Enthüllung der Phosphorylierungsmodifikation mit Phos-Tag SDS-PAGE Gelelektrophorese und In-vitro-Kinase-Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in der Phosphorylierungsmodifikation von Zielproteinen mittels Phos-Tag-Gelelektrophorese in klinischen Proben und In-vitro-Kinase-Assays.

Zusammenfassung

Die Phosphorylierung ist eine klassische posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert. Proteine enthalten typischerweise mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen, die durch verschiedene Kinasen an verschiedenen Stellen modifiziert werden können. Die Untersuchung von Phosphorylierungsänderungen von Zielproteinen bei Krankheiten erfordert häufig phosphospezifische Antikörper. Kommerzielle Optionen können jedoch auf eine einzige Website beschränkt oder gar nicht verfügbar sein. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Veränderungen in Phosphorylierungsmodifikationen von Zielproteinen in klinischen Proben mit Hilfe der Phos-Tag-Gelelektrophorese zu detektieren und detaillierte Phosphorylierungsstellen durch in vitro Kinase-Assays zu identifizieren. Phosphorylierte Proteine, die an Phos-Tag gebunden sind, weisen in der SDS-PAGE-Gelelektrophorese langsamere Migrationsraten auf, was eine semiquantitative Analyse von Phosphorylierungsänderungen in Krankheitsgeweben basierend auf der mittleren Pixelintensität der langsam migrierenden Banden ermöglicht. Durch die Kombination von Phos-Tag SDS-PAGE mit Immunblotting unter Verwendung von pan-spezifischen Antikörpern gegen mehrere Kandidatenproteine können Forscher Zielproteine mit Phosphorylierungsänderungen effizient identifizieren. Nach dem Screening der Kandidatenkinasen werden In-vitro-Kinase-Assays mit dem Zielprotein durchgeführt, und die resultierenden phosphorylierten Produkte werden einer Massenspektrometrie unterzogen, um eine genaue Identifizierung der Stelle zu gewährleisten. Diese Methode erfordert keine spezifischen phosphorylierten Proteinantikörper, was ein groß angelegtes Screening von Gewebeproben ermöglicht, um veränderte Phosphorylierungszustände bei der Krankheit zu identifizieren. Darüber hinaus können die identifizierten Phosphorylierungsstellen verwendet werden, um spezifische Antikörper für die quantitative und Lokalisierungsanalyse in Krankheitsgeweben zu entwickeln, was einen tieferen Einblick in ihre funktionelle Rolle ermöglicht.

Einleitung

Die Phosphorylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation zur Modulation der subzellulären Lokalisation, der Kinaseaktivität und der transkriptionellen Aktivität von Proteinen. Im menschlichen Genom wurden mehr als 500 Proteinkinase-Gene gefunden, die an der Signaltransduktion, der Genexpression und der Protein-Protein-Interaktion beteiligt sind¹. Phosphorylierung und Dephosphorylierung stehen unter der Kontrolle verschiedener Kinasen, die schnell reversibel sind, um die Zelladhäsion, die Zellproliferation und die Zelldifferenzierung zu regulieren². Abnorme Proteinphosphorylierungsmodifikationen sind jedoch für viele menschliche Krankheiten verantwortlich, darunter Tumorgenese, Autoimmunerkrankungen, Neurodegeneration und Subfertilität ^3,4,5.

Die phosphoproteomische Profilierung klinischer Proben ergibt mehrere Kandidaten für differentiell phosphorylierte Proteine⁶. Um die wichtigsten Phosphorylierungsmodifikationen bei menschlichen Krankheiten aufzudecken, ist eine einfache und effiziente Methode zum Nachweis des Phosphorylierungsstatus spezifischer Zielproteine erforderlich. Die Phosphorylierung an verschiedenen Stellen könnte zu deutlichen funktionellen Veränderungen des Proteins führen. Daher ist die Verwendung von phosphorylierungsspezifischen Antikörpern, die auf bestimmte Aminosäurestellen abzielen, zweifellos die beste Methode zum Nachweis von Veränderungen in der Proteinphosphorylierung. Für viele Proteine fehlen jedoch gut charakterisierte phosphospezifische Antikörper. Darüber hinaus ist ein geeigneterer Ansatz erforderlich, um neue potenzielle Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Die Phosphorylierung an bestimmten Aminosäureresten verändert häufig die Migrationsrate eines Proteins in der Gelelektrophorese, und langsamer migrierende Banden können Änderungen des Phosphorylierungsstatus widerspiegeln⁷. Diese Mobilitätsverschiebungen sind jedoch in der Regel subtil, so dass sie schwer zu unterscheiden sind. Phos-Tag ist eine synthetisierte chemische Verbindung, die aus einer alkalischen Phosphatase-katalytischen Domäne als Modell entwickelt wurde und phosphorylierte Ser/Thr/Tyr- und His/Asp/Lys-Rückstände einfangen kann. Daher verstärkt die Phos-Tag-Konjugation effektiv die Unterschiede in der Migrationsrate zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proteinen und unterscheidet gleichzeitig Variationen in der Anzahl der Phosphorylierungsstellen⁸.

