Quantifizierung der endothelialen Fettsäureaufnahme mit Hilfe von fluoreszierenden Fettsäureanaloga

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der zellulären Lipidaufnahme in Endothelzellen nach Stimulation mit BODIPY-C₁₂ und BODIPY-C₁₆ fluoreszierenden Analoga von langkettigen und sehr langkettigen gesättigten Fettsäuren. Diese Methode ist effizient und an andere Zelltypen anpassbar und bietet einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung des Fettstoffwechsels.

Zusammenfassung

Endothelzellen (ECs) spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Transports von Fettsäuren (FA) aus dem Blutkreislauf in das Stoffwechselgewebe, doch die Werkzeuge zur Quantifizierung der EC-FA-Aufnahme auf zuverlässige, skalierbare Weise sind nach wie vor begrenzt. In dieser Arbeit präsentieren wir einen schnellen, quantitativen und kostengünstigen Assay zur Messung der FA-Aufnahme in ECs unter Verwendung von fluoreszierenden FA-Analoga (BODIPY-C₁₂ und BODIPY-C₁₆), die es ermöglichen, die kettenlängenspezifische Aufnahmedynamik in einem 96-Well-Plattenformat zu untersuchen. Das Protokoll umfasst positive (3-Hydroxyisobutyrat, Laktat) und negative (Niclosamid) Kontrollen und ist sowohl in primären (HUVECs) als auch in immortalisierten (EA.hy926) EC-Linien validiert. Der Assay detektiert eine zeit- und dosisabhängige FA-Aufnahme, wobei die Ergebnisse mit Hilfe der Hoechst-Kernfärbung auf die Zellzahl normiert und mit geeigneten Kontrollen für den Hintergrund korrigiert werden. Es kann an eine Vielzahl von Zelltypen, Bildgebungsmodalitäten und experimentellen Bedingungen angepasst werden, einschließlich Lebendzell-Bildgebung und Puls-Chase-Formaten. Im Vergleich zu herkömmlichen Lipidfärbungen oder radioaktiv markierten Tracern bietet diese Methode eine verbesserte Sicherheit, Geschwindigkeit und Vielseitigkeit bei der Erfassung der dynamischen FA-Aufnahme in lebenden Zellen. Dieser Assay bietet eine robuste Plattform für die Untersuchung der Regulation des endothelialen Lipidtransports und seines Beitrags zu Stoffwechselerkrankungen.

Einleitung

Damit durch Blut übertragene Nährstoffe wie Lipide in Stoffwechselgewebe wie die Skelettmuskulatur gelangen können, müssen sie zunächst die Endothelzellschranke (EC) überwinden, die die Wände der kapillaren Blutgefäße umfasst. Während lange Zeit angenommen wurde, dass Fettsäuren (FAs) einfach über diese Barriere diffundieren, um das darunter liegende Gewebe zu erreichen, deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass ECs diesen Prozess aktiv durch spezialisierte Transportmechanismen regulieren, die entwickelt wurden, um hydrophobe Moleküle durch wässrige extra- und intrazelluläre Welten zu bewegen¹.

Im Blutkreislauf existieren FAs entweder als albumingebundene freie Fettsäuren (FFAs) oder sind in triglyceridreichen Lipoproteinen (TRLs) wie Chylomikronen und Lipoproteinen mit sehr niedriger Dichte (VLDLs)² verpackt. An der luminalen Oberfläche von ECs hydrolysiert die Lipoproteinlipase (LPL) TRLs, um FFAs für die Aufnahme freizusetzen. Eine Vielzahl von Proteinen ist am FA-Transport beteiligt, darunter CD36, das die eigentliche Aufnahme des FA in die Zelle durchführt; Fettsäuretransportproteine (FATPs) und Acyl-CoA-Synthetasen (ACSLs), die den vektoriellen Transport vermitteln; Fettbindungsproteine (FABPs), die als lipophile Chaperone fungieren, und unzählige andere, von denen einige noch nicht entdeckt und kategorisiert wurden ^2,3. Auch das darunterliegende Gewebe nutzt ähnliche Mechanismen, um das transportierte Fett aufzunehmen, obwohl sich die spezifischen Isoformen je nach Zelltyp oft unterscheiden.

