Tubulin, indem Sie Verarbeitung > Projektion generieren auswählen. Legen Sie den Projektionstyp auf Projektion mit maximaler Intensität fest. Wählen Sie sowohl den RFP- als auch den SiR-Tubulin-Kanal aus, und klicken Sie dann auf Ausführen.
   HINWEIS Führen Sie keine Z-Projektion für den DIC-Kanal durch, da dies zu einem unscharfen Bild führen kann. Identifizieren und wählen Sie stattdessen die einzelne DIC-Ebene aus, die am schärfsten fokussiert ist. Verwenden Sie dieses fokussierte DIC-Bild in Kombination mit den Projektionen mit maximaler Intensität der Kanäle H2B-RFP und SiR-Tubulin, um eine optimale Visualisierung zu erzielen.
3. Extrahieren Sie eine einzelne Hellfeld-Fokusebene. Kehren Sie zu den Prozesswerkzeugen zurück und wählen Sie Bearbeiten > Zuschneiden aus. Wählen Sie den Hellfeldkanal aus, verwenden Sie den Z-Schieberegler, um die optimale Fokusebene zu finden, und klicken Sie auf "Anwenden".
4. Führen Sie die Projektions- und Hellfeldbilder zusammen, indem Sie die Prozesswerkzeuge öffnen und "Zusammenführen" > "Kanäle hinzufügen" auswählen. Fügen Sie die RFP-Projektion, die SiR-Tubulin-Projektion und das einzelne Hellfeldbild hinzu. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den zusammengeführten Satz , und klicken Sie dann auf Übernehmen.
5. Exportieren Sie das endgültige zusammengeführte Bild, indem Sie Datei > > Bild exportieren auswählen. Wählen Sie das TIFF-Format für eine hochwertige, unkomprimierte Ausgabe.
   HINWEIS: Der Export im TIFF-Format wird für die nachgelagerte Analyse und Abbildungsvorbereitung empfohlen.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 4A,B gezeigt, ermöglicht dieses Protokoll eine qualitativ hochwertige Bildgebung von Chromosomen (H2B-RFP) und Spindelmikrotubuli (SiR-Tubulin) in Eizellen und liefert damit umfassende raumzeitliche Informationen während der gesamten meiotischen Reifung.

Der H2B-RFP-Kanal in Abbildung 4A zeigt alle Aspekte der Chromosomenbewegung von der anfänglichen Ausrichtung nach GVBD (Abbildu...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll skizziert eine robuste Methode für die Mikroinjektion und Lebendzellbildgebung von Maus-Eizellen, die es ermöglicht, die Chromosomendynamik während der Meiose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung sichtbar zu machen. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die sorgfältige Behandlung der Eizellen in jeder Phase des Eingriffs, von der Entnahme über die Mikroinjektion bis hin zur Bildgebung. Eizellen reagieren sehr empfindlich auf Umweltschwan...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-ml-Spritzen	Terumo	SS+01T Tuberkulin	Spritzen für präzise PMSG-Injektionen.
Agarose-Gel	Invitrogen	16500500	Wird für die DNA- und RNA-Gelelektrophorese verwendet, um Nukleinsäuren nach Größe zu trennen und der H2B-RFP-Sequenz zu entsprechen
Spiritusbrenner	LabTek	LW15557-01	Wird zur Sterilisation und zur Zubereitung von Pipitte im Mund verwendet.
Bakterielle Nährmedien (LB-Brühe)	Sigma-Aldrich	Nr. L3022	Standardmedium für die Züchtung von E. coli und anderen Bakterienkulturen.
Zellkulturschalen (35 x 10 mm und 60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Wird zur Kultivierung von Eizellen verwendet; Erhältlich in verschiedenen Größen.
Zentrifuge (Tischgerät)	Eppendorf	5424R	Eine kompakte Zentrifuge für kleine Probenvolumina, die häufig in Forschungslabors eingesetzt wird.
