Eine benutzerfreundliche und leistungsstarke R-Analyse von großräumigen Datensätzen

Mit der zunehmenden Verfügbarkeit großer Datensätze im wissenschaftlichen Bereich ist es wichtig, benutzerfreundliche Werkzeuge zu entwickeln, die es Forschern ermöglichen, diese großen Datensätze schnell und genau und einfach zu analysieren. Eine Art des üblichen großen Datensatzes stammt aus der Verwendung des Luciferase-Gens als Reporter, der eine einfache, kontinuierliche und nicht-invasive Untersuchung der Genexpression in lebenden Zellen und Organismen ermöglicht hat. Die Automatisierung der Lumineszenzaufzeichnung hat die Messung der Luziferase-Lumineszenz verändert und zu einer Ausweitung der Datenerfassung insbesondere im zirkadianen Uhrenfeld geführt ^1,2. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und einem automatischen Plattenleser mit Stapler können Tausende von Proben, die das Luciferase-Gen exprimieren, in einem Experiment einzeln in Zeitreihen untersucht werden, manchmal in einstündigen Intervallen für Tage. Solche Hochdurchsatz-Experimente haben zur Produktion großer Datensätze geführt, die herkömmliche Genexpressionsexperimente mit Handprobenentnahme, gefolgt von RNA-Verarbeitung, unmöglich erreichen könnten. Die zeitnahe Analyse solch großer Datensätze ist wichtig, kann aber auch eine Herausforderung darstellen.

Obwohl es eine Fülle von Werkzeugen gibt, um Daten auf Rhythmizität zu analysieren, analysieren viele der Werkzeuge verhaltensbasierte Assays von Tieren und nicht die Expression von Lumineszenzreportern 3,4,5,6,7 (Ergänzende Tabelle S1). Einige Tools setzen voraus, dass Forscher über Vorkenntnisse in der Computerprogrammierung verfügen, z. B. Python-Kenntnisse oder Zugang zu MATLAB. Andere Tools erfordern den Kauf von Software, was kostspielig sein kann. Einige kostenlose, praktikable Lösungen sind online verfügbar. Eines dieser Tools ist BioDare2⁸, das eine Vielzahl verschiedener Methoden zur Analyse von Rhythmizitätsdaten bietet. BioDare2 ist ein benutzerfreundliches Online-Tool und erfordert nur minimale Rechenkenntnisse. Benutzer müssen die Dateneingabe online hochladen und die Datenausgabe von der Online-Schnittstelle zur weiteren Verarbeitung herunterladen.

Hier stellen wir benutzerfreundliche R-Skripte mit mehreren Funktionen vor, mit denen Sie große Datensätze problemlos analysieren können. Wir verwenden die kostenlose Open-Source-Software RStudio⁹, eine Schnittstelle für R und Python, um die Skripte auszuführen. RStudio kann auf verschiedenen Computersystemen verwendet werden, einschließlich Windows, Mac und Linux. In diesem Bericht werden detaillierte schrittweise Anweisungen bereitgestellt, um Benutzer bei der Verwendung der R-Skripts zu unterstützen, insbesondere in den Protokollabschnitten 1 und 2. Diese Methode erfordert nur minimale Eingaben des Benutzers. Ein Anfänger, der keine R-Vorkenntnisse hat und keine Programmiererfahrung hat, soll in der Lage sein, die Methode zur Analyse großer Datensätze aus Luciferase-Assays oder anderen Arten von Datensätzen mit Zeitreihendaten zu verwenden. Alle Ein- und Ausgabedaten werden auf einem lokalen Rechner gespeichert, so dass eine Analyse überall ohne Einschränkung des Internetzugangs durchgeführt werden kann, sobald alle relevanten R-Pakete zum ersten Mal heruntergeladen wurden. Die Ausgabedaten werden in übersichtliche Ordner sortiert, deren Ergebnisse für die Verarbeitung für Veröffentlichungen bereit sind. Statistische Analysen sind ebenfalls Teil der Ausgabe, um eine schnelle Bewertung der Unterschiede zwischen den Stichproben zu ermöglichen. Daher könnte die R-Methode eine einfache und leistungsstarke Lösung für Forscher bei der Analyse großer Datensätze bieten.

1. Luciferase-basierte Analyse der zirkadianen Uhr

1. Versuchsaufbau für den Luciferase-Assay
   HINWEIS: Der Luciferase-Assay ist eine gängige Methode, um die Aktivität der zirkadianen Uhr in Echtzeit zu messen. Die Lumineszenz, die vom Luciferase-Reporter emittiert wird, der von lebenden transgenen Organismen und/oder Zellen getragen wird, kann automatisch aufgezeichnet werden, was zur Erstellung großräumiger Zeitreihen-Datensätze führt. Unser Labor verwendet hauptsächlich Arabidopsis thaliana-Keimlinge, die das Luciferase-Gen exprimieren, als Reporter. Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen ein Flussdiagramm des typischen Versuchsaufbaus für den Luciferase-Assay mit Sämlingen in einem 96-Well-Format in unserem Labor, modifiziert auf der Grundlage einer früheren Beschreibung².