Diese Phos-Tag-basierte Methodik zum Nachweis von Phosphorylierungsänderungen des Zielproteins in Gewebeproben bietet deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Entscheidend ist, dass keine phosphospezifischen Antikörper mehr erforderlich sind, sondern stattdessen standardmäßige proteinspezifische Antikörper in WB-Qualität für den Nachweis verwendet werden. Die phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Formen von Zielproteinen werden während der Phos-Tag SDS-PAGE als unterschiedliche Banden aufgelöst, was eine semiquantitative Bewertung von Veränderungen des Phosphorylierungsniveaus in Krankheitszuständen durch vergleichende Bandenintensitätsanalyse ermöglicht. Der Arbeitsablauf in diesem Protokoll umfasst: (1) Phos-Tag SDS-PAGE-Trennung von Proteinproben, (2) Immunoblot-Screening auf phosphorylierte Ziele, (3) In-vitro-Kinase-Assays mit Kandidatenkinasen, die durch Phospho-Ser/Thr-Antikörper verifiziert wurden. Eine anschließende massenspektrometrische Analyse (durchgeführt von einer externen Serviceplattform) identifiziert Phosphorylierungsstellen, um eine ortsspezifische Antikörperentwicklung zu ermöglichen; Die detaillierte Methodik ist im aktuellen Protokoll nicht enthalten. Insbesondere wurde dieser Ansatz erfolgreich angewendet, um Änderungen der Nur77-Phosphorylierung in klinischen Proben zu detektieren, die Mst1-Kinase als vorgeschalteten Regulator der Nur77-Phosphorylierung zu identifizieren und einen ortsspezifischen Phospho-Antikörper für den klinischen Nachweis der Phosphorylierung am Threonin 366 von Nur77⁹ zu entwickeln. Daher erweist sich dieser Ansatz besonders in der Vorphase der Forschung bei der Untersuchung mehrerer Kandidatenproteine als wertvoll, da er ein groß angelegtes Screening von Phosphorylierungsstatusänderungen über zahlreiche Ziele hinweg mit kommerziell erhältlichen Antikörpern ermöglicht.

Protokoll

Die Institutional Review Boards des Nanjing Drum Tower Hospital genehmigten die Humanforschung (2013-408081-01). Das aktuelle Protokoll wird unter Verwendung von Endometriumgewebe als repräsentativem Modell erstellt. Bei entsprechender Optimierung kann diese Methodik auf andere klinische Proben ausgeweitet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Tumorgewebe für die Proteinextraktion und nachfolgende Analysen. Die Endometriumbiopsie wird in der mittleren sekretorischen Phase bei fruchtbaren Frauen (Kontrollgruppe) und bei Frauen mit rezidivierendem Embryoimplantationsversagen durchgeführt, die sich einer In-vitro-Fertilisation-Embryotransfer unterziehen (Krankheitsgruppe). Alle Patienten gaben vor dem Probenahmeverfahren eine Einverständniserklärung ab. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Proben

1. Spülen Sie die erhaltenen frischen Gewebeproben zweimal mit vorgekühltem PBS, um Blutzellen zu entfernen, und trennen Sie etwa 100 mg Gewebe in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Legen Sie das Gewebe in ein 2-ml-Mahlröhrchen mit rundem Boden, das 1 ml Gewebeprotein-Lysepuffer enthält (150,0 mmol/l NaCl, 1,0 % NP-40, 50,0 mmol/l Tris pH 8,0, 0,5 % Natriumdesoxycholat, Proteaseinhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2 und 3).
3. Stellen Sie die Geschwindigkeit des Hochgeschwindigkeits-Gewebedispergierers auf Stufe 5 (von 6 Stufen) ein und mahlen Sie das Gewebe 10 s lang, gefolgt von einer 30 s langen Inkubation auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 Mal, um Gewebehomogenat zu erhalten.
4. Das Homogenat wird durch langsame Drehung auf einem Schüttler bei 4 °C für 30 min lysiert, dann 10 min lang bei 4 °C und 13.000 × g zentrifugiert und der Überstand aufgefangen.
5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode.
6. Nehmen Sie insgesamt 300 μg Protein, stellen Sie es auf ein gleiches Volumen ein und mischen Sie es mit 4× Laemmli Proteinprobenpuffer. Denaturieren Sie das Gemisch, indem Sie es 8 Minuten lang auf 95 °C erhitzen, auf Raumtemperatur abkühlen und dann für die weitere Analyse beladen.
   HINWEIS: Vor Schritt 2 werden konventionelle Western-Blotting-Analysen empfohlen, um das interessierende Protein unter Verwendung von Gesamtantikörpern zu ermitteln und die Expressionsniveaus zu bewerten.

