Methodenartikel

Bewertung der Wirkung von SASP-Faktoren auf die Proliferation von Krebszellen anhand einer vergleichenden Analyse von drei verschiedenen Methoden

DOI:

10.3791/68883

⸱

19. September 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie werden die proliferativen Effekte von Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotypfaktoren (SASP) von seneszenten HeLa-Zellen auf nicht-seneszente HeLa-Zellen unter Verwendung von drei in vitro-Modellen mit Echtzeit-Monitoring untersucht. Die Vorteile und Grenzen der einzelnen Methoden wurden systematisch verglichen, um die Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Krebs besser zu verstehen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemotherapie-induzierte seneszente Krebszellen sezernieren auch verschiedene Faktoren, die als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp bezeichnet werden, um ihre extrazelluläre Mikroumgebung zu regulieren. Frühere Studien haben berichtet, dass diese SASP-Faktoren nachteilige parakrine Wirkungen auf die umgebenden Zellen ausüben, einschließlich der Förderung der Proliferation, des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), der Angiogenese und der Migration. Verschiedene In-vitro-Co-Kulturtechniken werden häufig eingesetzt, um die zellulären Prozesse zu verstehen, die sich aus der Interaktion ergeben, indem gleiche und verschiedene Zelltypen zusammen kultiviert werden. In dieser Arbeit wurden die potentiellen proliferativen Effekte von SASP-Faktoren, die von seneszenten HeLa-Zellen sezerniert werden, auf nicht-seneszente HeLa-Zellen mit drei komplementären in vitro-Ansätzen untersucht. Der erste Ansatz beinhaltete die Co-Kultivierung von seneszenten und nicht-seneszenten Zellen, um die durch den SASP vermittelte parakrine Signalübertragung zu untersuchen. Im zweiten Ansatz wurden konditionierte Medien, die von seneszenten Krebszellen gesammelt wurden, konzentriert und anschließend verwendet, um die Auswirkungen der konditionierten Medien mit Echtzeitüberwachung der Proliferation zu untersuchen. In der dritten Methode wurden seneszente und nicht-seneszente Zellen nebeneinander kultiviert, um die juxtacrinen Effekte von SASP durch direkten Zell-zu-Zell-Kontakt zu bewerten. Alle drei experimentellen Modelle zeigten übereinstimmend, dass SASP-Faktoren die Proliferation von nicht-seneszenten Krebszellen signifikant verstärkten. Bemerkenswert ist, dass die Co-Kultur seneszenter Zellen die Proliferationsrate um 64,6 % erhöhte, und 3x konzentrierte SASP-konditionierte Medien die Proliferation um über 50 % im Vergleich zu Kontrollen erhöhten. Die fluoreszenzbasierte Bildgebung zeigte einen Anstieg der GFP-positiven Zellzahlen um 49,3% unter juxtacrinen Bedingungen. Diese Methoden ermöglichten zusammen eine quantitative und qualitative Bewertung von SASP-induzierten proliferativen Veränderungen. Die vergleichende Analyse dieser Ansätze zeigt ihre jeweiligen Stärken und Grenzen auf und liefert wertvolle Einblicke in die parakrine Wirkung seneszenter Zellen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In mehrzelligen Organismen kommunizieren Zellen über parakrine und juxtacrine Signale, indem sie Nachrichten mit ihrer Mikroumgebung austauschen und sich so gegenseitig beeinflussen. Diese Kommunikation kann entweder direkt durch das Tunneln von Nanoröhren und Gap Junctions oder indirekt durch die Sekretion löslicher chemischer Moleküle wie Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine in die extrazelluläre Matrix erfolgen. Diese Signalmechanismen spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung verschiedener physiologischer Prozesse, einschließlich der Gewebeentwicklung und der Immunzellreaktionen, und sind auch an der Pathogenese zahlreicher Krankheiten wie Krebs, HIV, Bluthochdruck und Alzheimer beteiligt1.

In den 1960er Jahren entdeckte Leonard Hayflick, dass normale menschliche Fibroblasten eine begrenzte Fähigkeit haben, sich in vitrozu replizieren 2. Dieser begrenzte Zellproliferationszustand, der sich aufgrund der Telomeraseverkürzung entwickelt, wird als replikative Seneszenz bezeichnet. Nachfolgende Studien zeigten, dass verschiedene Formen von zellulärem Stress auch zelluläre Seneszenz auslösen können. Es wurde festgestellt, dass gängige Krebsbehandlungen wie Chemotherapie und Strahlentherapie sowohl bei Krebs- als auch bei Stromazellen eine zelluläre Seneszenz induzieren, die als therapieinduzierte Seneszenz bezeichnet wird 3,4. Zelluläre Seneszenz und Alterung sind hierarchisch miteinander verbundene Prozesse; Sie repräsentieren unterschiedliche biologische Prozesse. Die Anhäufung von seneszenten Zellen im Organismus trägt zum Altern bei, indem sie Entzündungen, Gewebefunktionsstörungen und die Entwicklung altersbedingter Krankheiten fördert. Das Altern umfasst jedoch im Vergleich zur Seneszenz 5 ein viel breiteres Spektrum an systemischen Ereignissen undMechanismen.