Neuere Studien haben gezeigt, dass ECs sich über parakrine Signale mit benachbarten Zellen koordinieren, um den FA-Transport in das Zielgewebe zu modulieren. Zum Beispiel sezernieren Skelettmyozyten eine Sammlung von parakrinen Faktoren wie 3-Hydroxyisobutyrat (3-HIB), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor B (VEGFB) und Apelin, um den FA-Transport durch das nahe gelegene Endothel^{zu fördern 4,5,6}. Interessanterweise kann auch das endokrine System beteiligt sein, wie es der Fall ist, wenn Insulin die Adipozyten zur Freisetzung von Laktat anregt, was auch die ECs zur Aufnahme von FAs anregt⁷.

ECs fungieren somit als modulatorische Torwächter von Fett, was darauf hindeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei Fettstoffwechselstörungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Typ-2-Diabetes spielen. Jüngste Erkenntnisse haben gezeigt, dass die ECs selbst als Reaktion auf eine Fettüberladung Lipidtröpfchen (LDs) ansammeln, die möglicherweise als Puffer wirken, der die Fettsäureabgabe an das darunterliegende Gewebe reguliert ^8,9. Bei einem hohen Fettkonsum, wie es bei der modernen Ernährung der Fall ist, kann eine übermäßige Ansammlung dieser LDs zu vaskulären Funktionsstörungen und Krankheiten, einschließlich Bluthochdruck, beitragen¹⁰. Insgesamt könnte uns ein besseres Verständnis der Art und Weise, wie ECs FAs aufnehmen und transportieren, neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von durch Lipide übertragenen Krankheiten liefern.

In dieser Studie beschreiben wir einen einfachen, schnellen und kostengünstigen Assay zur Messung der endothelialen FA-Aufnahme unter Verwendung der fluoreszierenden langkettigen FA-Analoga BODIPY-C₁₂ und BODIPY-C₁₆. Diese Reagenzien sind relativ kostengünstig und recht sicher, insbesondere im Vergleich zu radioaktiven oder mit schweren Isotopen markierten FAs, die traditionell zur Messung der zellulären Fettaufnahme verwendet werden^11,12. Es ist wichtig zu beachten, dass sich diese Reagenzien von dem unkonjugierten "freien" BODIPY-Farbstoff unterscheiden, der sich passiv in hydrophoben Regionen der Zelle, hauptsächlich in LDs¹³, anreichert. Im Gegensatz dazu erzeugt die Konjugation von BODIPY an eine aliphatische FA-Kette (z. B. C₁₂ oder C₁₆) ein Molekül, das strukturell native langkettige FAs nachahmt. Diese Modifikation ermöglicht die spezifische Messung der dynamischen Fettsäureaufnahme in die Zellen, anstatt die intrazelluläre Lipidspeicherung oder Tröpfchenbildung widerzuspiegeln.

Eine wesentliche Stärke dieses Ansatzes ist seine Flexibilität. Forscher können andere Zelltypen, variable Inkubationszeiten und eine Reihe von BODIPY-konjugierten FA-Analoga verwenden, um die kettenlängenabhängige Aufnahme zu untersuchen, oder sogar natürlich fluoreszierende Lipide wie cis-parinäre Fettsäure¹⁴. Insgesamt wird dieses Protokoll den Forschern eine einfache Möglichkeit bieten, die zelluläre FA-Aufnahme unter verschiedenen Bedingungen zu testen und den Weg für die Beantwortung grundlegender Fragen des Fettstoffwechsels, der Endothelbiologie und der Stoffwechselerkrankungen zu ebnen (Abbildung 1).

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten humanen Endothelzellen (HUVECs) wurden aus kommerziell verfügbaren, anonymisierten Quellen in Übereinstimmung mit den institutionellen und herstellerseitigen Richtlinien für die ethische Verwendung von humanbiologischem Material gewonnen. Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Umgebung unter einer Laminar-Flow-Haube durch. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste aller Reagenzien und Geräte.

1. Gelatinebeschichtung einer 96-Well-Platte

1. Bereiten Sie eine 0,1%ige Gelatinelösung vor, indem Sie 25 ml 2%ige Gelatinebrühe in 500 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen.
2. Gründlich mischen und mit einem 0,2-μm-Vakuumfilter (oder Autoklav) filtrieren.
3. Geben Sie 100 μl der 0,1 %igen Gelatine pro Vertiefung auf eine schwarze 96-Well-Platte mit klarem Boden.
4. Bei 37 °C mindestens 30 min oder idealerweise über Nacht inkubieren.