2. Gelvorbereitung des Phos-tag SDS-PAGE Gels

1. Bereiten Sie 100 mL 30% w/v Acrylamid / N, N'-Methylen-Bisacrylamid Mischlösung vor, indem Sie 29,0 g Acrylamid und 1,0 g N, N'-Methylen-Bisacrylamid hinzufügen.
   HINWEIS: Bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren.
2. Bereiten Sie 1,5 mol/l Tris-HCl-Lösung (pH 8,8), 0,5 mol/l Tris-HCl-Lösung (pH 6,8), 10 % w/v SDS-Lösung und 10 % w/v Ammoniumpersulfatlösung vor, wie sie in herkömmlicher SDS-PAGE verwendet wird.
3. Bereiten Sie 5,0 mmol/l Phos-Tag-Lösung und 10 mmol/l MnCl_2-Lösung speziell für Phos-tag SDS-PAGE-Gel vor.
4. Bereiten Sie die auflösende Gellösung vor, im Falle der Herstellung der 10-ml-Lösung mit 6 w/v% Polyacrylamid-Gel mit 50 μM Phos-Tag-Lösung und 100 μM MnCl₂, indem Sie 2 mL 30% (w/v) Acrylamid/Bis-Acrylamid-Mischlösung, 2,5 mL 1,5 mol/L Tris/HCl-Lösung (pH 8,8), 0,1 mL 5,0 mmol/L Phos-Tag-Lösung mischen, 0,1 mL 10 mmol/L MnCl₂ Lösung, 0,1 mL 10% (w/v) SDS-Lösung, 10 μl TEMED und 5,14 mL destilliertes Wasser.
5. Die vorbereitete auflösende Gellösung vorsichtig vortexen, um die Homogenität zu gewährleisten, dann das Gellösungsröhrchen in einen Vakuumexsikkator legen und 2 Minuten lang ein Vakuum (0,1 MPa) anwenden, bis keine sichtbaren Blasen mehr vorhanden sind.
6. 50 μl 10% Ammoniumpersulfat zugeben und vorsichtig, aber gründlich mischen.
7. Pipettieren Sie die Lösung sofort in die zusammengebaute Gelkassette, bis sie ~1 cm unter dem oberen Rand der kurzen Platte angelangt ist. Vermeiden Sie die Einführung von Blasen.
8. Schichten Sie vorsichtig 0,5 mL destilliertes Wasser auf das Gel, um Luft auszuschließen und eine flache Oberfläche zu gewährleisten. Polymerisation bei Raumtemperatur für 20-30 min zulassen.
9. Bereiten Sie gleichzeitig eine gepufferte Standard-Tris-HCl-Gellösung (4,5 % w/v Polyacrylamidgel) vor, indem Sie 0,6 mL 30 % (w/v) Acrylamid/Bis-Acrylamid-Mischlösung, 1 mL 0,5 mol/l Tris-HCl-Lösung (pH 6,8), 40 μl 10% (w/v) SDS-Lösung, 4 μl TEMED und 2,33 mL destilliertes Wasser mischen. Sanft vortexen und entgasen.
10. Stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig erstarrt ist (kippen Sie die Gelkassette, um das Kippen der oberen Flüssigkeitsschicht zu beobachten und gleichzeitig die Unbeweglichkeit der Zwischengrenzfläche zu bestätigen). Die Wasserauflage vorsichtig abgießen und vollständig abtropfen lassen.
11. Geben Sie 20 μl 10 % Ammoniumpersulfat in die vorbereitete Stapelgellösung, mischen Sie es vorsichtig und pipettieren Sie es sofort auf das Auflösungsgel.
12. Legen Sie vorsichtig einen 10- oder 15-Well-Kamm in die Stapelgellösung, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Stapelgel 10 min lang bei Raumtemperatur polymerisieren.
    HINWEIS: Bereiten Sie das Gel immer erst kurz vor der Anwendung vor. Bitte optimieren Sie die Phos-markierten und Acrylamid-Konzentrationen für jedes Protein von Interesse.