   1. Sterilisieren Sie die Samen mit Bleichdampf, der durch Zugabe von 3 ml 36 % (w/w) HCl zu 100 ml Hausbleiche in einem Becherglas für 3 Stunden erzeugt wird. Legen Sie den Becher in eine Glocke mit versiegeltem Deckel und stellen Sie ihn in einen chemischen Abzug. Nach der Sterilisation werden die Samen auf 1/2MS-Platten mit 0,5 % Saccharose und 0,8 % Agar (pH 5,7) mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette in einem Laminar-Flow-Schrank plattiert. Sammeln Sie die chemischen Abfälle in einem Glas mit Deckel und entsorgen Sie sie in Zusammenarbeit mit dem institutionellen Umweltgesundheitsdienst.
   2. Stellen Sie die Platten 2 Tage lang bei 4 °C auf, bevor Sie sie in eine Gewebekulturkammer mit 12 h Licht- und 12 h Dunkellichtzyklus (LD) stellen.
   3. Lassen Sie die Sämlinge 4 Tage in LD wachsen.
   4. Übertragen Sie die Sämlinge auf eine 96-Well-Platte; Jede Vertiefung enthält 180 μl Testmedium (1/2 MS, 0,5 % Saccharose, 0,4 % Agar, 0,25 mM Luciferin). Legen Sie die Platten für 1 Tag in LD, gefolgt von 1 Tag in 24 h konstantem Licht (LL).
   5. Fügen Sie den Vertiefungen Behandlungen oder Scheinlösungen hinzu und zeichnen Sie die Lumineszenz in 1-Stunden-Intervallen für 5-7 Tage in LL auf. Stellen Sie die Emissionsfilterlinse auf 3.600 für die Verstärkung und die Messintervallzeit auf 1 s ein.
      HINWEIS: Die Startzeit für die Aufnahme kann jederzeit sein. Da das R-Skript jedoch nur ganze Zahlen (ganze Zahlen) akzeptiert, müssen die Aufzeichnungsintervalle eine ganze Zahl sein. Beispielsweise ist ein Intervall von 1 h zulässig, aber ein Intervall von 15 Minuten ist für das R-Skript nicht zulässig.
   6. Machen Sie am Ende der Aufnahme ein Foto von der Platte, um das Wachstum der Sämlinge aufzuzeichnen.
   7. Speichern Sie Rohdaten als CSV-Datei für die R-Analyse, indem Sie die Funktion "Speichern unter" mit der Datenanalysesoftware für den Plattenleser verwenden.
2. Schrittweise Erklärung der R-Analyse von Luciferase-basierten zirkadianen Daten
   HINWEIS: Für diese R-Analyse wird das R-Skript verwendetErgänzende Akte 1(LUC_2025.R), das für die zirkadiane Datenanalyse entwickelt wurde, und die EingabedateiErgänzende Akte 2(NO7.csv). Das R-Skript ist zusammen mit der Eingabedatei über die Online-Repository-Plattform Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis) öffentlich verfügbar.
   1. Laden Sie die RStudio-Software herunter, die mit dem Computersystem ^9,10 kompatibel ist.
   2. Laden Sie die RStudio-Algorithmuspakete herunter, die für die Ergänzungsdatei 1 (LUC_2025.R) erforderlich sind: MetaCycle¹¹: ARSER-Algorithmus¹² des MetaCycle-Pakets, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ und broom²⁰.
      HINWEIS: Die Liste der Pakete finden Sie auch oben im R-Skript.
   3. Ändern Sie die Benutzereingabe I (entsprechend einem bestimmten Datensatz auf einem lokalen Computer, einschließlich des Arbeitsverzeichnisses, des Namens der Eingabedatei, der Beschriftungen für die Behandlungen und der relativen Startzeit des Assays.
      HINWEIS: Die Schritte 1.2.1 und 1.2.2 müssen nur einmal ausgeführt werden. Danach ist die RStudio-Schnittstellenkonsole bereit, Benutzereingaben entgegenzunehmen, mit Änderungen für jede neue Analyse. Der Abschnitt "Benutzereingabe" besteht aus zwei Teilen (Ergänzende Abbildung S1).
      1. Wählen Sie das Arbeitsverzeichnis aus. Geben Sie an, wo sich die Eingabedatei befindet. Derselbe Ordner ist der Speicherort für die Ausgabedateien.