Seneszente Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass ihr erweitertes Zytoplasma im Vergleich zu normalen Zellen deutlich größer ist und eine abgeflachte Morphologie aufweist6. Diese seneszenten Zellen haben eine erhöhte lysosomale Aktivität und sind positiv für die Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal)-Aktivität, ein lysosomales Enzym, das auch bei saurem pH-Wert von 6,0 aktiv bleibt. Die SA-β-Gal-Färbung ist der am weitesten verbreitete Biomarker zum Nachweis seneszenter Zellen7. Vergrößerung und unregelmäßige Morphologie der Zellkerne werden häufig bei Zellen beobachtet, die sich in der Seneszenz befinden. Darüber hinaus zeichnen sich diese Zellen durch einzigartige Chromatin-Rearrangements aus, die als Seneszenz-assoziierte heterochromatische Foci (SAHF) bezeichnet werden und einen irreversiblen Zellzyklusarrest vermitteln 8,9.

Obwohl seneszente Krebszellen letztendlich ihre Fähigkeit zur Vermehrung verloren, blieben sie lebensfähig und metabolisch aktiv. Es ist bekannt, dass seneszente Zellen auch verschiedene Faktoren sezernieren, um ihre extrazelluläre Tumormikroumgebung zu regulieren, die als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bezeichnet wird10,11. Zu diesen SASP-Faktoren gehören lösliche Signalfaktoren (Interleukine, Chemokine und Wachstumsfaktoren), sezernierte Proteasen und sezernierte unlösliche Proteine/Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM). Zusammengenommen üben diese Faktoren nachteilige parakrine Wirkungen aus, einschließlich der Förderung der Proliferation von Krebszellen, der Migration, der Invasion und der Induktion des Übergangs von Epithel zu Mesenchym (EMT)4,12. Darüber hinaus wurden Chemotherapie-induzierte Nebenwirkungen teilweise auf die Akkumulation seneszenter Zellen zurückgeführt13. Daher ist die Untersuchung der Interaktion zwischen seneszenten und nicht-seneszenten Zellen zu einem wichtigen Forschungsgebiet im Rahmen der Krebstherapie geworden. Insbesondere die Analyse von SASP-Faktoren, insbesondere ihrer Zusammensetzung und der Auswirkungen auf die Krebsmikroumgebung, gilt als vielversprechende Strategie, um neue Zielmoleküle für die Krebstherapie zu identifizieren und neue Medikamente für diese Moleküle zu entdecken.

In-vitro-Co-Kulturtechniken werden seit langem eingesetzt, um das Verständnis von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen14. In diesem methodischen Artikel ging es darum, die mögliche proliferative Aktivität von Faktoren, die von seneszenten Zellen sezerniert werden, auf nicht-seneszente Krebszellen mit drei verschiedenen Methoden zu evaluieren. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der drei verschiedenen Methoden verglichen und die jeweiligen Vor- und Nachteile der Ansätze kritisch bewertet.

Zunächst wurde ein Co-Kulturmodell zwischen seneszenten HeLa- und nicht-seneszenten HeLa-Zellen aufgebaut, um die möglichen Veränderungen der Krebszellproliferation in Echtzeit mit dem Echtzeit-Zellanalysesystem12 zu überwachen. Dieses System besteht aus zwei Platten zur Bewertung von Zell-Zell-Interaktionen. Die E-Plattenansicht, die die untere Schicht bildet, hat eine Oberfläche, auf der die Zielzellen ausgesät werden, wobei Mikroelektroden am unteren Rand der Platte positioniert sind. Der elektrische Widerstand, der durch die Adhäsion der Zielzellen an dieser Oberfläche entsteht, wird durch den messbaren Parameter Cell Index (CI) ausgedrückt. Der CI-Wert ist proportional zur Anzahl der Zellen und zum Grad der Adhäsion an der Oberfläche15. Darüber hinaus ermöglicht die E-Plate-Ansicht die morphologische Untersuchung von Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop. Der E-Platten-Einsatz, der die obere Schicht bildet, ist der Bereich, in dem Effektorzellen ausgesät werden. Der Boden dieser Platte ist mit einer semipermeablen Membran mit einer Porengröße von 0,4 μm bedeckt. Faktoren, die von Effektorzellen sezerniert werden, können die Membran passieren und die Zielzellen in der e-Plattenansicht beeinflussen. Regt dieses Zusammenspiel die Zellproliferation an, wird dies als Erhöhung des CI-Wertes beobachtet. So können Wechselwirkungen zwischen Zellen quantitativ ausgewertet werden.