3. Elektrophorese des Phos-Tags SDS-PAGE

1. Montieren Sie die Elektrophoreseausrüstung und füllen Sie die Elektrodenkammern mit herkömmlichem Tris/Glycin/SDS-Laufpuffer.
2. Laden Sie 30 μg Proteinprobe mit einer Mikropipette in jede Vertiefung.
3. Die Elektrophorese wird unter konstanten Strombedingungen (30 mA/Gel) durchgeführt, bis das Bromphenolblau den Boden des auflösenden Gels erreicht.
4. Weichen Sie die Gele zweimal 10 Minuten lang in methanolfreiem SDS-PAGE Transfer Buffer mit 5 mM EDTA ein, um bivalente Kationen zu entfernen.
5. Übertragen Sie die Proteine 90 min lang bei 90 V mit Wet-/Tank-Blotting-Systemen auf die PVDF-Membran.

4. Immunoblotting und Analyse

1. Blockieren Sie die Membran mit einer 5%igen Lösung von Magermilch oder Rinderserumalbuminpulver (verdünnt in 1×Tris-Borat-Natrium-Tween-20-Lösung, TBST) bei Raumtemperatur für 1 h.
2. Der Primärantikörper wird mit einem geeigneten Verhältnis gegen das Zielprotein verdünnt und über Nacht bei 4 °C mit der Membran inkubiert.
3. Waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBST, 10 min pro Waschgang, bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
4. Inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
5. Waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBST, 10 min pro Waschgang, bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
6. Inkubieren Sie mit dem verstärkten Chemilumineszenzsubstrat 1 Minute lang im Dunkeln, gefolgt von einer Belichtung.
7. Erfassen Sie die Bilder mit einem automatisierten Geldokumentationssystem und quantifizieren Sie die Zielbanden (langsam migrierendes phosphoryliertes Zielprotein und schnell migrierendes nicht-phosphoryliertes Zielprotein) für die Graustufenintensität mit der ImageJ-Software.
   HINWEIS: Westliche Blots von Phos-Tag-Gelen können nicht zur Molekulargewichtszuweisung verwendet werden.
8. Berechnen Sie das Verhältnis von langsam migrierenden phosphorylierten Banden zu schnell migrierenden nicht-phosphorylierten Banden für jede Probe und analysieren Sie die statistische Differenz des Phosphorylierungsprozentsatzes zwischen den Gruppen.

5. Immunpräzipitation des Zielproteins

1. Konstruieren Sie Expressionsplasmide, die für FLAG-markierte (oder alternative Epitop-Tags, einschließlich, aber nicht beschränkt auf HA, GFP, GST oder His) Wildtyp- oder ortsspezifische Phosphomutanten des Zielproteins kodieren.
2. Transfizieren Sie HEK293-Zellen mit Expressionsplasmiden unter Verwendung von Lipofectamine 3000 gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. Lysieren Sie die Zellen in 1 ml Gewebeprotein-Lysepuffer, wie in Schritt 1 beschrieben, um den Proteinüberstand zu extrahieren.
4. Inkubieren Sie den Überstand mit 20 μl Anti-FLAG M2 Affinitätsgel über Nacht bei 4 °C unter Rotation.
5. Zentrifugieren (1000 × g, 3 min), Agarosekügelchen sammeln und mit 10 Säulenvolumina TBS waschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
6. Löse das FLAG-Peptid in TBS bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml auf.
7. Eluieren Sie das gebundene FLAG-Fusionsprotein aus dem Anti-FLAG M2-Affinitätsgel durch kompetitive Elution mit fünf einspaltigen Volumina FLAG-Peptidlösung (verwenden Sie 100 μl Lösung für 20 μl Agarosekügelchen) für 5-10 min unter schonendem Mischen.
8. Zentrifugieren (1000 × g, 3 min) und Überstand auffangen.
   HINWEIS: Wenn die Kinase bekannt ist, fahren Sie mit Schritt 6 fort. Andernfalls identifizieren Sie zunächst potenzielle Kinasen durch Hefe-Zwei-Hybrid-Screening oder bioinformatische Vorhersage (z. B. mit PhosphositePlus oder gruppenbasiertem Vorhersagesystem), bevor Sie mit Schritt 6 fortfahren.

