Method Article

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Abstract

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Eukaryotische Zellen folgen einem konservierten Zellzyklus, der verschiedene Prozesse reguliert, einschließlich der DNA-Erhaltung und der Organellenhomöostase. Die Untersuchung zellulärer Prozesse in Abhängigkeit vom Zellzyklus ist oft notwendig, um experimentelle Ergebnisse richtig zu interpretieren. Es gibt chemische und genetische Methoden, um die Zellzyklussynchronisation in kultivierten Zellen über eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Wirbeltiermodellen, zu erzeugen, und ermöglichen die Untersuchung von Zellzyklus-abhängigen Prozessen. Unter den Modellorganismen bleibt die knospende Hefe jedoch aufgrund ihrer besonders robusten Synchronisationsmethoden, der kurzen Generationszeit und der genetischen Rückverfolgbarkeit ein Kraftpaket für die Zellzyklusanalyse. Hefe teilt sich die Kernmaschinerie des Zellzyklus mit anderen Eukaryoten, was bahnbrechende Entdeckungen in der Zellzyklusregulation ermöglicht hat. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Zellzyklusanalyse in Hefe, wobei der Schwerpunkt auf G1-Arrest-Release- und mitotischen Arrest-Release-Experimenten liegt, einschließlich Stammkonstruktion, Kulturvorbereitung und Mikroskopie. PCR-Tagging-Methoden zur Herstellung geeigneter Stämme für den Zellzyklus-Arrest und die Fluoreszenzmikroskopie werden vorgestellt. Ein G1-Arrest wird mit dem Peptid Pheromon α-Faktor erreicht, und kurze Waschungen führen zu einer synchronen Freisetzung und Progression des Zellzyklus. Die Proben werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Freisetzung in den Zellzyklus entnommen und für die Mikroskopie fixiert. Eine zweite Methode hält Hefezellen in der Mitose auf, indem der Zellzyklusregulator Cdc20 depletiert wird, um eine metaphasenarrestierte Population zu erreichen, sowie eine optionale Freisetzung in die Anaphase. Die Proben werden fixiert und für die Bildgebung vor und nach der Freigabe vorbereitet, abgebildet und analysiert. Die Bildanalyse konzentriert sich auf die Katalogisierung der dynamischen Lokalisierung und der Populationshäufigkeit von Proteinen im Zellzyklus. Diese Synchronisationsmethoden eignen sich für verschiedene Zellzyklus-Manipulationen, und während ihre Verwendung bei der Bildgebung fixierter Zellen hier hervorgehoben wird, können sie für viele andere Analysen angepasst werden, einschließlich der Bildgebung lebender Zellen sowie biochemischer und molekularer Assays.

Introduction

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Die eukaryotische Zellteilung wird durch ein Programm, der Zellzyklus, stark reguliert. Die hochkonservierten und dynamischen Prozesse, die im Zellzyklus ablaufen, machen es an und für sich interessant, sie zu untersuchen, haben aber auch weitreichende Implikationen, die die Untersuchung anderer zellbiologischer Prozesse beeinflussen - zum Beispiel durchlaufen viele Organellen während der Zellteilung einen dramatischen Umbau, und die Häufigkeit und Lokalisation vieler Proteine ist überall stark reguliert 1,2,3. Obwohl es in Metazoensystemen im Vergleich zu Hefe einige zusätzliche Komplexitätsschichten gibt, einschließlich einer größeren Vielfalt an regulatorischen Kinasen und Proteinen sowie zusätzlicher Input durch externe Signale in Metazoen, ist die Zellteilung in allen Eukaryoten insgesamt sehr hoch konserviert 4,5. Viele grundlegende Arbeiten wurden an der Hefe geleistet, um wichtige Erkenntnisse über die Zellzyklusprogression und entscheidende regulatorische Schritte zu gewinnen, und sie bleibt aus einer Vielzahl von Gründen ein äußerst attraktiver Organismus für die Untersuchung von Fragen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus 6,7. Dazu gehört vor allem die breite Palette von Methoden, die zur Manipulation des Zellzyklus zur Verfügung stehen, was den Stillstand in verschiedenen Stadien und die Synchronisierung von Zellen ermöglicht. Zu den weiteren Vorteilen gehören der kurze Zellzyklus der Hefe (~90-150 min, abhängig von Temperatur und Medienbedingungen), die einfache genetische Manipulation und die große Bandbreite an bedingten Allelen, die die Untersuchung in einem ansonsten wildartigen Kontext ermöglichen.