Bei der zweiten Methode wurden konditionierte Medien, die aus seneszenten HeLa-Zellen entnommen wurden, konzentriert und zu nicht-seneszenten HeLa-Zellen hinzugefügt. Die potentielle proliferative Wirkung auf diese Zellen wurde mit Hilfe des Echtzeit-Zellanalysesystems überwacht.

Bei der dritten Methode war geplant, die seneszenten HeLa-Zellen und die nicht-seneszenten GFP-HeLa-Zellen direkt in 2D zu co-kultivieren und die möglichen proliferativen Veränderungen in Krebszellen in Echtzeit unter dem Mikroskop zu überwachen.

Das Ziel dieses Experiments ist es, drei Modelle aufzubauen, um die Interaktion zwischen seneszenten HeLa-Zellen und nicht-seneszenten HeLa-Zellen zu untersuchen und mögliche Veränderungen in der Proliferation von Krebszellen in Echtzeit zu überwachen. So kann die Wirkung von SASP-Faktoren, die von seneszenten Krebszellen sezerniert werden, auf die anderen Krebszellen leicht untersucht werden. Dementsprechend wurden die Vorteile und Grenzen der drei Ansätze systematisch evaluiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren wurden unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe II+ (BSL2+) in einer zertifizierten Sicherheitswerkbank durchgeführt. Doxorubicin ist ein gefährliches Chemotherapeutikum. Alle Verfahren müssen in einem zertifizierten Schrank der Biosicherheitsstufe II+ (BSL2+) unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel und Handschuhe, durchgeführt werden. Alle Doxorubicin-haltigen Abfälle, einschließlich Medien und Fixiermittel, sollten in dafür vorgesehenen und deutlich gekennzeichneten Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und über das institutionelle Entsorgungssystem für gefährliche Abfälle entsorgt werden.