      2. Wählen Sie die Eingabedatei aus, eine CSV-Datei, die korrekt für das R-Skript formatiert ist (Abbildung 2B). Die oberste Zeile enthält die Zeitreihe, und die erste Spalte enthält einzelne Probenpositionen auf einer 96-Well-Platte.
         HINWEIS: Ein Beispiel für eine solche CSV-Eingabedatei finden Sie in der Zusatzdatei 2 (NO7.csv).
      3. Benennen Sie die Proben und/oder Behandlungen. Da diese Analyse für Daten aus 96-Well-Einstellungen mit einem Zeitverlauf verwendet wird, planen Sie die Experimente als 8 Replikate pro Behandlung für insgesamt bis zu 12 Behandlungen pro Platte oder als 12 Replikate pro Behandlung für insgesamt bis zu 8 Behandlungen pro Platte. Stellen Sie sicher, dass Sie die richtige Anzahl von Stichproben eingeben, entweder 8 oder 12, da die Stichprobenzahl zählt. Wenn die Stichprobenanzahl nicht 8 oder 12 beträgt, wird der Code nicht ausgeführt. Wenn es jedoch Reihen mit leeren Vertiefungen gibt, listen Sie diese einfach als solche im Feld für Behandlungsnamen auf, z. B. als leer 1, leer 2...
         HINWEIS: Bei Beispielnamen sollte die Verwendung von umgekehrten Schrägstrichen oder ähnlichen Symbolen vermieden werden, da diese Probleme mit Dateinamen verursachen können. Darüber hinaus sollte man auch vermeiden, "NA" als Beschriftung zu verwenden, wenn man sich für die Verwendung von ANOVA in der Benutzereingabe II entscheidet. Alle Behandlungen mit dem exakt gleichen Namen werden zu einer großen Behandlungsgruppe zusammengefasst.
      4. Geben Sie die relative Startzeit für den Assay an. Für einen gegebenen Tag von 24 Stunden ist die subjektive Morgendämmerung, wenn das Kammerlicht während eines normalen Hell-Dunkel-Zyklus eingeschaltet wird. Wenn zum Beispiel um 7 Uhr morgens Licht an ist, betrachten Sie diese Zeit als die zirkadiane Zeit 0. Wenn ein Luciferase-Assay um 9 Uhr morgens beginnt, liegt die Assay-Zeit bei zirkadianer Zeit 2; Eingabe 2 als relative Startzeit.
         HINWEIS: Die relative Startzeit muss eine ganze Zahl sein und darf nicht negativ sein. Dies wirkt sich auf die Phasenlesung der Proben aus.
   4. Ändern Sie die Optionen für die Benutzereingabe II nach spezifischen Bedürfnissen.
      HINWEIS: Die folgenden Anweisungen enthalten eine detailliertere Erläuterung der Abschnitte für Benutzereingaben und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Vornehmen der Änderungen.
      1. Fügen Sie Diagramme hinzu: Lumineszenzkurven, Diagramme für die Periode, Phase und Amplitude pro Genotyp und Behandlung.
      2. Verwenden Sie den ANOVA-Test mit dem Tukey HSD, um Behandlungen hinsichtlich Periode, Phase und Amplitude zu vergleichen. Wählen Sie ein Steuerelement für die ANOVA-Testausgabe aus. Geben Sie das Steuerelement für den ANOVA-Test an, oder lassen Sie die Option leer, um jede Behandlung als Kontrolle im paarweisen Vergleich zu verwenden. Alternativ können Sie auswählen, ob die ANOVA-Ausgabedateien nummeriert werden sollen, um eine schnellere Referenz und Organisation zu ermöglichen.
      3. Verwenden Sie einen t-Test, um Behandlungen hinsichtlich Periode, Phase und Amplitude zu vergleichen. Wählen Sie, ob der t-Test ein paarweiser Vergleich sein soll. Wenn ein paarweiser t-Test ausgewählt ist, wählen Sie aus, ob die Daten gekoppelt sind. Wählen Sie ein Steuerelement für den t-Test aus. Geben Sie das Steuerelement für den t-Test an, oder lassen Sie die Option leer, um jede Behandlung als Kontrolle zu verwenden. Wählen Sie aus, ob die t-Test-Ausgabedateien nummeriert werden sollen, um eine schnellere Referenz und Organisation zu ermöglichen.
         HINWEIS: Dies sollte nur verwendet werden, um zwei Behandlungen gleichzeitig zu vergleichen, z. B. zwei Linien desselben Genotyps, denen entweder SA oder Mock hinzugefügt wurde. Die angezeigten p-Werte sind nicht angepasst, um Mehrfachvergleiche mit derselben Linie zu berücksichtigen.