Das Fortschreiten durch die verschiedenen Phasen des Zellzyklus wird durch die Aktivität mehrerer Schlüsselkinasen bestimmt, darunter die ubiquitäre Cyclin-abhängige Kinase (Cdk), die Polo-ähnliche Kinase und die Aurora-Kinasen. Zellzyklus-Checkpoints regulieren das Fortschreiten durch den Zellzyklus und stellen sicher, dass die Zellen nur dann in die nächste Teilungsphase übergehen, wenn bestimmte Bedingungen erfüllt sind 8,9. Diese Checkpoints und die Übergänge, die sie regulieren, können von Forschern gekapert werden, um einen langfristigen Arrest oder einen vorübergehenden Arrest und Release zu erreichen, um eine Population von Zellen zu synchronisieren (Abbildung 1). Zum Beispiel stellt der Zellzyklus-Commitment-Checkpoint (Restriktionspunkt oder Start in Hefe) sicher, dass die Zelle über genügend Nährstoffe verfügt, um sich zur Teilung zu verpflichten, bevor sie mit der DNA-Replikation beginnt10. Dieser Checkpoint kann in haploider Hefe manipuliert werden, um einen G1-Arrest zu erreichen, wobei das Hefe-Paarungsprogramm genutzt wird, das mit dem Zellzyklus interagiert. In der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) haben haploide Zellen einen von zwei Paarungstypen, MATa oder MATα, der genetisch durch einen Paarungstyp-Locus bestimmt wird. Hefen eines Paarungstyps reagieren empfindlich auf das Paarungspheromon des anderen Paarungstyps und reagieren mit der Aktivierung einer MAP-Kinase-Signalkaskade, die letztendlich den Cdk-Inhibitor Far1 phosphoryliert und stabilisiert, der den Eintritt in den Zellzyklus verhindert, indem er an den Cln1/2-Cdk-Komplex bindet und dessen Aktivität blockiert 11,12,13. Zellen, die auf Paarungspheromone reagieren, können visuell durch das Vorhandensein einer Paarungsprojektion oder eines Shmoo bestimmt werden (Abbildung 1). So kann chemisch synthetisierter α-Faktor zu Kulturen von MAT-a-Zellen hinzugefügt werden, um einen G1-Arrest zu erreichen. Ein weiterer Zellzyklusübergang, den Forscher zur Synchronisierung von Hefezellen anvisieren können, ist der Übergang von der Metaphase zur Anaphase. Während der Mitose überwacht der Spindle Assembly Checkpoint (SAC) die Bindung von Kinetochoren an Mikrotubuli und hemmt das Anaphase-fördernde Komplex/Zyklosom (APC/C), indem er seinen Aktivator Cdc20 sequestriert, wenn nicht gebundene Kinetochore nachgewiesen werden. Das APC/C ist ein E3-Ligase-Komplex, der für den Eintritt in die Anaphase unerlässlich ist. Wenn die SAC erfüllt ist, bindet Cdc20 dann an das APC/C, und APC/C ubiquitiniert mehrere Proteine, hauptsächlich Securin und Cyclin B, was auf ihren Abbau abzielt und die Chromosomensegregation und den mitotischen Austritt fördert14,15. Obwohl Cdc20 selbst kein Bestandteil des SAC ist, ist seine Hemmung das Ziel der SAC-Aktivierung; daher kann die induzierbare Depletion von Cdc20 genutzt werden, um eine Hefekultur in der Metaphase zu stoppen (Abbildung 1)16.

Dieses Protokoll umfasst zwei Methoden zur Manipulation des Hefezellzyklus sowie eine beispielhafte Anwendung jeder Methode. Im ersten Fall wird der α-Faktor verwendet, um Zellen in G1 zu sperren, gefolgt von einem Waschschritt, um die Zellen aus dem Arrest zu befreien, was zu einem synchronen Wiedereintritt in den Zellzyklus führt. Die synchronisierten Zellen durchlaufen den gesamten Zellzyklus und ermöglichen es den Forschern, Zellen in jedem Zellzyklusstadium zu verfolgen und zu untersuchen. Bei dieser Methode wird die dynamische Lokalisation eines GFP-markierten Proteins von Interesse, Stu2, durchgehend überwacht und seine Assoziation mit der mitotischen Spindel verfolgt. Diese Methode nutzt auch eine getaggte Spindelpolkörperkomponente (SPB), Spc110-mCherry, die Messungen der mitotischen Spindellänge ermöglicht und ein hervorragender Proxy für die Zellzyklusprogressionist 17. Diese Methode zeigt, wie Zellzyklus-Arrest und -Freisetzung die Synchronisierung von Zellpopulationen ermöglichen und die Untersuchung eines Proteins oder einer anderen Komponente von Interesse während des gesamten Zellzyklus erleichtern.