1. Modell 1: Co-Kultivierung mit dem Echtzeit-Zellanalysesystem

  1. Kultivierung von Zellen und Induktion der Seneszenz (Tag 1-2)
    1. 8 x 105 HeLa-Zellen werden in einen T25-Kulturkolben mit 5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) gesät, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
    2. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium der Zellen durch 5 ml frisches vollständiges Medium. Behandeln Sie die Zellen direkt mit 300 nM Doxorubicin, indem Sie es in das Medium geben, um die zelluläre Seneszenz zu induzieren. Der T25-Kolben wird 72 h lang in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C aufbewahrt.
  2. Aussaat von nicht-seneszenten Zellen (Tag 4)
    1. 8 x 105 unbehandelte HeLa-Zellen (nicht seneszente Kontrolle) in einem neuen T25-Kolben in 5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahren.
  3. Bestätigung der Induktion der Seneszenz (Tag 5)
    1. Um festzustellen, ob 72 Stunden Doxorubicin-Behandlung Seneszenz induzierten, führen Sie eine SA-β-Gal-Färbungdurch 6. Dieser Assay wird an einem separaten Satz von Zellen durchgeführt, die in den Hauptversuchen nicht verwendet wurden. Zu den erzielten Ergebnissen siehe Abbildung 1A,B.
    2. Messen Sie IL-6 in den konditionierten Medien von seneszenten Krebs-HeLa-Zellen, um ihre sekretorische Aktivität zu bewerten. Behandeln Sie die Zellen 72 Stunden lang mit Doxorubicin, gefolgt von einer Inkubation in serumfreiem und phenolrotfreiem Medium für weitere 2 Tage. Normalisieren Sie das gesammelte konditionierte Medium auf die Zellzahl und messen Sie die IL-6-Spiegel.
      HINWEIS: IL-6 ist ein charakteristisches Zytokin von SASP12. Die Ergebnisse der IL-6-Messung sind in Abbildung 1C dargestellt.
  4. Einrichtung des Echtzeit-Zellanalysesystems (Tag 5)
    1. Schalten Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem vor dem Aussaaten der Zellen ein. Starten Sie die RTCA-Software 2.0. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exp Notes (Exp Notes ) (Abbildung 2), und geben Sie die experimentellen Details ein.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan , und fügen Sie zwei Schritte hinzu. Der erste Schritt betrifft den Hintergrund. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellproliferation alle 15 Minuten für 72 Stunden zu überwachen.
    3. Wählen Sie den ersten Schritt und klicken Sie auf Wiedergabe , um die Hintergrundimpedanz aufzuzeichnen, indem Sie 50 μl vollständiges Medium zu jedem Well der E-Plate-Ansicht hinzufügen.
  5. Aussaat von Zellen in die e-plate-Ansicht (Tag 5)
    1. Überprüfen Sie sowohl mit Doxorubicin behandelte (seneszente) als auch unbehandelte (nicht seneszente) HeLa-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher Vergrößerung, bevor Sie die Zellen aussäen. Unter dem Mikroskop haben seneszente Zellen eine viel vergrößertere Morphologie als normale Zellen.
    2. Waschen Sie sowohl die seneszenten als auch die nicht seneszenten HeLa-Zellen mit 5 ml sterilem, vorgewärmtem PBS und aspirieren Sie dann.
    3. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin hinzu und halten Sie die Kolben 2 Minuten lang bei 37 °C, um Zellen abzulösen. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500 x g bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    5. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode unter Verwendung eines Hämozytometers.
    6. Nicht-seneszente HeLa-Zellen mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/Well in jeder Vertiefung einer E-Plate-Ansicht in vollständiger 100 μl DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) aussäen.
    7. Platzieren Sie die E-Plate-Ansicht in der Halterung des Echtzeit-Zellanalysesystems, damit sich die Zellen an der Plattenoberfläche im Inkubator anheften können.
    8. Wählen Sie den zweiten Schritt auf der Zeitplanschaltfläche und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe , um die Impedanzmessung mit der RTCA-Software 2.0 für 72 Stunden zu starten (Abbildung 2).
  6. Säen von Zellen in den E-Platten-Einsatz
    1. Die Samenzellen in einer E-Platte werden in 60 μl vollständiges DMEM eingesetzt, das mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) ergänzt wird.
    2. Seed-Zellen auf die E-Plate werden unter drei verschiedenen Versuchsaufbauten eingesetzt: Gruppe 1 (Negativkontrolle): Keine Zellen ausgesät (nur Medien)
      Gruppe 2: 2 × 104 nicht-seneszente HeLa-Zellen
      Gruppe 3: 1 × 105 seneszente HeLa-Zellen
    3. Halten Sie den Einsatz der E-Platte bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 für 6 h zur Befestigung.
  7. Co-Kultivierung von Zellen
    1. Klicken Sie nach 6 Stunden nach dem Cell Seeding auf Pause . Aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig aus jeder Vertiefung der E-Plattenansicht, um Serum und nicht adhärente Zellen zu entfernen.
    2. Waschen Sie die Vertiefungen 2x mit vorgewärmtem PBS bei 37 °C. Geben Sie 140 μl serumfreies DMEM in jede Vertiefung der E-Plate-Ansicht.
    3. Nehmen Sie den E-Plate-Einsatz und aspirieren Sie das Nährmedium. Waschen Sie die Vertiefungen 2x schonend mit PBS bei 37 °C und fügen Sie 60 μl serumfreies DMEM hinzu.
    4. Positionieren Sie den E-Plate-Einsatz in der E-Plate-Ansicht und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, bis der Einsatz vollständig in der Vertiefung sitzt.
    5. Legen Sie die kombinierte Platte in das Echtzeit-Zellanalysesystem ein, und klicken Sie auf Play , um die Echtzeitüberwachung der Zellindexwerte in 15-Minuten-Intervallen mit der Software fortzusetzen (Abbildung 2).
    6. Schalten Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem aus, wenn die Experimentierzeit abgelaufen ist (Abbildung 3A).
  8. Bildgebende Zellen auf E-Platteneinsatz
    HINWEIS: Da sich in der Vertiefung des Einsatzes der e-plate eine Membran befindet, können die hier ausgesäten Zellen nicht mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie auf der Membran sichtbar gemacht werden. Um zu testen, ob die Zellen bis zum Ende des Experiments lebensfähig blieben und ob die seneszenten Zellen ihre strukturelle Integrität behielten, wurden sie daher mit DAPI gefärbt (Abbildung 3B).
    1. Entfernen Sie den E-Plate-Einsatz aus der E-Plate-Ansicht. Färben Sie die Zellen im E-Platten-Einsatz mit DAPI und überprüfen Sie das Vorhandensein von Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop16. Es ist bekannt, dass die Zellkerne seneszenter Zellen größer sind als die von normalen Zellen. Bestimmen Sie daher anhand der Kerngrößen der mit DAPI gefärbten Zellen, welche Vertiefung mit nicht-seneszenten und welche mit seneszenten Zellen besiedelt wurde.
  9. Bildgebende Zellen in der E-Plate-Ansicht
    1. Untersuchen Sie die Ansicht der E-Platte direkt unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher Vergrößerung (Abbildung 3B). Da in der E-Plattenansicht vier Reihen von Mikroelektrodensensoren aus der Mitte jeder Vertiefung entfernt wurden, wurde Platz 6 geschaffen, um die Zellüberwachung durch Mikroskopie zu ermöglichen.
  10. Datenanalyse
    1. Normalisieren Sie die CI-Werte zu dem Zeitpunkt, zu dem die E-Plate-Ansicht und die E-Plate-Einfügung kombiniert und in das Echtzeit-Zellenanalysesystem eingefügt werden.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datenanalyse, um die Proliferationsrate und -menge anhand des maximalen Zellindex und der Steigungsdaten zu berechnen, die aus dem Echtzeit-Zellanalysesystem erhalten wurden (Abbildung 2). Analysieren Sie dann die Daten mit einem geeigneten Statistikprogramm (Abbildung 3C,D).