      4. Wählen Sie aus, ob die Zeitpunkte gerundet werden sollen. Wenn die Zeitpunkte nur um ein oder zwei Minuten abweichen, runden Sie auf die nächste Stunde, und verwenden Sie diese Analyse.
         HINWEIS: Dieser Code berechnet die Periode, Phase und Amplitude mit der ARS-Methode¹². Für diese Methode ist eine konsistente Zeitreihe in Stunden erforderlich, um ausgeführt zu werden.
      5. Je nachdem, wie der Plattenleser Vertiefungen aufzeichnet, ändern Sie die Art und Weise, wie die Eingabe gelesen wird. Wählen Sie entweder die Standarddatenliste der Bohrlöcher nach A1, A2, A3... oder die für Brunnen, die nach A1, B1, C1 aufgelistet sind...
   5. Führen Sie die Analyse aus, indem Sie einfach auf die Schaltfläche Quelle in der oberen rechten Ecke der Konsole klicken.
      HINWEIS: Die Analyse dauert weniger als 1 Minute. Die Ausgabe der R-Analyse wird automatisch im selben Dateiordner wie das Eingabe-Dataset angezeigt.
   6. Ausgabe anzeigen: Der Ausgabeordner enthält mehrere Dokumente und Unterordner, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen, einschließlich statistischer Informationen über die gemittelte Periode, Phase und Amplitude für Replikate jedes Genotyps und/oder jeder Behandlung.
      HINWEIS: Für die Eingabedatei Supplemental File 2 (NO7.csv) ist eine Liste der Ausgabedokumente, die vom Skript Supplemental File 1 (LUC_2025.R) im Protokollabschnitt 1 generiert wurden, in Tabelle 1 beschrieben und kann bequem mit der Baumstruktur in der Supplemental Abbildung S2 angezeigt werden.

2. ROS-Assay auf Luminolbasis

1. Versuchsaufbau für ROS-Assay
   1. Schneiden Sie Blattscheiben mit einem Durchmesser von 4 mm vom vierten bis zum siebten Blatt von 25 Tage alten Pflanzen mit einem Biopsie-Stanzer.
   2. Lassen Sie die Blattscheiben mit der behaarten Seite nach oben auf 100 μl sterilem Wasser in einer 96-Well-Platte schwimmen.
   3. Decken Sie die Platte mit sauberer Alufolie ab und stellen Sie sie über Nacht in eine LD-Wachstumskammer.
   4. Ersetzen Sie Wasser durch 100 μl Luminollösung (300 μM in 10 mM MOPS-Puffer mit pH 7,4 und 1 μM flg22 oder einem anderen Eliminator). Verwenden Sie eine simulierte Lösung anstelle von flg22 als Steuerelement.
   5. Beginnen Sie sofort mit der Aufzeichnung von Lumineszenzmesswerten im Minutentakt für 40-60 Minuten.
2. Schrittweise Erklärung der R-Analyse von ROS-Daten
   HINWEIS: Diese R-Analyse verwendet Rstudio, das R-Skript , die Ergänzende Datei 3 (ROS_2025.R) und die Eingabedateien Ergänzende Datei 4 (ROS_flg22.csv) oder Ergänzende Datei 5 (ROS_elf26.csv). Das R-Skript ist zusammen mit der Eingabedatei Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) über die Online-Repository-Plattform Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis) öffentlich verfügbar
   1. Laden Sie RStudio-Pakete herunter: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ und filesstrings¹⁷.
      HINWEIS: Die Schritte 2.2.1 müssen nur einmal ausgeführt werden. Um den Benutzern zu helfen, jede Analyse auf einen bestimmten Datensatz auf dem Computer zuzuschneiden, wurde ein Abschnitt mit der Bezeichnung "Benutzereingabe" erstellt, in dem die Benutzer bestimmte Parameter für ihre Experimente angeben können (Ergänzende Abbildung S3).
   2. Ändern Sie die Benutzereingabe I entsprechend einem bestimmten Datensatz auf einem lokalen Computer, einschließlich des Arbeitsverzeichnisses, des Namens der Eingabedatei, der Beschriftungen für die Behandlungen und der relativen Startzeit des Assays.
      1. Wählen Sie das Arbeitsverzeichnis aus. Geben Sie an, wo sich die Eingabedatei befindet. Derselbe Ordner ist der Speicherort für die Ausgabedateien.
      2. Wählen Sie die Eingabedatei aus, eine CSV-Datei, die korrekt für das R-Skript formatiert ist (Abbildung 2B). Die oberste Zeile enthält die Zeitreihe, und die erste Spalte enthält einzelne Probenpositionen auf einer 96-Well-Platte.