Bei dem zweiten Verfahren wird ein mitotischer Arrest durch Depletion von Cdc20 unter Verwendung eines Auxin-induzierbaren Degron (AID)-Systems18 erreicht. In Zellen, die TIR1 (ein F-Box-Protein pflanzlichen Ursprungs) exprimieren, wird jedes Protein mit einem AID-Tag ubiquitiniert und durch Zugabe von Auxin abgebaut. Hier verwenden wir ein AID-markiertes Cdc20, um einen induzierbaren Abbau von Cdc20 zu ermöglichen, wodurch ein Stillstand in der Metaphase bewirkt wird. Diese Zellpopulation wird dann auf die Rekrutierung der markierten SAC-Komponente Bub1-GFP an Kinetochore überwacht, wobei das markierte Kinetochorprotein Mtw1-mCherry als Referenzmarker verwendet wird. Obwohl Bub1 SAC-unabhängige Rollen an den Kinetochoren spielt und in der frühen Mitose an Kinetochoren lokalisiert, signalisiert seine persistente Kinetochor-Lokalisation in verhafteten Zellen unsachgemäße Kinetochor-Mikrotubuli-Attachments19. Wir haben dies gezeigt, indem wir Zellen mit dem Mikrotubuli-Gift Nocodazol behandelt haben, das die Kinetochor-Mikrotubuli-Anhaftungen stört. Dieses Experiment zeigt, wie Prozesse, die für eine bestimmte Zellzyklusphase spezifisch sind, mit hochgradig abstimmbaren Arrestmethoden untersucht werden können. Wir zeigen ferner, dass Auxin aus cdc20-AID-Kulturen ausgewaschen werden kann, was die Freisetzung in die Anaphase und den Eintritt in einen neuen Zellzyklus ermöglicht, obwohl diese Kulturen unserer Erfahrung nach nicht so synchron freigesetzt werden wie eine α-Faktor-Arrest-Freisetzung. Diese beiden Arrest-Release-Methoden sind sowohl effektiv als auch einfach umzusetzen, aber es stehen den Forschern in Hefe viele andere Methoden zur Verfügung, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusstadien zu stoppen 20,21,22,23. Weitere Details zu diesen Methoden finden Sie in der Diskussion.

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Protocol

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1. Konstruktion von Stämmen für die Zellzyklusanalyse und Bildgebung