2. Aussaat von Zellen

1. Bereiten Sie eine einzellige Suspension von ECs in einem vollständigen Medium vor.
   1. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie das entsprechende Basalmedium mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin (v/v für beide) ergänzen.
      HINWEIS: Das Basalmedium unterscheidet sich je nach Zelltyp. In dieser Studie wurden das endotheliale Wachstumsmedium (EGM-2) und das modifizierte Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco für HUVECs bzw. EA.hy926-Zellen verwendet.
2. Pipettieren Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung mit einer Aussaatdichte, die es den Zellen ermöglicht, am nächsten Tag den Zusammenfluss zu erreichen.

3. Vorbereitung und Anwendung des Behandlungsreagenzes

1. Alle Reagenzien in zweiwertigem PBS (mit Ca²⁺ und Mg²⁺) vorbereiten und auf 37 °C vorwärmen.
   1. 3-HIB (Positivkontrolle) als 20 mM Arbeitslösung vorbereiten. Die Stammlösung wird bei 1 M in doppelt destilliertem Wasser aufgelöst und bei 4 °C gelagert.
   2. Laktat (Positivkontrolle) als 20 mM Arbeitslösung herstellen. Die Stammlösung wird bei 1 M in doppelt destilliertem Wasser aufgelöst und bei 4 °C gelagert.
   3. Niclosamid (Negativkontrolle) wird in einer Endkonzentration von 1 μM hergestellt. Die Stammlösung wird bei 10 mM in DMSO gelöst. Aliquotieren Sie in kleinere Volumina, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden, und lagern Sie sie bei -20 °C.
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem zweiwertigem PBS.
3. Geben Sie 50 μl des entsprechenden Behandlungsreagenzes (3-HIB, Laktat oder Niclosamid) pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang (für Niclosamid) bzw. 60 Minuten (für 3-HIB und Laktat) bei 37 °C.

4. BODIPY-FA: BSA-Komplexvorbereitung und -anwendung

1. Bereiten Sie BODIPY-FA: BSA-Komplexe in Endkonzentrationen von 0,5 μM, 1 μM oder 2 μM in PBS unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von 2:1 FA: BSA her. Für eine 2 μM BODIPY-FA-Lösung inkubieren Sie mit 1 μM FA-freiem BSA in PBS. Für 1 μM BODIPY-FA verwenden Sie 0,5 μM BSA usw. Schützen Sie Komplexe während der Inkubation immer vor Licht.
2. Die Mischung vor Gebrauch 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Geben Sie 50 μl des Komplexes in die behandelten Vertiefungen.
   HINWEIS: Verwenden Sie nur die mittleren 10 Spalten, um Kanteneffekte zu vermeiden. Reservieren Sie die äußeren Säulen als Autofluoreszenzkontrollen und fügen Sie diesen Vertiefungen nur PBS hinzu.
4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1 min, 5 min oder 10 min.

5. Fluoreszenzlöschung und intrazelluläre Signaldetektion

1. 1 μM FA-freies BSA in PBS als Waschpuffer vorbereiten und auf 37 °C vorwärmen.
2. BODIPY-FA: BSA entfernen und die gesamte Platte zweimal mit 50 μl vorgewärmtem 1 μM FA-freiem BSA in PBS waschen. Führen Sie jede Wäsche 1,5 Minuten lang durch.
3. Fügen Sie 50 μl 0,08 % Trypanblau hinzu, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu löschen.
4. Messen Sie sofort die intrazelluläre Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Reader mit den folgenden Einstellungen: Anregung: 488 nm, Emission: 515 nm, Cutoff: 495 nm, Modus: Bottom-Read.
   HINWEIS: Subtrahieren Sie den Autofluoreszenzhintergrund unter Verwendung der äußeren Säulenvertiefungen, die Zellen enthalten, die in Schritt 4 nicht mit BODIPY-FA behandelt wurden.