         HINWEIS: Ein Beispiel für eine solche CSV-Eingabedatei finden Sie im Zusatzmaterial, in der Zusatzdatei 4 (ROS_flg22.csv) oder in der Zusatzdatei 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Benennen Sie die Proben und/oder Behandlungen. Da diese Analyse für Daten aus 96-Well-Einstellungen mit einem Zeitverlauf verwendet wird, planen Sie die Experimente als 8 Replikate pro Behandlung für insgesamt bis zu 12 Behandlungen pro Platte oder als 12 Replikate pro Behandlung für insgesamt bis zu 8 Behandlungen pro Platte. Wenn es Reihen mit leeren Vertiefungen gibt, listen Sie sie einfach als solche im Feld für Behandlungsnamen auf, z. B. als leer 1, leer 2...
         HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Anzahl von Proben einzugeben, entweder 8 oder 12, da die Anzahl der Proben zählt. Wenn die Stichprobenanzahl nicht 8 oder 12 beträgt, wird der Code nicht ausgeführt. Vermeiden Sie bei Beispielnamen die Verwendung von umgekehrten Schrägstrichen oder ähnlichen Symbolen, da diese Probleme mit Dateinamen verursachen können. Vermeiden Sie auch die Verwendung von "NA" als Beschriftung, wenn Sie die ANOVA in der Benutzereingabe II auswählen. Im Gegensatz zum Skript für Supplemental File 1 (LUC_2025.R) werden Behandlungen mit demselben Namen in diesem Skript für Supplemental File 3 (ROS_2025.R) nicht in einer einzigen Gruppe zusammengefasst.
   3. Ändern Sie die Optionen für die Benutzereingabe II entsprechend den spezifischen Anforderungen des Benutzers.
      HINWEIS: Ein Beispiel für eine Benutzereingabe ist in der ergänzenden Abbildung S3 zu sehen.
      1. Verwenden Sie den ANOVA-Test mit dem Tukey HSD, um die Lumineszenzsummen der Behandlung zu vergleichen.
      2. Verwenden Sie einen zweiseitigen t-Test, um die Daten von nur zwei Behandlungen gleichzeitig zu vergleichen.
         HINWEIS: Die angezeigten p-Werte sind nicht angepasst, um Mehrfachvergleiche mit derselben Linie zu berücksichtigen.
      3. Stellen Sie die Fluoreszenzkurven und ein Balkendiagramm dar, in dem die Gesamtsumme der Fluoreszenz verglichen wird. Fügen Sie den Diagrammen die Standardabweichung oder den Standardfehler des Mittelwerts hinzu.
      4. Je nachdem, wie der Plattenleser Vertiefungen aufzeichnet, ändern Sie die Art und Weise, wie die Eingabe gelesen wird. Verwenden Sie entweder die Standarddatenauflistung der Bohrlöcher nach A1, A2, A3... oder die für Brunnen, die nach A1, B1, C1 aufgelistet sind...
3. Führen Sie die Analyse aus, indem Sie einfach auf die Schaltfläche Quelle in der oberen rechten Ecke der Konsole klicken.
   HINWEIS: Die Analyse dauert weniger als 1 Minute. Die Ausgabe der R-Analyse wird automatisch im selben Dateiordner wie das Eingabe-Dataset angezeigt.
4. Ausgabe anzeigen: Der Ausgabeordner verfügt über mehrere Dokumente und Unterordner, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen.
   HINWEIS: Für die Eingabedatei Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) ist in der ergänzenden Abbildung S4 eine Baumstruktur der Ausgabedokumente dargestellt, die vom Skript Supplemental File 3 (ROS_2025.R) generiert wurden, das in Protokollabschnitt 2 beschrieben ist.

Fallstudie 1. Der Lumineszenz-Assay für die Aktivität der zirkadianen Uhr mit Arabidopsis-Keimlingen

Wir haben bereits gezeigt, dass das Gen für das GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (GRP7) durch das Master-Clock-Protein CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) kontrolliert wird und die zirkadiane Expression von GRP7 für seine Rolle in der Pflanzenabwehr wichtig ist, indem transgene Col-0-Pflanzen verwendet wurden, die den Luciferase-Reporter unter der Kontrolle des Wildtyp-GRP7-Promotors (pGRP7wt:LUC) exprimieren.21. Wir analysierten die Aktivitäten der zirkadianen Uhr dieser transgenen Pflanzen zusammen mit der Kontrollpflanze CCA1:LUC/Col-0 unter Verwendung des R-Skripts namens LUC_2025.R (Supplemental File 1 in protocol section 1).