  1. Entwerfen Sie Primer zur C-terminalen Markierung des interessierenden Gens unter Verwendung von Pringle Tagging Plasmiden (pFA6a-Plasmiden)24. Kurz gesagt, entwickeln Sie F2- und R1-Primer, die bei Verwendung mit einem Plasmid der pFA6a-Serie ein PCR-Produkt erzeugen, das direkt in Hefe umgewandelt werden kann, um eine "markierte" Version des interessierenden Gens zu erzeugen. Verwenden Sie die in Tabelle 1 enthaltenen Primerpaare und Plasmide, um die Gene zu markieren, die in diesem Protokoll von Interesse sind. Plasmid- und Primer-Design-Strategien für die C-terminale Markierung von Hefe-Genen werden von Longtine et al.24 ausführlich beschrieben.
    HINWEIS: Diese Methode kann verwendet werden, um fluoreszenzmarkierte Proteine für die Bildgebung oder Auxin-induzierbare Degron (AID)-markierte Proteine herzustellen, um den Zellzyklusarrest und andere Experimente zu erleichtern, die durch den Abbau eines Zielproteinsermöglicht werden 18. Um beispielsweise CDC20 mit dem AID-Tag (IAA7) zu markieren, besteht der Forward-Tagging-Primer aus 25-40 Basen des CDC20-Gens unmittelbar vor dem Stoppcodon, ohne das STOP-Codon (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3') und auch die Pringle Plasmid F2-Adaptersequenz (5' cggatccccgggttaattaa 3'), die an das 3'-Ende angehängt wurde, um die endgültige Primersequenz (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Der reverse CDC20 Tagging Primer enthält das reverse Komplement der 25-40 Basenpaare unmittelbar nach dem STOP-Codon (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTATTTTA 3') und die Pringle Plasmid R1 Adaptersequenz (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') zur Herstellung der finalen Primersequenz (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Verwendung von PCR-Primern mit weniger als 40 Basenpaaren die Effizienz der Integration in das Hefegenom verringert.
  2. Verdünnen Sie die Primer in molekularbiologischem Wasser auf 10 μM.
  3. Führen Sie die PCR mit dem Plasmidpaar F2 und R1 und dem entsprechenden Markierungsplasmid unter Verwendung von Standardmethoden gemäß dem in Tabelle 2 enthaltenen Thermocycler-Programm durch und bestätigen Sie dann die Größe des PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese.
  4. Impfen Sie den Hefestamm, um ihn in eine 25 ml Hefeextrakt-Pepton-Adenin-Extrose-Kultur (YPAD) zu verwandeln und über Nacht bei 23 °C anzubauen. Für den Aufbau von cdc20-AID-Hefe (die Cdc20 nach Behandlung mit Auxin abbaut) kann der transformierte Stamm entweder bereits OsTIR1 enthalten, das aus einem ektopischen Locus exprimiert wird, oder OsTIR1 kann in späteren18 gekreuzt werden.
  5. Überprüfen Sie am nächsten Morgen den OD600 der Nachtkultur. Wenn die Kultur OD <2.0 ist, fahren Sie mit Schritt 1.6 fort. Wenn der OD 2,0 >, verdünnen Sie auf ~0,2-0,4 und lassen Sie 2-3 Wachstumszyklen zu.
  6. Ernten Sie Zellen bei OD600 = ~0,4-2,0, um sicherzustellen, dass sie sich in einer logarithmischen Wachstumsphase befinden. Ernten Sie 5 ODs von Zellen pro Transformation (z. B. 5 ml OD600 = 1,0). Wenn mehr als eine Transformation desselben Stammes durchgeführt wird, können die Zellen in diesem Stadium kombiniert werden. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 23 °C.
  7. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit 25 mL Wasser, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei 23 °C.
  8. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 1 ml 0,1 M Lithiumacetat (LiAc) resuspendieren und in 1,6 ml-Röhrchen überführen. Wenn Sie mehr als eine Transformation durchführen, teilen Sie die 1 mL Resuspension in mehrere Röhrchen auf (z. B. für 2 Transformationen 2x 500 μL; für 3 Transformationen 3x 333 μL aufteilen, etc.).
  9. Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei 23 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  10. Fügen Sie dem Zellpellet Folgendes hinzu (in dieser Reihenfolge): i) 240 μl PEG (50 %), ii) 36 μl 1,0 M LiAc, iii) 20 μl = 50 μg Lachsspermien-DNA, vorgekocht für 5 Minuten, iv) 54 μl Wasser.
  11. Geben Sie 10 μl PCR-Produkt (erhalten in Schritt 1.3) zu den Zellen und wirbeln Sie es 1 Minute lang ein, wobei Sie sicherstellen, dass alles gut vermischt ist.
  12. Die Zellen werden 30 Minuten lang bei 30 °C in einer Walzentrommel in einem warmen Raum oder in einem Thermoshaker bei 1000 U/min inkubiert.
  13. Hitzeschockzellen bei 42 °C für 15 min im Wasserbad.
    HINWEIS: Die optimale Hitzeschockzeit kann je nach Hintergrund des Hefestamms unterschiedlich sein. Dieses Protokoll ist für den W303-Stammhintergrund optimiert.
  14. Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei 23 °C zentrifugieren. Überstand entfernen und vorsichtig in 100 μl Wasser resuspendieren.
  15. Für Transformationen mit KanMX oder einer anderen Wirkstoffauswahl werden Zellen auf YPAD plattiert und bei 23 °C inkubiert, dann am nächsten Tag von Platte zu Wirkstoffplatte repliziert.
    HINWEIS: Einen Tag Wachstum auf YPAD zu ermöglichen, ist entscheidend, um die Expression von Arzneimittelresistenzgenen in transformierten Zellen zu ermöglichen.
  16. Für Transformationen mit auxotrophen Markern (URA, HIS, etc.), Plattenzellen direkt auf selektivem Medium.
  17. Inkubieren Sie die Platten 3 Tage lang bei 23 °C, damit die Hefetransformanten-Kolonien wachsen können.
  18. Überprüfen Sie die korrekte Markierung des Gens durch genomische PCR oder durch Western Blotting. Diese Methoden werden von Burnette25 und Chu et al.26 ausführlich beschrieben.
    HINWEIS: Für die Herstellung von Stämmen mit mehreren getaggten Allelen wird eine wiederholte Transformation ohne Rückkreuzung nicht empfohlen, da die Transformation ein mutagener Prozess sein kann. Um beispielsweise den Stamm zu produzieren, der Stu2-GFP und Spc110-mCherry enthält, empfehlen wir, die Stämme separat zu transformieren, um Stu2-GFP und Spc110-mCherry zu produzieren, und dann diese Allele durch Hefekreuzung, Sporulation, Tetradendissektion und genotypische Analyse zu einem haploiden Stamm zu kombinieren. Weitere Informationen zu Hefekreuzungen finden Sie bei Stansfield und Stark27 und Morin et al.28. Um eine α-Faktor-Arrest-Freigabe durchzuführen, muss der verwendete haploide Stamm MATa sein.