6. Hoechst-Kernfärbung zur Zellnormalisierung

1. Entfernen Sie die Trypanblau-Lösung und waschen Sie sie vorsichtig mit PBS.
   HINWEIS: Die Zellen können etwas zerbrechlich sein und zum Ablösen neigen. Seien Sie vorsichtig beim Waschen.
2. 4 μg/mL Hoechst in 10%iges Medium geben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit von Hoechst kann optimiert werden. Je nach Zelltyp können 5 bis 60 Minuten erforderlich sein, um eine gleichmäßige Kernmarkierung und eine ausreichende Signalintensität zu erreichen. Fügen Sie Hoechst nicht zu den äußeren Spalten hinzu.
3. Waschen Sie den Teller einmal mit PBS.
4. Fügen Sie frisches PBS hinzu und messen Sie die Hoechst-Fluoreszenz mit den folgenden Einstellungen: Anregung: 350 nm, Emission: 461 nm, Cutoff: 455 nm, Modus: Bottom-Read.
   HINWEIS: Subtrahieren Sie den Hoechst-Autofluoreszenzhintergrund mit den äußeren Säulenvertiefungen.
5. Normalisieren Sie die BODIPY-FA-Fluoreszenz auf die Zellzahl, indem Sie die autofluoreszenzkorrigierten Werte aus Schritt 5.3 durch die entsprechenden Hoechst-Werte dividieren, die in Schritt 6.4 erhalten wurden. Verwenden Sie hintergrundkorrigierte Werte sowohl für BODIPY- als auch für Hoechst-Signale.
   HINWEIS: Die endgültigen Werte stellen die BODIPY-FA-Aufnahme dar, normiert auf die Zellzahl, korrigiert um Autofluoreszenz sowohl im BODIPY- als auch im Hoechst-Kanal.

7. Statistische Auswertung

1. Führen Sie eine statistische Analyse für Abbildung 2 mit einer bidirektionalen ANOVA durch, um die Auswirkungen von Zeit, Konzentration und deren Interaktion zu bewerten. Wenden Sie den Post-hoc-Test von Tukey für mehrere Vergleiche an.
2. Verwenden Sie für Abbildung 3 und Abbildung 4 den ungepaarten zweiseitigen t-Test von Student, wenn Sie zwei Bedingungen vergleichen. Verwenden Sie für Experimente mit drei oder mehr Bedingungen eine unidirektionale ANOVA, gefolgt von einem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1 dargestellt, wird bei diesem Assay ein 96-Well-Plattenformat verwendet, bei dem ECs direkt in die Wells ausgesät werden. BODIPY-markierte FAs werden an Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert und sowohl in Versuchs- als auch in Kontrollvertiefungen appliziert. Vor der FA-Behandlung können ECs durch pharmakologische Behandlungen oder genetische Störungen wie siRNA-Transfektion oder CRISPR-Geneditierung manipuliert werden. Entscheidend ist, dass solche Manipulationen auch die Einbeziehung geeigneter Positiv- und Negativkontrollen ermöglichen, um die Zuverlässigkeit des Assays zu gewährleisten.

Ein deutlicher dosis- und zeitabhängiger Anstieg des intrazellulären BODIPY-C_12-Signals wurde nach Inkubation von BODIPY-C₁₂ bei 0,5 μM, 1 μM und 2 μM für 1 min, 5 min und 10 min sowohl in HUVECs als auch in EA.hy926-Zellen beobachtet (Abbildung 2). Um mögliche Schwankungen der Zellzahl pro Vertiefung zu berücksichtigen, wurden die BODIPY-C_12-Werte auf die Hoechst-Kernfärbung normiert und fluoreszierend gemessen. Die Hintergrund-Autofluoreszenz wurde mit No-BODIPY- und No-Hoechst-Kontrollwells korrigiert.

Um die Reproduzierbarkeit und den Bereich des Assays zu validieren, wurden bekannte Modulatoren des Fettsäurestoffwechsels in EA.hy926 ECs mit BODIPY-C₁₂ getestet (Abbildung 3). Eine 1-stündige Behandlung mit steigenden Laktatkonzentrationen (0 mM, 5 mM, 20 mM) oder 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) erhöhte die Aufnahme von BODIPY-C₁₂ dosisabhängig und bestätigte ihre Rolle als positive Regulatoren der FA-Aufnahme. Umgekehrt konnte bereits gezeigt werden, dass die Chemikalie Niclosamid die Fettsäureaufnahme über die mitochondriale Entkopplung hemmen kann¹⁵. In der Tat wurden hier ähnliche Ergebnisse reproduziert, da eine 30-minütige Behandlung mit Niclosamid (1 μM) das BODIPY-C_12-Signal im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant reduzierte, was seinen Nutzen als Negativkontrolle bestätigte. Obwohl diese Daten auf Hoechst normalisiert wurden, um Unterschiede in der Zellzahl zu berücksichtigen, veränderte keine dieser Behandlungen die Zellviabilität oder die Hoechst-Fluoreszenzwerte.