2. Modell 2: Assay zur Behandlung konditionierter Medien unter Verwendung des Echtzeit-Zellanalysesystems

  1. Kultivierung von Zellen und Induktion der Seneszenz (Tag 1-2)
    1. 35 x 104 HeLa-Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) säen, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) und Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren.
    2. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium der Zellen durch 2,5 ml frisches vollständiges Medium. Behandeln Sie die Zellen direkt mit 300 nM Doxorubicin, indem Sie es dem Medium hinzufügen, um die zelluläre Seneszenz zu induzieren. Die 6-Well-Platte wird in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C für 72 h aufbewahrt.
  2. Aussaat von nicht-seneszenten Zellen (Tag 4)
    1. 35 x 104 unbehandelte HeLa-Zellen (nicht seneszente Kontrolle) in jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte in 2,5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahren.
  3. Die Bestätigung der Induktion der Seneszenz ist wie in Schritt 1.3 beschrieben durchzuführen.
  4. Herstellung von konditioniertem Medium aus seneszenten und nicht-seneszenten HeLa-Zellen
    1. Überprüfen Sie sowohl mit Doxorubicin behandelte Zellen (seneszente Zellen) als auch unbehandelte HeLa-Zellen (nicht seneszente Zellen) unter einem Phasenkontrastmikroskop. Unter dem Mikroskop haben seneszente Zellen eine viel vergrößertere Morphologie als normale Zellen.
    2. Aspirieren Sie das Kulturmedium von beiden 6-Well-Platten (seneszente und nicht-seneszente HeLa-Zellen). Waschen Sie die Zellen 2x mit vorgewärmtem PBS bei 37 °C, um Serumreste und Zelltrümmer zu entfernen.
    3. Geben Sie 2 ml serumfreies DMEM, ergänzt mit Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 für 48 h.
  5. Sammeln und Konzentrieren von konditionierten Medien (Tag 7)
    1. Sammeln Sie die konditionierten Medien aus jeder Vertiefung in sterilen Röhrchen in einer laminaren Sicherheitskabine.
    2. Trypsinisieren Sie die Zellen und zählen Sie die Zellen mit der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode unter Verwendung eines Hämozytometers, um konditionierte Medien auf Zellzahlen zu normalisieren.
    3. Stellen Sie das konditionierte Medium, normiert nach Zellzahl, auf ein Endvolumen von 2 ml mit serumfreiem DMEM ein, das mit Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) in sterilen 2-ml-Röhrchen ergänzt wird.
    4. Das gesammelte konditionierte Medium wird bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C, um den geklärten Überstand zu erhalten.
    5. Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium mit 2-ml-Ultrazentrifugalfiltereinheiten bei 4 °C für 60 min bei 3.000 x g , um es zu konzentrieren. Bei diesem Verfahren werden die konditionierten Medien mit 2 mL auf das 5-fache der konzentrierten 400 μl konditionierten Medien konzentriert.
    6. Verdünnen Sie die erhaltenen 40 μl konditionierten Medien mit frischem serumfreiem Medium, um 1x, 2x und 3x konzentrierte konditionierte Medien in sterilen Röhrchen in einer laminaren Sicherheitskabine herzustellen.
      HINWEIS: Da das Medium, das 48 Stunden lang auf den Zellen verbleibt, aufgrund des zellulären Verbrauchs erschöpft ist, werden die gesammelten und konzentrierten konditionierten Medien anschließend mit neuem Medium verdünnt.
  6. Seeding von Zellen in die E-Plate-Ansicht
    1. Richten Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem wie in den Schritten 1.1 bis 1.4 beschrieben ein.Waschen Sie nicht seneszente HeLa-Zellen mit vorgewärmtem PBS und aspirieren Sie dann.
    2. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin hinzu und halten Sie die Kolben 2 Minuten lang bei 37 °C, um Zellen abzulösen. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500 x g bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    4. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode unter Verwendung eines Hämozytometers.
    5. Nicht seneszente HeLa-Zellen mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/Well in jeder Vertiefung einer E-Plattenansicht in 200 μl vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    6. Platzieren Sie die E-Plate-Ansicht in der Halterung des Echtzeit-Zellanalysesystems, damit sich die Zellen an der Plattenoberfläche im Inkubator anheften können.
    7. Wählen Sie den zweiten Schritt auf der Zeitplanschaltfläche aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Play, um die Impedanzmessung mit der RTCA-Software 2.0 zu starten (Abbildung 2). Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Pause, nachdem Sie 6 Stunden lang nicht-seneszente HeLa-Zellen plattiert haben (Abbildung 2).
    8. Aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig aus jeder Vertiefung der E-Plattenansicht, um Serum und nicht adhärente Zellen zu entfernen. Die Vertiefungen 2x mit vorgewärmtem PBS bei 37 °C waschen.
    9. Das vorgewärmte konditionierte Medium auf 37 °C in die entsprechenden Gruppen einteilen:
      Gruppe 1: Frische Medien
      Gruppe 2: 1x nicht-seneszentes HeLa-Zell-konditioniertes Medium
      Gruppe 3: 2x nicht-seneszente HeLa-Zell-konditionierte Medien
      Gruppe 4: 3x nicht-seneszente HeLa-Zell-konditionierte Medien
      Gruppe 5: 1x seneszente HeLa-Zell-konditionierte Medien
      Gruppe 6: 2x seneszente HeLa-Zell-konditionierte Medien
      Gruppe 7: 3x seneszente HeLa-Zell-konditionierte Medien
    10. Fügen Sie die E-Plate-Ansicht in das Echtzeit-Zellanalysesystem ein und klicken Sie auf Play , um die Echtzeitüberwachung der Zellindexwerte in 15-Minuten-Intervallen für 48 Stunden fortzusetzen (Abbildung 2).
    11. Schalten Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem aus, wenn die Experimentierzeit abgelaufen ist (Abbildung 4A).
  7. Bildgebende Zellen in der E-Plate-Ansicht
    1. Untersuchen Sie die E-Plate-Ansicht direkt unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 10-facher Vergrößerung (Abbildung 4B). Da in der E-Plattenansicht vier Reihen von Mikroelektrodensensoren aus der Mitte jedes Wells entfernt wurden, wurde Platz geschaffen, um ein Zellmonitoring per Mikroskopie zu ermöglichen.
  8. Datenanalyse
    1. Normalisieren Sie die CI-Werte zu dem Zeitpunkt, zu dem die konzentrierten konditionierten Medien den nicht-seneszenten HeLa-Zellen verabreicht wurden.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datenanalyse, um die Proliferationsrate und -menge anhand des maximalen Zellindex und der Steigungsdaten zu berechnen, die aus dem Echtzeit-Zellanalysesystem erhalten wurden (Abbildung 2). Analysieren Sie dann die Daten mit einem geeigneten Statistikprogramm (Abbildung 4C,D).