2. Synchronisierung von Hefekultur und Zellzyklus: α-Faktor-Arrest-Freigabe

  1. Impfen Sie die Hefe über Nacht bei 23 °C in 25 ml YPAD-Kultur, um am nächsten Morgen bei OD600 = 0,5-2,0 zu sein.
    1. Wenn die Zellen morgens über OD600 = 2,0 liegen, verdünnen Sie sie wieder auf OD600 = 0,2-0,4 und lassen Sie sie mindestens 1 Zellzyklus (2-3 h bei 23 °C) wachsen.
  2. Verdünnen Sie die Zellen wieder auf OD600 = 0,5 und fügen Sie α-Faktor zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzu (Lagerbestand 10 mg/ml in DMSO). Zellen hätten idealerweise eine bar1-Mutation (z. B. bar1-1), die sie empfindlicher für α-Faktor macht. BAR1-Wildtyp-Zellen sind weniger empfindlich gegenüber α-Faktor und benötigen eine Konzentration von α-Faktor, die mindestens eine Größenordnung höher ist, um richtig zu arretieren, was weniger wirtschaftlich ist.
  3. Überprüfen Sie 2,5 bis 3,5 Stunden nach der Festnahme den Grad der Festnahme, indem Sie den Prozentsatz der nicht knospenden Shmooed-Zellen zählen. Wenn 90-95% der Zellen shmooed (in G1 arretiert) sind, fahren Sie mit der Freisetzung fort. Der Zeitpunkt hängt vom Hefestamm, dem Wachstumsmedium und der Temperatur ab.
  4. Die Zellen werden aus dem α-Faktor-Arrest befreit, indem sie in einer Zentrifuge bei 3.000 x g für 3-5 Minuten bei 23 °C heruntergeschleudert und dann den Überstand abgießen.
  5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 25 mL YPAD + 1% DMSO resuspendieren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5 zweimal für insgesamt drei Wäschen und wechseln Sie die verwendete Tube einmal nach der ersten Wäsche.
  7. Geben Sie YPAD zu den Zellen, um das endgültige Volumen auf 25 mL zu bringen, und übertragen Sie die Zellen in einen neuen Kolben.
    HINWEIS: Die Verwendung eines neuen Kolbens ist entscheidend, um Spuren von α-Faktor zu beseitigen, die die Freisetzung verhindern könnten.
  8. Zeitpunkt, Probe (0 min) nehmen und fixieren (siehe Fixierungsanleitung in den Schritten 4.1 bis 4.4).
  9. Nehmen Sie weiterhin alle 15 Minuten Proben zu einem Zeitpunkt, wenn das Wachstum bei 23 °C stattfindet. Dieser Zeitpunkt ändert sich bei anderen Temperaturen, je nachdem, wie schnell die Zellen wachsen.
  10. Zum Zeitpunkt von 60 Minuten beurteilst Du die Synchronität der Freisetzung, indem Du unter einem Lichtmikroskop nach gleichmäßigen kleinen Knospen (Knospengröße < 25% Mutterzellgröße) durchsuchst.
  11. Optional) 60 Minuten nach der Freisetzung erneut α-Faktor bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzufügen, um ein Fortschreiten in den nächsten Zellzyklus zu verhindern. Bestätigen Sie die synchrone Zellfreisetzung, indem Sie vor der Zugabe die einheitliche Morphologie der kleinen Knospen überprüfen.
  12. Setzen Sie die Entnahme von Proben zu einem bestimmten Zeitpunkt bis zu 180 Minuten oder so lange wie gewünscht fort. Bei 23 °C tritt die Metaphase ~45-60 Minuten nach der Freisetzung auf, die Anaphase tritt ~60-90 Minuten nach der Freisetzung auf, und die meisten Zellen befinden sich 120 Minuten nach der Freisetzung im neuen G1.