6. In-vitro-Kinase-Assay zur Identifizierung phosphorylierter Aminosäuren

1. Kinasepuffer (30 μl pro Reaktion): 40 mM HEPES pH7.6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-Glycerophosphat, 200 μM ATP, 100 ng aktive Kinase, immunpräzipitiertes FLAG-Fusionsprotein.
2. Bei 30 °C 30 min in einem Thermomischer unter leichtem Rühren inkubieren.
3. Stoppen Sie die Reaktionen durch Zugabe von 10 μl 4× Laemmli-Puffer und denaturieren Sie sie 5 Minuten lang bei 95 °C.
4. Konventionelle SDS-PAGE-Elektrophorese mit immunpräzipitiertem FLAG-Fusionsprotein durchführen, das mit oder ohne aktive Kinase umgesetzt wurde.
5. Sonde mit Anti-Phospho-Thr-Antikörper und Anti-Phospho-Ser-Antikörper zur Identifizierung phosphorylierter Aminosäuren. Sonde mit Anti-Flag-Antikörper als Kontrolle (siehe Materialtabelle).
6. Führen Sie das Immunblotting und die Analyse wie in Schritt 4 beschrieben durch.

Ergebnisse

Das vorläufige phosphoproteomische Profiling von menschlichen Proben aus der Kontrollgruppe und der Krankheitsgruppe identifizierte Nur77 als Kandidaten für ein differentiell phosphoryliertes Protein. Um die Wirksamkeit von Phos-tag SDS-PAGE beim Nachweis der Nur77-Proteinphosphorylierung zu untersuchen, wurde ein Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE-Experiment durchgeführt. Nach der Gesamtproteinextraktion aus Gewebeproben wurden 30 μg Protein geladen und durch Mn²⁺-Phos-Tag-Gelelektrophorese getrennt, gefolgt v...

Diskussion

Der Phos-Tag-basierte Ansatz zum Nachweis von Phosphorylierungsänderungen von Zielproteinen in klinischen Geweben bietet erhebliche Vorteile für die Proteinphosphorylierungsforschung. Phosphorylierte Proteine weisen aufgrund der Phos-Tag-Bindung eine verringerte elektrophoretische Mobilität auf, was ein Hochdurchsatz-Screening des Phosphorylierungsstatus von Kandidatenproteinen ermöglicht, ohne dass phosphospezifische Antikörper erforderlich sind. Dies ist besonders wertvoll für die erst...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% SDS-Lösung	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glycin/SDS	BIO-RAD
1610732 4-fach;   Laemmli Protein-Probenpuffer	BIO-RAD	1610747
Acrylamid	Sangon Biotech	A601032
Ammoniumpersulfat	Sangon Biotech	A100486
Anti-FLAG M2 Affinitätsgel	Millipore	A2220
Enhanced Chemilumineszenz Kit	ThermoFisher	32106
FLAG Antikörper	CST	14793
FLAGGE  Peptid	Millipore	F3290
HRP-konjugierter Sekundärantikörper	Bioworld Technology	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cell	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorese Cell	BIO-RAD	1658005
Mst1	AntikörperCST	3682
N, N'-Methylen-Bisacrylamid	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin(TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 Antikörper	CST	3960
Phosphatase-Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726	Zur Hemmung von Tyrosinproteinphosphatasen, Säure und alkalische Phosphatasen
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma	P0044	Zur Hemmung von Proteinphosphatase 2A, alkalischen Phosphatasen, Proteinphosphatasen 1 und 2A
Phospho-serin Antikörper	Sigma	P5747
Phospho-Threonin Antikörper	Sigma	P6623
Phos-Tag Acrylamid	Wako	304-93526	Zur Herstellung von Phos-Tag SDS PAGE
Gel Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo	23227
Proteaseinhibitor	Cocktail Sigma	S8830	EDTA-frei, Tablette, zur Hemmung von Serin, Cystein, Asparagin- und Metalloproteasen
PVDF-Membran	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
Gewebedispergierer	IKA	T 10	Zur Gewinnung von Gewebehomogenat
Tris-HCl Puffer (0,5M, pH 6,8)	Sangon Biotech	B546020
Tris-HCl Puffer (1,5M, pH 8,8)	Sangon Biotech	B546019
Vakuum-Exsikkator	ThermoFisher	5311-0250	Zur Entgasung der Gellösung
β-Mercaptoethanol	Sigma	M3148