Um die Anpassungsfähigkeit des Assays an verschiedene Fettsäureanaloga zu bewerten, wurde BODIPY-C₁₆, das als Proxy für eine sehr langkettige Fettsäure angesehen werden kann, HUVECs verabreicht und seine Aufnahme nach 5-minütigen Inkubationen gemessen (Abbildung 4). Es wurde beobachtet, dass die Laktatbehandlung (0 mM, 10 mM, 20 mM) das BODIPY-C_16-Signal dosisabhängig erhöhte, während Niclosamid (1 μM) das Signal reduzierte, was die bei BODIPY-C₁₂ beobachteten Ergebnisse widerspiegelt.

Alles in allem hat dieser Assay eine robuste und reproduzierbare Quantifizierung der FA-Aufnahme sowohl in primären (HUVEC) als auch in immortalisierten (EA.hy926) ECs ermöglicht. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse die Vielseitigkeit des Assays über FAs unterschiedlicher Kettenlängen hinweg und zeigen die Validität sowohl von Positiv- als auch von Negativkontrollen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Fettsäureaufnahmeassays mit BODIPY-markierten Fettsäuren. Endothelzellen werden in eine schwarze 96-Well-Platte mit klarem Boden ausgesät und mit BODIPY-konjugierten Fettsäureanaloga (FA) inkubiert, um eine intrazelluläre Aufnahme zu ermöglichen. Nach der Inkubation wird die extrazelluläre Fluoreszenz mit Trypanblau gelöscht und das intrazelluläre Signal mit einem Bottom-Read-Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Die Kernfärbung von Hoechst wird nach der Fluoreszenzmessung aufgetragen, um die Zellzahl für die Normalisierung zu quantifizieren. Vor der Inkubation mit BODIPY-FA können pharmakologische Behandlungen oder genetische Störungen durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Quantifizierung der BODIPY-C_12-Aufnahme in primären und immortalisierten Endothelzellen. (A) Zeit- und konzentrationsabhängiger Anstieg der BODIPY-C_12-Aufnahme in HUVECs nach 1 min, 5 min und 10 min Inkubationen bei 0,5 μM, 1 μM und 2 μM BODIPY-C₁₂ komplexiert mit 0,25 μM, 0,5 μM bzw. 1 μM FA-freiem BSA. (B) EA.hy926-Zellen zeigten unter identischen Bedingungen eine ähnliche zeit- und dosisabhängige BODIPY-C_12-Aufnahme . Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde auf Hoechst-gefärbte Zellkerne (Zellzahl) und No-BODIPY-Kontrollen normiert. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer bidirektionalen ANOVA durchgeführt, um die Auswirkungen von Zeit, Konzentration und deren Interaktion zu bewerten, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Signifikante Haupteffekte wurden für die Zeit (p < 0,0001), die Konzentration (p < 0,0001) und ihre Wechselwirkung (p = 0,0443) beobachtet. Statistisch signifikante paarweise Vergleiche, die durch den Tukey-Test identifiziert wurden, sind im Balkendiagramm wie folgt dargestellt: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Validierung des Assays mit Positiv- und Negativkontrollen in EA.hy926. (A) Die 1-stündige Laktatbehandlung (0 mM, 5 mM, 20 mM) erhöhte die Aufnahme von BODIPY-C₁₂ dosisabhängig. (B) Eine 1-stündige 3-HIB-Behandlung (0 mM, 5 mM, 20 mM) erhöhte die FA-Aufnahme in ähnlicher Weise. (C) Die 30-minütige Behandlung mit Niclosamid (1 μM) unterdrückte die Aufnahme von BODIPY-C₁₂ im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle (DMSO) signifikant. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde auf Hoechst-gefärbte Zellkerne (Zellzahl) und No-BODIPY-Kontrollen normiert. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. 2 μM BODIPY-C₁₂ (komplexiert mit 1 μM fettsäurefreiem BSA) wurde in allen Experimenten 5 Minuten lang inkubiert. Die Statistiken für (A) und (B) wurden unter Verwendung der unidirektionalen ANOVA mit dem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche und für C mit dem ungekoppelten zweiseitigen T-Test von Student bestimmt. p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Assay-Validierung mit BODIPY-C₁₆ in HUVECs. (A) Die Laktatbehandlung (0 mM, 10 mM, 20 mM für 1 h) erhöhte die Aufnahme von BODIPY-C₁₆ dosisabhängig. (B) Die Behandlung mit Niclosamid (1 μM für 1 h) reduzierte das BODIPY-C_16-Signal im Vergleich zur Vehikel-behandelten Kontrolle signifikant. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde auf Hoechst-gefärbte Zellkerne (Zellzahl) und No-BODIPY-Kontrollen normiert. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. 2 μM BODIPY-C₁₆ (komplexiert mit 1 μM fettsäurefreiem BSA) wurde in allen Experimenten 5 Minuten lang inkubiert. Die Statistiken für (A) wurden unter Verwendung der unidirektionalen ANOVA mit dem Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche und für B unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen T-Tests von Student ermittelt. *p < 0,05, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Assay bietet eine schnelle, quantitative und kostengünstige Methode zur Messung der FA-Aufnahme in ECs unter Verwendung eines plattenbasierten 96-Well-Formats und fluoreszierender langkettiger FA-Analoga. Durch die Einbeziehung von Positiv- und Negativkontrollen und die Validierung über primäre (HUVECs) und immortalisierte (EA.hy926) ECs hinweg demonstriert dieses Protokoll Robustheit, Reproduzierbarkeit und breite Anwendbarkeit.