3. Synchronisation der Hefekultur und des Zellzyklus: Cdc20-Depletions-Arrest-Freigabe

  1. Impfen Sie eine Hefekultur über Nacht bei 23 °C, um am nächsten Morgen einen OD600 = 0,5-2,0 zu erreichen.
    1. Wenn die Zellen am nächsten Morgen über OD600 = 2,0 liegen, verdünnen Sie sie wieder auf OD600 = 0,2-0,4 und lassen Sie sie mindestens 1 Zellzyklus (2-3 h bei 23 °C) wachsen.
  2. Auf OD600 = 0,5 zurückverdünnen und Auxin bis zu einer Endkonzentration von 500 μM aus 1 M Stamm (500x) in alle Kulturen geben. Bei Kulturen, die andere Arzneimittel (Nocodazol) erhalten, fügen Sie diese gleichzeitig mit Auxin in der entsprechenden Konzentration hinzu (z. B. ~10 μg/ml Nocodazol).
  3. Überprüfen Sie 2 Stunden nach dem Stillstand den Grad des Stillstands, indem Sie den Prozentsatz der großknospenförmigen Zellen zählen (großknospenförmig wird als das Vorhandensein von Knospen > 25 % der Mutterzellgröße bestimmt). Wenn 90-95 % der Zellen in der Mitose arretiert sind, fahren Sie je nach experimenteller Anwendung entweder mit der Entnahme von Proben oder der Entlassung der Zellen aus dem Arrest fort. Wenn 90% der Zellen nicht arretiert werden, lassen Sie die Kultur weiter wachsen und überprüfen Sie sie alle 15-30 Minuten. Der Zeitpunkt hängt vom Hefestamm, dem Wachstumsmedium und der Temperatur ab.
    HINWEIS: Es ist nicht ratsam, den Arrest bei einer Freilassung zu lange (länger als 4 Stunden) andauern zu lassen, da ein längerer Arrest die Lebensfähigkeit der Zellen verringern kann.
  4. Um die Cdc20-Verarmungssperre zu befreien, wird die Kultur durch Zentrifugation bei 3000 x g für 3-5 min bei 23 °C geerntet.
  5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 25 mL YPAD + 1 % DMSO resuspendieren und dann durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3-5 min bei 23 °C ernten.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.5 für insgesamt 2 Wäschen.
  7. Geben Sie YPAD zu den Zellen, um das endgültige Volumen auf 25 ml zu bringen, und übertragen Sie die Zellen in einen neuen Kolben.
    HINWEIS: Die Verwendung eines neuen Kolbens ist entscheidend, um Spuren von Auxin zu entfernen, die eine Freisetzung verhindern könnten.
  8. Nehmen Sie den Zeitpunkt 0 und fixieren Sie ihn (siehe Fixierungsanleitung in den Schritten 4.1 bis 4.4).
  9. Nehmen Sie weiterhin alle 10-15 Minuten Zeitpunkte für die gewünschte Dauer des Zeitverlaufs. Bei 23 °C hätten sich die meisten Zellen nach 50-70 min aus dem Arrest gelöst.
    HINWEIS: Die Zellen lösen sich nicht so synchron aus diesem Cdc20-Depletionsarrest wie bei einem α-Faktor-Arrest. Es kann jedoch nützlich sein, Anaphasen oder mitotische Exit-Ereignisse zu untersuchen. Eine weitere technische Einschränkung dieser Arrest-Freigabe besteht darin, dass es zu späteren Zeitpunkten nach der Freisetzung schwieriger ist, zwischen Metaphase-Zellen, die noch nicht freigesetzt haben, und den Zellen, die früher freigesetzt wurden und die Metaphase ihres nächsten Zellzyklus erreicht haben, zu unterscheiden. Falls erforderlich, kann dies entweder durch eine Lebendzellbildgebung überwunden werden, um einzelne Zellen zu verfolgen, während sie sich aus dem Arrest befreien, oder durch Hinzufügen eines α-Faktors zur Kultur (unter der Annahme, dass die Zellen MATa sind), um Zellen in G1 nach dem mitotischen Austritt zu arresten.

4. Fixierung der Hefe

  1. Zentrifugieren Sie 1 ml (oder 0,5-1,5 ODs) Kultur für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (~20.000 x g) bei 23 °C.
  2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Fixierlösung (3,7 % Formaldehyd in 0,1 M Kaliumphosphat (KPi), pH 6,4).
  3. Inkubieren Sie die Zellen in der Fixierlösung für 2-15 min bei
    23 °C. Bei Zeitverlaufsexperimenten ist es in der Regel ratsam, die Zellen für 15 Minuten zu fixieren, um den Zeitpunkt des Zentrifugierens der Zellen bei der Probenentnahme abzustimmen.
    HINWEIS: Der Fixierungszeitpunkt sollte für bestimmte Fluorophore und Proteine von Interesse optimiert werden.
  4. Die Zellen werden 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 23 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und in 500 μl 0,1 M KPi (pH 6,4) resuspendiert. Zellen in KPi können bei 4 °C gelagert werden, bis sie abbildbereit sind.
    HINWEIS: Das feste Zellfluoreszenzsignal kann je nach Fluorophor bis zu 2 Wochen anhalten, zur Quantifizierung der Fluoreszenzsignale sollten jedoch innerhalb von 7 Tagen Bilder gesammelt werden.