Die Eingabedatei mit dem Namen NO7.csv (Supplemental File 2) enthält Lumineszenzmesswerte für sieben unabhängige pGRP7wt:LUC-Leitungen und die CCA1:LUC/Col-0-Steuerung (Supplemental File 2 (NO7.csv)). Nach dem Ausführen des Skripts wird der Ausgabeunterordner NO7 output im selben Ordner wie die Eingabedatei NO7.csv (Supplemental File 2 (NO7.csv)) generiert. Die Dateien des NO7-Ausgabeordners sind in Tabelle 1 beschrieben und können bequem mit der Baumstruktur in der ergänzenden Abbildung S2 betrachtet werden. Die Werte im NO7-Ausgabeordner wurden weiterverarbeitet, um Abbildung 3 und Abbildung 4 zu erstellen. Abbildung 3 zeigt, dass der CCA1:LUC-Reporter eine Amplitude von 3.000 RLU, eine Periode von 23,5 h und eine Phase von 3,5 h zeigte. Diese Taktparameter stimmen weitgehend mit früheren Berichtenüberein 22,23. Ein anderes Expressionsmuster wurde für die pGRP7wt:Luc-Linien beobachtet. Während alle pGRP7wt:LUC-Linien in Periode und Phase ähnlich zu sein schienen, gab es Unterschiede in den Amplitudenwerten dieser Linien, wahrscheinlich aufgrund des Positionseffekts der Transgene in den Chromosomen. Diese Beobachtungen wurden weiter bestätigt, als die Perioden-, Amplituden- und Phasenparameter über das R-Skript berechnet wurden (Abbildung 4). Um diese Analyse zu validieren, wurde derselbe Datensatz mit BioDare2, einer kostenlosen Online-Plattform für die zirkadiane Datenanalyse8, erneut analysiert. Die Ergebnisse der R-Analyse waren vergleichbar mit denen des BioDare2 FFT-NLLS (NLLS)-Algorithmus 8,24 (Abbildung 4).

Fallstudie 2. Der Lumineszenz-Assay für die Aktivität der zirkadianen Uhr mit Säugetierzellen
Das R-Skript LUC_2025.R (Supplemental File 1) wurde weiterhin verwendet, um die Aktivität der zirkadianen Uhr zu analysieren, die von Säugetierzellen angezeigt wurde25. Die U2-OS-Zelllinie, die einen zirkadianen Uhrreporter exprimiert, ist eine häufig verwendete Modellzelllinie zur Messung der zirkadianen Uhrenaktivitäten von Säugetieren26,27. Wir analysierten Zeitreihendaten erneut, die mit U2-OS-Zellen erzeugt wurden, die den Per2d:Luc-Reporter exprimieren, der in einer 96-Well-Platte kultiviert wurde. Die Zellen wurden mit siRNA-Molekülen behandelt, die auf bestimmte Gene abzielen. Abbildung 5 zeigt, dass die negativen Kontrollzellen, die nicht mit siRNA behandelt wurden, eine Periode von 23,3 h, eine Phase von 2,8 h und eine Amplitude von 184,8 rlu aufwiesen. Wie erwartet, dämpfte die siRNA, die auf das CRY2-Gen abzielt, die Amplitude signifikant und beeinflusste die Periode und Phase des Reporters. Die PSMD4- und PSMD7-Gene kodieren Proteine, die Teil der 26S-Proteasomdeckelkomponente für den Proteinabbau sind. In Übereinstimmung mit dem vorherigen Bericht25 zeigt die R-Analyse, dass das Ausschalten von PSMD4 oder PSMD7 durch ihre jeweilige siRNA die Taktparameter nicht beeinflusst. Daher ist dieses R-Skript leicht auf verschiedene experimentelle Systeme für Studien zur zirkadianen Uhr anwendbar.

Fallstudie 3. Der ROS-Assay für eine Abwehrreaktion
Zusätzlich zu großen Datensätzen aus lumineszierenden zirkadianen Uhr-Assays kann das R-Skript angepasst werden, um andere Datentypen zu analysieren. Hier stellen wir eine solche Anwendung zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) vor. Es ist bekannt, dass Pflanzen verschiedene Strategien entwickelt haben, um das Eindringen von Krankheitserregern zu bekämpfen. Eine der Strategien besteht darin, Nicht-Selbstmoleküle von einem Krankheitserreger zu erkennen und anschließend die angeborene Immunantwort zu aktivieren. Eine solche frühe Immunantwort ist ein ROS-Burst, der innerhalb von Minuten auftritt, wenn ein Wirt auf ein Nicht-Selbstmolekül trifft. Ein typischer ROS-Assay wurde mit einer 96-Well-Platte durchgeführt, die 12 Blattscheiben pro Genotyp und Behandlung enthielt (Protokollabschnitt 2). Hier wurden zwei gemeinsame Elikatormoleküle, flg22, ein 22-Aminosäure-Peptid, das aus der konservierten Region der bakteriellen Flagellin-Proteine28 gewonnen wurde, und elf26, ein 26-Aminosäure-Peptid aus dem Elongationsfaktor Tu-Protein29, verwendet, um einen ROS-Burst zu induzieren. Das Skript, Supplemental File 3 (ROS_2025.R), wurde für die Datenanalyse von ROS entwickelt. Zwei CVS-Dateien aus ROS-Assays, Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) und Supplemental File 5 (ROS_elf26.csv), die in das Format der R-Analyse konvertiert wurden, können im Abschnitt Ergänzendes Material heruntergeladen werden. Nach der R-Analyse müssen die Ausgabeordner in demselben Ordner wie jede Eingabedatei auf dem eigenen Computer generiert werden, der die ROS-Burst-Kurven und die Gesamt-ROS-Werte während der Assay-Zeit sowie statistische Analysen enthält (Ergänzende Abbildung S4). Die Daten wurden weiterverarbeitet, um Abbildung 6 zu erstellen. Die hier gezeigten Ergebnisse ähneln den veröffentlichten, die manuell verarbeitet wurden30.