Fluoreszenzbasierte Analysen haben maßgeblich dazu beigetragen, parakrine Regulatoren des endothelialen Lipidtransports aufzudecken, wie bereits erwähnt ^4,5,7. Diese Beispiele zeigen, wie ein standardisiertes System die metabolitengetriebene Regulation des Lipidtransports in einer kontrollierten in vitro-Umgebung weiterhin zuverlässig aufklären kann. Das hier beschriebene Protokoll legt Schlüsselparameter für zuverlässige FA-Aufnahmemessungen fest, einschließlich der Verwendung von BODIPY-C₁₂ und BODIPY-C₁₆ bei mehreren Konzentrationen (0,5-2 μM) und Inkubationszeiten (1 min, 5 min und 10 min). Es erkannte auch effektiv eine erhöhte Aufnahme als Reaktion auf 3-HIB und Laktat und eine verringerte Aufnahme nach der Behandlung mit Niclosamid, was sowohl seine Empfindlichkeit als auch seinen Dynamikbereich bestätigt. Obwohl dieser Assay hier für ECs optimiert ist, kann er mit Anpassungen an BODIPY: BSA-Verhältnisse und Behandlungsbedingungen problemlos an andere Zelltypen wie Adipozyten, Myotuben oder Hepatozyten angepasst werden. Es kann auch für die Bildgebung lebender Zellen mit kompatiblen Platten modifiziert oder in ein Pulsverfolgungsformat angepasst werden, um die intrazelluläre FA-Retention, den Metabolismus oder den Efflux zu bewerten.

Im Vergleich zu anderen Ansätzen bietet diese Methode deutliche Vorteile: Sie ist skalierbar, quantitativ und an verschiedene FA-Kettenlängen anpassbar. Darüber hinaus ist es kostengünstig, erfordert nur eine Handvoll Schritte und erfordert Instrumente, die nicht komplexer sind als ein herkömmlicher Mikroplatten-Reader, so dass neue Benutzer, einschließlich Studenten, dieses Protokoll schnell beherrschen können. Im Gegensatz zu qualitativen Mikroskopie-basierten Methoden oder Endpunktfärbungen wie Oil Red O, die den kumulativen Lipidgehalt widerspiegeln, erfasst dieses Protokoll die FA-Aufnahme in Echtzeit, ohne dass eine Fixierung oder Lyse erforderlich ist.