Zentrifugenröhrchen (15 ml und 50 ml)	Corning	352096, 352070	Größere Röhrchen für die Zentrifugation, die häufig für die Zell- und Proteinverarbeitung verwendet werden.
Chloroform	Sigma-Aldrich	Nr. C2432	Ein Lösungsmittel, das häufig in molekularbiologischen Protokollen verwendet wird, insbesondere bei der DNA/RNA-Extraktion.
CO2-Inkubator	Sanyo	(Modell: MCO-18AIC)	Inkubator zur Aufrechterhaltung einer kontrollierten CO2-Atmosphäre für die Eizellkultur.
Ultrafeine Einwegnadeln (27 G & mal 1/2")	Hanke Sass Wolf	4710004012	Feine Nadeln für die Eizellentnahme
DNase I (RNase-frei)	Thermo Fisher Scientific	EN0521	Enzym, das zur Entfernung kontaminierender DNA aus RNA-Präparaten verwendet wird.
Trockener Heizblock	Förderinstrumente	(Modell: QBD4)	Ein Block, der zum Erhitzen von Proben oder Reaktionen bei präzisen Temperaturen verwendet wird, ohne dass Wasser benötigt wird.
Ethanol (molekularbiologische Qualität)	Sigma-Aldrich	Nr. E7023	Wird für die DNA- und RNA-Fällung sowie in Sterilisationsverfahren verwendet.
Feine Präparierschere	Met-App Wissenschaftliche und chirurgische Instrumente	2235	Wird für die präzise Dissektion von Maus-Eizellen verwendet
Feine Pinzette	Met-App Wissenschaftliche und chirurgische Instrumente	2127	Wird für die präzise Dissektion von Maus-Eizellen verwendet
Gel-Elektrophorese-System	Bio-Rad	1645050	Ein System zur Durchführung der Elektrophorese von Nukleinsäuren oder Proteinen in Gelen.
Gentamicin-Sulfat	Sigma-Aldrich	Nr. G1264	Antibiotikum, das verwendet wird, um bakterielle Kontamination in Zellkulturen zu verhindern.
Glaspasteur-Pipetten (230 mm)	VWR	6121702	Glaspipetten für die Mundpipette von Eizellen
IBMX	Sigma-Aldrich	Nr. I5879	Ein Phosphodiesterase-Hemmer zur Vorbeugung von GVBD
Inverses Mikroskop	Nikon		Ein Mikroskop, das für die Beobachtung lebender Zellen oder Organismen unter der Kulturschale entwickelt wurde.
Leichtes Mineralöl, geeignet für die Kultur von Mausembryonen	Sigma-Aldrich	M5310	Wird zum Abdecken von Eizellen in Kultur verwendet, um Verdunstung zu verhindern und die Temperatur zu halten.
Lithiumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. L9650	Wird in RNA-Fällungsmethoden verwendet.
Bildgebungssystem für lebende Zellen	Leica	LAS X	Bildgebungssystem für die Echtzeit-Beobachtung lebender Zellen mit fortschrittlichen Mikroskopietechniken.
M16-Medium (für In-vitro-Kulturen)	Sigma-Aldrich	M7292	Ein Medium, das für die Kultivierung von Eizellen und Embryonen von Mäusen und andere In-vitro-Anwendungen entwickelt wurde.
Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml und 1,6 ml)	Neptun	3735.X, 3745.X	Kleinvolumige Röhrchen für die Zentrifugation, die häufig in molekularbiologischen und biochemischen Protokollen verwendet werden.
Mikrozentrifugenröhrchen (RNase-frei)	Eppendorf / Neptun	022431081 (Eppendorf)	RNase-freie Röhrchen für RNA verhindern, dass die RNA abgebaut wird.
Mikroinjektions-Nadeln	Sutter Instrumente	P-30 Pipettenabzieher	Nadeln für die präzise Mikroinjektion in Eizellen
Mikroinjektionssystem	Harvard-Apparatur	FemtoJet, PicoPump	Systeme, die zur Injektion von cRNA in Maus-Eizellen mit hoher Präzision verwendet werden.