3. Modell 3: Echtzeit-Überwachung der Zell-Zell-Interaktion

  1. Kultivierung von Zellen und Induktion der Seneszenz (Tag 1-2)
    1. 8 x 105 HeLa-Zellen werden in einen T25-Kulturkolben mit 5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) gesät, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
    2. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium der Zellen durch 5 ml frisches vollständiges Medium. Behandeln Sie die Zellen direkt mit 300 nM Doxorubicin, indem Sie es in das Medium geben, um die zelluläre Seneszenz zu induzieren. Der T25-Kolben wird 72 h lang in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C aufbewahrt.
  2. Aussaat von nicht-seneszenten Zellen (Tag 4)
    1. 8 x 105 GFP-HeLa-Zellen (nicht-seneszente Kontrolle) in einem neuen T25-Kolben in 5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahren.
    2. 8 x 105 HeLa-Zellen (nicht seneszente Kontrolle) in einem neuen T25-Kolben in 5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahren.
  3. Führen Sie die Bestätigung der Induktion der Seneszenz durch, wie in Schritt 1.3 (Tag 5) beschrieben.
  4. Co-Kultivierung von Zellen
    1. Überprüfen Sie mit Doxorubicin behandelte Zellen, unbehandelte GFP-HeLa- und unbehandelte HeLa-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, bevor Sie Zellen aussäen. Unter dem Mikroskop haben seneszente Zellen eine viel vergrößertere Morphologie als normale Zellen.
    2. Waschen Sie alle drei T25-Kolben mit 5 ml sterilem, vorgewärmtem PBS und aspirieren Sie dann. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin hinzu und halten Sie die Kolben 2 Minuten lang bei 37 °C, um Zellen abzulösen.
    3. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500 x g bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 5 ml vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    5. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode unter Verwendung eines Hämozytometers. Samenzellen in 200 μl vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml).
    6. Keimzellen auf μ-Objektträger 8-Well hoch unter drei verschiedenen Versuchsaufbauten:
      Gruppe 1: 7 x 103 GFP-HeLa-Zellen
      Gruppe 2: 18 x 103 nicht-seneszente HeLa-Zellen + 7 x 103 GFP-HeLa-Zellen
      Gruppe 3: 18 x 103 seneszente HeLa-Zellen + 7 x 103 GFP-HeLa-Zellen
    7. Halten Sie den μ-Objektträger für die Befestigung 8 h lang bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2. Waschen Sie die Zellen nach 8 Stunden 2x mit vorgewärmtem PBS (37 °C), um die Wirkung des Serums auf die Zellen zu beseitigen.
    8. Geben Sie 200 μl serumfreies DMEM, das Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (0,1 μg/ml) enthält, in jede Vertiefung.
  5. Aufbau des Mikroskops
    1. Schalten Sie den Temperaturregler und den CO2-Regler ein und lassen Sie das Inkubationssystem auf der Bühne 30 Minuten lang stabilisieren.
    2. Überprüfen Sie die CO2 -Konzentration und die Temperatureinstellungen manuell und stellen Sie sicher, dass die physiologischen Bedingungen (5 % CO2, 37 °C) erreicht werden.
    3. Schalten Sie das inverse Fluoreszenzmikroskop ein und lassen Sie das System die Selbstkalibrierung abschließen. Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle ein. Starten Sie die Bildgebungs- und Analysesoftware, um die Bildgebungsparameter und die Bildaufnahme zu steuern.
  6. Zeitraffer-Bildgebung
    1. Legen Sie den Objektträger mit einer hochauflösenden Digitalkamera auf die Inkubationskammer auf der Bühne der inversen Fluoreszenzmikroskopie. Öffnen Sie die Software, wählen Sie die Modi PART, X, Y, Z und T aus, und führen Sie die Experimente in den Aufnahmeeinstellungen durch (Abbildung 5A).
    2. Wählen Sie ein 20-fach-Objektiv mit hohem Kontrast für die Fluoreszenz- und Phasenkontrastbildgebung (Abbildung 5A). Fügen Sie die Kanäle Phasenkontrast und Fluoreszenz (FITC-Filter) hinzu, um die Bildgebung in beiden Modi zu ermöglichen (Abbildung 5A).