5. Vorbereiten von Objektträgern für die Bildgebung

  1. Wenn die Zellen für die Abbildung vorbereitet sind, zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 23 °C und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 10-100 μl Triton/DAPI/Sorbitol-Lösung (1,2 M Sorbit, 1 % Triton, 0,1 M KPi, pH 7,5, 2 μg/ml DAPI).
  2. Pipettieren Sie ~0,8 μl Zellen direkt auf ein sauberes Deckglas. Verteilen Sie das Zelltröpfchen mit einer Pipettenspitze vorsichtig in einem ca. 1 cm2 großen Kreis in der Mitte des Deckglases.
  3. Legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger. Drücken Sie mit einem Kimwipe vorsichtig um den Objektträger herum, um die Probe zu verteilen.
  4. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack.
  5. Optional bis zu 4-6 Stunden vor der Bildgebung an einem kühlen, dunklen Ort lagern, um die Zellbildung zu unterstützen und übermäßige Bewegungen zu verhindern.

6. Bildgebung

  1. Nehmen Sie den Objektträger zu einem Mikroskop, das mit einem 60x/1,42 Ölobjektiv und einem Rot-, Grün-, Blau- und Fernrot-Laser- und Filterset ausgestattet ist. Objektive mit höherer Vergrößerung (bis zu 100x) können ebenfalls verwendet werden.
  2. Fokussieren Sie das Mikroskop auf die Hefezellen, die am Deckglas haften.
    HINWEIS: Wenn sich die Hefezellen zu stark bewegen, können die Objektträger 20-60 Minuten lang an einem kühlen, dunklen Ort aufbewahrt werden, um sich abzusetzen.
  3. Sobald die Hefe scharf ist, passen Sie die Belichtungseinstellungen jedes Kanals an, um ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 3:1 zu erzeugen und sicherzustellen, dass keine fluoreszierenden Punkte überbelichtet werden.
    HINWEIS: Bei einem Bildgebungssystem, das wir mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera verwenden, wird beispielsweise ein 60x 550-Objektiv und Immersionsöl mit einem Brechungsindex von n = 1,516 verwendet, wobei das maximale Signal des roten Kanals auf 1000-2000 au, des grünen Kanals auf 3000 au, des blauen Kanals auf 3000 au und des DIC-Kanals auf 4000-5000 au eingestellt wird, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen.
  4. Passen Sie die Erfassungseinstellungen so an, dass 14-20 0,2 μm Z-Stapel auf insgesamt 2-4 μm reichen.
  5. Bei Mikroskopen, die mit Nachbearbeitungsmodulen ausgestattet sind, wählen Sie für jeden Stack die Option "Dekonvolution " und "Schnelle Projektion ".
  6. Sammeln Sie Z-Stapel von Zellen und nehmen Sie genügend Bilder auf, um ~100-200 Zellen für jede Bedingung oder jeden Zeitpunkt zu erfassen.
  7. In der Zusatzdatei 1 finden Sie Softwareanweisungen mit Screenshots aus der Imaging-Software.

7. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie projizierte Bilder in ImageJ und passen Sie Helligkeit und Kontrast an, um verschiedene Kanäle anzuzeigen. Wenn das für die Bildgebung verwendete Mikroskop nicht über Nachbearbeitungsmodule verfügt, führen Sie zu diesem Zeitpunkt eine maximale Projektion der Z-Stapel durch.
  2. Um das Fortschreiten des Zellzyklus zu bestimmen, zählen Sie 100 Zellen pro Zeitpunkt und klassifizieren Sie sie als Zellen mit einem oder zwei Zellkernen. Alternativ können Sie die Spindellänge oder den Abstand zwischen den Spindelpolkörpern berechnen, um den Zellzykluszustand zu definieren. Der Abstand zwischen Spc110-Foki < 1,5 μm entspricht den Metaphase-Zellen, und der Abstand > 1,5 μm entspricht den Anaphase-Zellen.
  3. Um die Intensitäten von Protein-Puncta (z. B. Stu2-GFP) zu berechnen, verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug , um die Grenze des interessierenden Signals zu zeichnen. Fügen Sie dieses Signal zum ROI-Manager (Region of Interest) hinzu, indem Sie T drücken oder das Menü verwenden. Wählen Sie im ROI-Manager Measure aus, um die Intensität jeder ausgewählten Puncta zu berechnen. Um Änderungen des puncta-Signals im Zeitverlauf anzuzeigen, stellen Sie die durchschnittliche Intensität mit einem Konfidenzintervall von 95 % in einem Liniendiagramm für jeden Zeitpunkt dar.
  4. Um den Prozentsatz der Zellen mit Bub1-GFP-Punkten zu berechnen, stellen Sie sicher, dass die minimalen und maximalen Helligkeitseinstellungen für den Grünkanal für verschiedene Bilder identisch sind. Zellen mit einer Bub1-GFP-Punktzahl, die eine Überlappung mit einer Mtw1-mCherry-Punktzahl aufweist, werden als Bub1 gezählt, die an das Kinetochor lokalisiert ist; Andernfalls wird die Zelle als negativ gezählt. Zählen Sie ~100 Zellen pro Bedingung. Aravamudhan et al.29 enthält weitere Informationen zur Lokalisation von Bub1 an Kinetochoren.
  5. Um den Prozentsatz der mononukleären Zellen mit großen Knospen zu berechnen, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer großen Knospe und einem Zellkern (ein DAPI-Signal) in der Population und dividieren Sie durch die Gesamtzahl der Zellen.
  6. In der Zusatzdatei 1 finden Sie die Softwareanweisungen mit Screenshots der Imaging-Software.