Abbildung 1: Flussdiagramm des Luciferase-Assays für die R-Analyse. Sämlinge, die einen Luciferase-Reporter exprimierten, der von einem Uhrenpromotor angetrieben wurde, wurden sterilisiert und 4 Tage lang auf 1/2 MS-Medium in LD gezüchtet. Die Sämlinge wurden auf 96-Well-Platten mit 180 μl 1/2 MS-Medium mit D-Luciferin umgefüllt. Jede Vertiefung enthielt einen Setzling. Nach 1 Tag bei LD, gefolgt von 1 Tag bei LL, wurde die Lumineszenz mit einem Plattenleser aufgezeichnet. Die Sämlinge auf einer Platte wurden typischerweise 5-7 Tage lang in 1-stündigen Abständen auf Lumineszenz in LL aufgezeichnet. Nach der Aufnahme wurden Platten fotografiert, um das Wachstum der Sämlinge zu beurteilen, und die Rohdaten wurden als CSV-Datei für die R-Analyse gespeichert. Abkürzungen: LD = 12 h hell/12 h dunkel; LL = konstantes Licht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Flussdiagramm der Lumineszenzdatenerfassung und R-Analyse. (A) Es wird ein fünfstufiges Verfahren für die Analyse der zirkadianen Uhr mit dem R-Skript beschrieben. Schritt 1. Richten Sie Experimente mit entweder 8 oder 12 Sämlingen pro Genotyp und/oder pro Behandlung ein; Schritt 2. Aufzeichnung der Lumineszenz in LL in 1-Stunden-Intervallen für 5-7 Tage; Schritt 3. Abrufen und Formatieren von Daten in einer CSV-Datei; Schritt 4. Analysieren von Daten mit R; und Schritt 5. Anzeigen von Ausgabedaten. Die Startzeit für die Aufzeichnung kann jederzeit sein. Da das R-Skript jedoch nur ganze Zahlen (ganze Zahlen) akzeptiert, müssen die Aufzeichnungsintervalle eine ganze Zahl sein. (B) Screenshot einer Eingabe-CSV-Datei, die korrekt für das R-Skript formatiert ist. Die ursprüngliche Eingabedatei NO7.csv finden Sie in der Zusatzdatei 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zirkadiane Expression von pGRP7wt:LUC in transgenen Pflanzen. Lumineszenzspuren von pGRP7wt:LUC sind dargestellt. Die Balken unter der x-Achse zeigen subjektiven Tag (offene Balken) und Nacht (graue Balken) an. Die Lumineszenzspur jedes Genotyps beträgt durchschnittlich 12 Replikate. Fehlerbalken wurden aufgrund der großen Anzahl von Kurven nicht angezeigt. Abkürzung: RLU = Relative Lumineszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ein Vergleich der Ausgabedaten des R-Skripts und BioDare2. Derselbe Datensatz, der in Abbildung 3 gezeigt wird, wurde mit dem R-Skript und von BioDare2 für die Parameter der zirkadianen Uhr, Amplitude, Periode und Phase analysiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n=12). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Proben hin (P < 0,05; Einseitige ANOVA mit post-hoc Tukey's HSD-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Analyse der Aktivität der zirkadianen Uhr mit Säugetierzellen. Zeitreihendaten, die mit U2-OS-Zellen erzeugt wurden, die den Per2dLuc-Reporter exprimieren, kultiviert auf einer 96-Well-Platte in DD, wurden zuvor beschrieben 25. siRNA-Moleküle, die auf CRY2, PSMD4 oder PSMD7 abzielen, wurden zur Behandlung der Zellen verwendet. ( A) Lumineszenz-Spuren. ( b) Amplitude, Periode und Phase von Per2d:Luc. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3). Unterschiedliche Buchstaben in Panel ( B) weisen auf einen signifikanten Unterschied zwischen der Negativkontrolle und einer siRNA-behandelten Probe hin (P<0,05; Einseitige ANOVA mit post-hoc Tukey's HSD-Test). Abkürzung: RLU = relative Lumineszenzeinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: ROS-Burst-Analyse von R. Die Sämlinge wurden unmittelbar nach der Behandlung mit 1 μM flg22 (links) oder 1 μM elf26 (rechts) auf die relative Lumineszenzeinheit untersucht. ( A) Lumineszenzspuren, gemittelt von 12 Sämlingen pro Genotyp (n = 12) in einem Zeitverlauf nach der Erhebung. Die Durchschnittswerte pro Genotyp und Behandlung sind Teil des R-Outputs. ( B) Gemittelte Gesamtlumineszenzzahlen für jeden Genotyp mit entweder flg22- oder elf26-Behandlung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 12). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Proben hin (P < 0,05; Einseitige ANOVA mit post-hoc Tukey's HSD-Test). Abkürzung: RLU = relative Lumineszenzeinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Eine Liste der Ausgabedokumente der R-Analyse. Dies ist eine Liste der Ausgabedokumente, die vom Skript LUC_2025.R (Ergänzende Datei 1) und der Eingabedatei NO7.csv (Ergänzende Datei 2) generiert wurden.

Ergänzende Abbildung S1: Screenshots für Eingang I und Eingang II im Protokollabschnitt 1. Benutzereingabe Ich muss geändert werden, um die Analyse auf ein bestimmtes Dataset auf einem lokalen Computer zuzuschneiden. Änderungen an der Benutzereingabe II sind je nach experimenteller Einstellung optional. Es ist wichtig zu beachten, dass das Skript für ergänzende Datei 1 (LUC_2025.R) davon ausgeht, dass alle Wells in der Datei vorhanden sind und nicht nur ausgewählte oder verwendete Wells. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Baumstruktur für die Ausgabedokumente. Diese Ausgabe wurde mithilfe des Skripts LUC_2025.R (Ergänzende Datei 1) und der Eingabedatei NO7.csv (Ergänzende Datei 2) generiert. Das LUC_2025.R-Skript generiert einen Ausgabeordner basierend auf dem Namen der Eingabedatei. Weitere Informationen zu den Ausgabedateien finden Sie in Tabelle 1. Felder stellen Dateiordner dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Screenshots für Benutzereingabe I und Benutzereingabe II im Protokollabschnitt 2. Das Skript für Supplemental File 3 (ROS_2025.R) verwendet das gleiche allgemeine Eingabeformat wie das Skript für Supplemental File 1 (LUC_2025.R). Benutzereingabe Ich muss geändert werden, um die Analyse auf ein bestimmtes Dataset auf einem lokalen Computer zuzuschneiden. Änderungen an der Benutzereingabe II sind je nach experimenteller Einstellung optional. Es ist wichtig zu beachten, dass das Skript für Supplemental File 3 (ROS_2025.R) davon ausgeht, dass alle Wells in der Datei vorhanden sind und nicht nur ausgewählte oder verwendete Wells. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Baumstruktur für die Ausgabedokumente. Diese Ausgabe wurde unter Verwendung des Skripts ROS_2025.R (Ergänzende Datei 3) und der Eingabedatei ROS_flg22.csv (Ergänzende Datei 4) generiert. Das ROS_2025.R-Skript generiert einen Ausgabeordner basierend auf dem Namen der Eingabedatei. In diesem Ordner befindet sich eine Datei für die Gesamtanzahl der ROS und eine Datei für Diagramme. Es gibt auch Unterordner für PRISM und grafische Daten, den ANOVA-Test und die t-Tests. Felder stellen Dateiordner dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Eine Liste der verfügbaren Bioinformatik-Tools für die zirkadiane Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1: LUC_2025.R. Dies ist das R-Skript, das für die Analyse von Daten der zirkadianen Uhr verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2: NO7.csv. Dies ist die Eingabedatei, die ein Beispiel für Daten der zirkadianen Uhr enthält. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3: ROS_2025.R. Dies ist das R-Skript, das für die Analyse von ROS-Daten verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 4: ROS_fig22.csv. Dies ist die Eingabedatei, die ein Beispiel für ROS-Daten enthält. ROS wurde durch eine Behandlung mit 1 μM flg22 induziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 5: ROS_elf26.csv. Dies ist die Eingabedatei, die ein Beispiel für ROS-Daten enthält. ROS wurde durch eine Behandlung mit 1 μM elf26 induziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.