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Bildgebung lebender Zellen zu starten, und bringen Sie die Zellen dann unter Phasenkontrast in den Fokus (Abbildung 5A). Öffnen Sie das Z-Stapel-Fenster, und markieren Sie die Position der interessierenden Zellen (die sowohl seneszente/nicht-seneszente HeLa-Zellen als auch GFP-HeLa-Zellen enthalten). Navigieren Sie mit der automatischen Tischsteuerung zwischen den Vertiefungen, die eine präzise Positionierung der ausgewählten Bereiche für die Positionsmarkierung ermöglicht (Abbildung 5A).
      HINWEIS: Auf diese Weise können mehr als ein Bereich im selben Vertiefungsbereich einer Folie ausgewählt werden.
    4. Schalten Sie den Kanal auf den Fluoreszenzkanal um, um die Fluoreszenzbildgebung zu starten. Stellen Sie die entsprechenden Einstellungen für Belichtung (89,506 ms), Verstärkung (10) und Intensität (136) ein (Abbildung 5A).
      HINWEIS: Diese Parameter variieren je nach Fluoreszenzintensität der Zellen, die das fluoreszierende Protein exprimieren.
    5. Wählen Sie ein μm-Z-Stapel-Intervall aus, legen Sie die obere und untere Position fest und konfigurieren Sie den Z-Stapel unter Phasenkontrast (Abbildung 5A). Klicken Sie auf Stopp , um die Option Live zu schließen.
    6. Stellen Sie die Dauer (48 h) und das Zeitintervall (30 min) mithilfe der Felder "Dauer" und "Zeitintervall" für Zeitrafferaufnahmen ein.
    7. Klicken Sie auf Start , um das Imaging für 48 Stunden zu starten (Abbildung 5A). Speichern Sie das Projekt nach 48 h (Abbildung 5A).
    8. Wählen Sie zu jedem Zeitpunkt (0 h und 48 h) das beste Bild aus dem Z-Stapel aus, und exportieren Sie das Bild (Abbildung 5A).
    9. Zählen Sie die GFP-positiven Zellen nach 0 h und 48 h, berechnen Sie den prozentualen Anstieg der GFP-positiven Zellen und analysieren Sie die Daten mit einem geeigneten Softwareprogramm (Abbildung 1D,E).
  7. Generieren eines Films
    1. Klicken Sie auf Galerie anzeigen , um alle erfassten Bilder nach Zeitpunkten und Z-Stack-Layern anzuzeigen (Abbildung 5B).
    2. Klicken Sie für jeden Zeitpunkt mit der rechten Maustaste auf das am besten fokussierte Bild aus dem entsprechenden Z-Stapel und wählen Sie Miniaturen in einer Reihe auswählen. Speichern Sie die ausgewählten Frames (Abbildung 5B).
    3. Wiederholen Sie diesen Vorgang individuell für jede Position. Um die Auswahl der am stärksten fokussierten Bilder zu unterstützen, verwenden Sie die Funktion "Am besten fokussierte Frames suchen". Speichern Sie ausgewählte Bilder über die Option Ausgewählte Frames speichern. Die gespeicherten Bilder werden automatisch in den Bereich Projekt öffnen hochgeladen.
    4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Film und wählen Sie Bild exportieren , sobald die Bildsequenzen vollständig geladen sind.
    5. Navigieren Sie im Exportfenster zur Registerkarte Film, stellen Sie die gewünschte Bildrate (Bilder pro Sekunde) ein, wählen Sie bei Bedarf zusätzliche Optionen wie Maßstabsleiste, Zeitstempel usw. aus und schließen Sie den Export ab, indem Sie mit der Option "Durchsuchen" ein Ziel auswählen (Abbildung 5B, Video 1, Video 2 und Video 3).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese repräsentative Versuchsreihe untersuchte die möglichen Auswirkungen des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, der von seneszenten Krebszellen abgeleitet wurde, auf andere Krebszellen. Daher wurde zunächst mittels SA-β-Gal-Färbung bestätigt, ob eine Behandlung mit Doxorubicin für 72 h die Seneszenz in HeLa-Zellen induzieren kann. In seneszenten Zellen bleibt das lysosomale Enzym β-Galactosidase auch bei niedrigem pH-Wert aktiv und spaltet das chromogene Substrat X-Gal, wodurch ein blauer Niederschlag