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Results

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Die Analyse von Veränderungen in der zellzyklusabhängigen Proteinlokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie kann mit den hier beschriebenen Methoden problemlos durchgeführt werden. Unsere Gruppe interessiert sich schon lange für die dynamische Regulation und Funktion der mitotischen Spindel. In der Hefe fungieren Spindelpolkörper (gekennzeichnet durch die Komponente Spc110) als Mikrotubuli-Organisationszentren, von denen Mikrotubuli-Filamente ausgehen, u...

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Discussion

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Die Nutzung der Zellzyklussynchronisation in knospenden Hefen ermöglicht die Untersuchung wichtiger Mechanismen für eine Vielzahl von zellulären Prozessen. Die Verwendung von G1-Arrest-Releases mit α-Faktor-Behandlung ermöglicht das synchrone Fortschreiten einer Zellpopulation durch die Stadien des Zellzyklus und, wie wir gezeigt haben, kann dynamische Lokalisationsmuster von zellulären Regulatoren wie Stu236 aufdecken. Zellzyklus-Arrests können auch mit genet...

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgements

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Wir danken dem Cell Imaging Core der University of Utah für die Instandhaltung der Mikroskopanlage von Delta Vision. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-Zuschüsse F31CA2717405 (an M.G.S.) und T32GM141848 (an M.G.S. und T.C.S.), 5 For the Fight (an M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (an M.P.M.) und NIH Grant R35GM142749 (an M.P.M.) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-FaktorKernsynthese-Einrichtung der University of UtahSequenz: WHWLQLKPGQPMY
1,5 mL Eppendorf-RöhrenAxygenMCT-175-C
10mM dNTP-MixThermowissenschaftlichR0193
50-mL konische RöhrenGreiner Bio-One227 261
5x Phusion HF-ReaktionspufferNew England BioLabsB0518S
Essigsäure, glazialFisher ChemicalBP2401C-212
Adenin-Hemisulfat-SalzSigma-AldrichA9126-100G
Agar, granuliertApex Chemikalien und Reagenzien20-275
AgaroseApex Bioresearch Produkte20-102GP
Autoklav Amsco Century DampfsterilisatorSterisSV-1262
Autoklaviertes DI-Wasser
AuxinSigma-AldrichKatze#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille-LaserflüssigkeitCargille Laboratories20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihydrochlorid)Molekulare SondenKatze#D1306
Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus LachshodenSigma-AldrichD1626
DextroseFisher ChemicalD16-10
Dinatriumethylendiamin-TetraacetatFisher ChemicalS811-10
DMSOThermowissenschaftlich20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Festgeschwindigkeits-Vortex-MixerVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluoreszenzmikroskop DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESeriennummer #: NV01063. Nicht mehr unterstützt
FormaldehydFisher ChemicalKat#F79-500
Gel-ApparatThermowissenschaftlichEule EasyCast B1
GeneRuler DNA-Leiter-MixFermentasSM0333
GlasperlenFisher Scientific11312A
GlasrutschenVWR48300-026
Innova 2300 PlattformschüttlerNeubraunschweigNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Laborzentrifuge für 1,5-mL-RöhrenEppendorf2525
Laborzentrifuge für 50-mL-RöhrenEppendorf5804
Lithiumacetat-DihydratSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Mikropipetten p2, p20, p200 und p1000 sowie entsprechende SpitzenRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
MikroskopabdeckungsglasFisher Scientific12541014
NocodazolCalbiochemKatze#487928; CAS: 31430-18-9; Los#B35705
Orange GSigma-AldrichO7252
PFLOCKHampton ResearchHR2-591
Peptongranuliert Fisher-BioreagenzienBP9725-5
Phusion HF-DNA-PolymeraseNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Kaliumphosphat, dibasischThermowissenschaftlich424195000
Kaliumphosphat, monobasischThermowissenschaftlich424200025
StromquelleBio-Rad23786
Starte Acquire Ultra 1.2.2softWoRx CytivaErhalten Sie mit DV Ultra
Tris BaseFisher-BioreagenzienBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
RöhrenrotatorVWR10136-084
WasserbadVWRWBE10A11B
Wasser, Ultra PureApex Bioresearch Produkte18-194
Granulierter HefeextraktFisher-BioreagenzienBP9727-5

References

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