Miniprep-Bausatz	Qiagen	27106 (QIAprep Spin Miniprep Bausatz)	Ein Kit zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen für molekularbiologische Anwendungen.
Montage des Mundsaugerrohrs	Sigma-Aldrich	Nr. A5177	für Aspirations-Eizellen
Pelletfarbe	Merck Millipore	69049-3	Ein Produkt zur Visualisierung der Pelletbildung während der Zentrifugation.
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol	Thermo Fisher Scientific	15593031	Eine Lösung, die bei der H2B-RFP-Extraktion zur Phasentrennung verwendet wird.
Plasmid-Kodierung H2B-RFP	Addgene	Plasmid #20972	Plasmid zur Markierung von Chromosomen mit rotem Fluoreszenzprotein (RFP)
PMSG (Englisch)	Prospec	HOR-272	Für die Superovalation der Maus
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	EO0491	Ein Enzym, das zur Verdauung von Proteinen verwendet wird und häufig in DNA/RNA-Extraktionsverfahren verwendet wird.
Restriktionsenzym NotI	New England Biolabs (NEB)	Nr. R3189S	Ein Restriktionsenzym, das in der DNA-Klonierung und in molekularbiologischen Anwendungen zur Linearisierung von H2B-RFP-Plasmiden verwendet wird.
RNase-Hemmer (optional)	New England Biolabs (NEB)	M0314S	Enzym, das verwendet wird, um den RNA-Abbau während RNA-bezogener Experimente zu verhindern.
RNase-freie Handschuhe	VWR / Fisher Scientific	Variiert je nach Größe	Handschuhe, die behandelt wurden, um eine RNase-Kontamination zu verhindern, die in RNA-Manipulationsprotokollen verwendet werden.
RNase-freie Pipettenspitzen	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Pipettenspitzen, die so konzipiert sind, dass sie frei von RNase-Kontaminationen für RNA-bezogene Anwendungen sind.
RNase-freies Wasser	Thermo Fisher Scientific	AM9932	Wasser, das gereinigt wird, um RNase-Enzyme zu entfernen, die für die RNA-Arbeit unerlässlich sind, um einen Abbau zu vermeiden.
Sicherheitsdatenblatt (10 %)	Sigma-Aldrich	Nr. L3771	Natriumdodecylsulfat wird zur Denaturierung von Proteinen in der Elektrophorese und anderen Experimenten verwendet.
SiR-Tubulin	Spirochrom	Nr. SC002	Ein Fluoreszenzfarbstoff, der spezifisch an Tubulin bindet, um die Spindel in lebenden Zellen abzubilden
Natriumacetat (3 M)	Sigma-Aldrich	Nr. S7899	Wird als Puffer und zur Präzipitation von DNA in molekularbiologischen Verfahren verwendet.
Spektralphotometer	Thermo Fisher (NanoTropfen)	ND-ONE-W	Instrument zur Quantifizierung von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Substanzen durch Messung der Absorption.
Stereomikroskop	Leica Microsystems	M165C	Ein Mikroskop, das für die dreidimensionale Betrachtung von Proben bei geringer Vergrößerung entwickelt wurde und für das Sezieren nützlich ist.
Spritzenvorsatz-Filtereinheit (0,22-& Mikro; m)	Merck	SLGP033RS	Wird für die Sterilfiltration von Flüssigkeiten verwendet, insbesondere in der Mikrobiologie und Molekularbiologie.
Spritzen und Nadelmontage	Terumo	SS+01T Tuberkulin-Spritzen	Wird für eine präzise PMSG-Abgabe verwendet.
T7 mMESSAGE mMACHINE Bausatz	Thermo Fisher Scientific	AM1344	Ein Kit für die in vitro Transkription von RNA aus einem T7-Promotor für die H2B-RFP cRNA-Präparation.
Wasserbad / Heizblock	Förderinstrumente	LBD4	Wird verwendet, um präzise Temperaturen in Experimenten aufrechtzuerhalten, die Wärme benötigen.