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische Interaktionen von Krebszellen in ihrer Mikroumgebung sind entscheidend für die Tumorprogression, die die Induktion von Metastasen und die Entwicklung eines Sekundärtumors beeinflusst. Es wird auch berichtet, dass seneszente Krebs- und Stromazellen die Mikroumgebungen von Tumoren durch die Faktoren regulieren, die von seneszenten Zellen sezerniert werden4. Diese Faktoren stimulieren die Zellproliferation, Migration, Invasion, Differenzierung und erhöhen ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der Scientific Project Unit der Gazi University (Förderkennzeichen: TOA-2021-7321) und TUBITAK (Förderkennzeichen: 122S564 und 223S969) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
µ-Slide 8 Brunnen hochfigure-materials-1bidi80806
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)Gibco25300-054
Amicon Ultra-Zentrifugalfiltereinheiten (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
CO2 Inkubator (37 °C; C, 5 % CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorubicinTocris2252
E-Kennzeichen INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-Kennzeichen ANSICHT 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
HeLa-Zellenfigure-materials-2AP Institut, Ankara, TürkeiHÜ KÜ K Nr.: 90061901 
Leica DMi8 invertiertes Fluoreszenzmikroskop  Leica
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco70011-044
Seneszenzassoziiertes Β-Galactosidase (SA-β-gal) Färbungskit Zellsignalisierung9860ER
Inkubationssystem mit der Stufe obenPecon 
Temp-Controller 2002-2 Pecon 
Trypan-Blau-FarbstoffSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Krebszellproliferationseneszente Zellenparakrine Signal bertragungjuxtakrine Effektekonditionierte MedienCo Kultur TechnikenEchtzeit ZellanalyseLive Cell ImagingHeLa Zellen

Verwandte Artikel