Nichtsdestotrotz sollten einige Einschränkungen beachtet werden. Die Verwendung eines statischen 2D-Kultursystems rekapituliert die physiologische Komplexität des Gefäßmilieus nicht vollständig. Schlüsselfaktoren wie Scherspannung oder LPL-vermittelte Lipolyse sowie endothelial-parenchymale Wechselwirkungen fehlen in diesem vereinfachten Modell. Fortschrittliche Systeme, wie z. B. mikrofluidische oder organoidbasierte 3D-Cokulturen, ahmen die In-vivo-Architektur und -Signalübertragung besser nach, erfordern jedoch mehr technisches Know-how und Infrastruktur^16,17. Zum Beispiel bieten mikrofluidische Bioreaktoren eine Umgebung, in der ECs die Bildung von Mikrogefäßen nachahmen und mit anderen Gewebetypen interagieren können, was es den Forschern ermöglicht, die parakrine Dynamik in einer physiologischeren Umgebung zu modellieren¹⁸. Darüber hinaus haben neuere Arbeiten gezeigt, dass spezialisierte Systeme entwickelt werden können, um Live-Fluoreszenzbildgebung in 3D-Hydrogelkulturen durchzuführen19. Solche Fortschritte geben Zuversicht, dass dieser Assay eines Tages an Zellkultursysteme angepasst werden könnte, die physiologisch repräsentativer sind, aber es müsste eine Optimierung durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Assay eine flexible, zugängliche und reproduzierbare Plattform für die Untersuchung der zellulären FA-Aufnahme unter verschiedenen Bedingungen darstellt. Obwohl es sich am besten für mechanistische In-vitro-Studien eignet, könnten die Erkenntnisse aus diesem System in zukünftige Arbeiten mit physiologisch relevanteren Modellen des endothelialen Lipidtransports einfließen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Hydroxyisobutyrat (3-HIB)	Cayman Chemicals	26105	Positive Kontrolle, 5 oder 20 mM Endkonzentration
96 Brunnen schwarze, transparente Polystyrol-Mikroplatten	Sigma-Aldrich	CLS3603-48EA	Für die Untersuchung von Panzerungszellen
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)	Thermo Fisher Scientific	D3822	Grüne fluoreszierende langkettige Fettsäure
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)	Thermo Fisher Scientific	D3821	Grüne fluoreszierende sehr langkettige Fettsäuren
Rinderserum-Albumin-Lösung	Sigma-Aldrich	A9205-50ML	Zur Herstellung des Bodipy:BSA-Komplexes verwendet
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Lösungsmittel für Arzneimittelaktien
Einweg-Pipetter-Reservoirs	VWR	89094-680	Enthält die verschiedenen Lösungen, die auf die Zellen pipettiert werden sollen
Dulbecco' s Modifizierter Adler' s Medium	Corning Life Sciences	10-013-CV	Medien für EA.hy926-Zellen
EA.hy926-Zellen	ATCC	CRL-2922	Unsterbliche Endothelzell-Hybridlinie
EGM-2 Endothelzellwachstumsmedium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Medien für HUVECs
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	10 % Ergänzung in EGM-2 und DMEM
Fluoreszenz-Mikroplattenleser	Verschiedene	N/A	Jeder Mikroplattenleser, der Fluoreszenzmessungen durchführen kann
Gelatinelösung	Sigma-Aldrich	G1393-100ml	Wurde verwendet, um Platten mit einer Arbeitskonzentration von 0,1 % zu beschichten
Hoechst 33342 Lösung	Lebenswissenschaften	62249	Kernfärbung zur Zellnormalisierung (4 & mu; M)
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVECs)	Lonza	C2519A	Primäre menschliche Endothelzellen
Mehrkanal-Pipette	VWR	76627-768	Zum Pipettieren in eine 96-Well-Platte
Niclosamide	Millipore Sigma	N3510-50G	Negative Kontrolle, 1 & mu; M  Abschließender Schwerpunkt
PBS mit Kalzium und Magnesium	Fisher Scientific	21031CV	Verwendet zur Vorbereitung von Behandlungen und als Waschpuffer (mit BSA)
PBS, ohne Kalzium und Magnesium	Genesee Scientific	25-508	Für Gelatineverdünnung, Hoechst-Färbung und allgemeine Washes
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	1%-Ergänzung in EGM-2 und DMEM
Natrium-L-Laktat	Sigma-Aldrich	L7022-5G	Positive Kontrolle, 5 oder 20 mM Endkonzentration
Trypan-Blau-Lösung	Sigma-Aldrich	T8154-20ML	Verwendet bei 0,08 % zur Löschung der extrazellulären Fluoreszenz
Vakuumfiltersysteme, 500ml PES-Membran, 0,45µ m	GenClone	25-227	Zur Sterilisation der Gelatinelösung