Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Abstract

Eukaryotische Zellen folgen einem konservierten Zellzyklus, der verschiedene Prozesse reguliert, einschließlich der DNA-Erhaltung und der Organellenhomöostase. Die Untersuchung zellulärer Prozesse in Abhängigkeit vom Zellzyklus ist oft notwendig, um experimentelle Ergebnisse richtig zu interpretieren. Es gibt chemische und genetische Methoden, um die Zellzyklussynchronisation in kultivierten Zellen über eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Wirbeltiermodellen, zu erzeugen, und ermöglichen die Untersuchung von Zellzyklus-abhängigen Prozessen. Unter den Modellorganismen bleibt die knospende Hefe jedoch aufgrund ihrer besonders robusten Synchronisationsmethoden, der kurzen Generationszeit und der genetischen Rückverfolgbarkeit ein Kraftpaket für die Zellzyklusanalyse. Hefe teilt sich die Kernmaschinerie des Zellzyklus mit anderen Eukaryoten, was bahnbrechende Entdeckungen in der Zellzyklusregulation ermöglicht hat. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Zellzyklusanalyse in Hefe, wobei der Schwerpunkt auf G1-Arrest-Release- und mitotischen Arrest-Release-Experimenten liegt, einschließlich Stammkonstruktion, Kulturvorbereitung und Mikroskopie. PCR-Tagging-Methoden zur Herstellung geeigneter Stämme für den Zellzyklus-Arrest und die Fluoreszenzmikroskopie werden vorgestellt. Ein G1-Arrest wird mit dem Peptid Pheromon α-Faktor erreicht, und kurze Waschungen führen zu einer synchronen Freisetzung und Progression des Zellzyklus. Die Proben werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Freisetzung in den Zellzyklus entnommen und für die Mikroskopie fixiert. Eine zweite Methode hält Hefezellen in der Mitose auf, indem der Zellzyklusregulator Cdc20 depletiert wird, um eine metaphasenarrestierte Population zu erreichen, sowie eine optionale Freisetzung in die Anaphase. Die Proben werden fixiert und für die Bildgebung vor und nach der Freigabe vorbereitet, abgebildet und analysiert. Die Bildanalyse konzentriert sich auf die Katalogisierung der dynamischen Lokalisierung und der Populationshäufigkeit von Proteinen im Zellzyklus. Diese Synchronisationsmethoden eignen sich für verschiedene Zellzyklus-Manipulationen, und während ihre Verwendung bei der Bildgebung fixierter Zellen hier hervorgehoben wird, können sie für viele andere Analysen angepasst werden, einschließlich der Bildgebung lebender Zellen sowie biochemischer und molekularer Assays.

Introduction

Die eukaryotische Zellteilung wird durch ein Programm, der Zellzyklus, stark reguliert. Die hochkonservierten und dynamischen Prozesse, die im Zellzyklus ablaufen, machen es an und für sich interessant, sie zu untersuchen, haben aber auch weitreichende Implikationen, die die Untersuchung anderer zellbiologischer Prozesse beeinflussen - zum Beispiel durchlaufen viele Organellen während der Zellteilung einen dramatischen Umbau, und die Häufigkeit und Lokalisation vieler Proteine ist überall stark reguliert ^1,2,3. Obwohl es in Metazoensystemen i....

Protocol

1. Konstruktion von Stämmen für die Zellzyklusanalyse und Bildgebung

1. Entwerfen Sie Primer zur C-terminalen Markierung des interessierenden Gens unter Verwendung von Pringle Tagging Plasmiden (pFA6a-Plasmiden)²⁴. Kurz gesagt, entwickeln Sie F2- und R1-Primer, die bei Verwendung mit einem Plasmid der pFA6a-Serie ein PCR-Produkt erzeugen, das direkt in Hefe umgewandelt werden kann, um eine "markierte" Version des interessierenden Gens zu erzeugen. Verwenden Sie die in Tabelle 1 enthaltenen Primerpaare und Plasmide, um die Gene zu markieren, die in diesem Protokoll von Interesse sind. P....

Results

Die Analyse von Veränderungen in der zellzyklusabhängigen Proteinlokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie kann mit den hier beschriebenen Methoden problemlos durchgeführt werden. Unsere Gruppe interessiert sich schon lange für die dynamische Regulation und Funktion der mitotischen Spindel. In der Hefe fungieren Spindelpolkörper (gekennzeichnet durch die Komponente Spc110) als Mikrotubuli-Organisationszentren, von denen Mikrotubuli-Filamente ausgehen, u.......

Discussion

Die Nutzung der Zellzyklussynchronisation in knospenden Hefen ermöglicht die Untersuchung wichtiger Mechanismen für eine Vielzahl von zellulären Prozessen. Die Verwendung von G1-Arrest-Releases mit α-Faktor-Behandlung ermöglicht das synchrone Fortschreiten einer Zellpopulation durch die Stadien des Zellzyklus und, wie wir gezeigt haben, kann dynamische Lokalisationsmuster von zellulären Regulatoren wie Stu2³⁶ aufdecken. Zellzyklus-Arrests können auch mit genet.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-Faktor	Kernsynthese-Einrichtung der University of Utah		Sequenz: WHWLQLKPGQPMY
1,5 mL Eppendorf-Röhren	Axygen	MCT-175-C
10mM dNTP-Mix	Thermowissenschaftlich	R0193
50-mL konische Röhren	Greiner Bio-One	227 261
5x Phusion HF-Reaktionspuffer	New England BioLabs	B0518S
Essigsäure, glazial	Fisher Chemical	BP2401C-212
Adenin-Hemisulfat-Salz	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Agar, granuliert	Apex Chemikalien und Reagenzien	20-275
Agarose	Apex Bioresearch Produkte	20-102GP
Autoklav Amsco Century Dampfsterilisator	Steris	SV-1262
Autoklaviertes DI-Wasser
Auxin	Sigma-Aldrich	Katze#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille-Laserflüssigkeit	Cargille Laboratories	20130
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihydrochlorid)	Molekulare Sonden	Katze#D1306
Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus Lachshoden	Sigma-Aldrich	D1626
Dextrose	Fisher Chemical	D16-10
Dinatriumethylendiamin-Tetraacetat	Fisher Chemical	S811-10
DMSO	Thermowissenschaftlich	20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
Festgeschwindigkeits-Vortex-Mixer	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluoreszenzmikroskop DV Ultra	Leica	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	Seriennummer #: NV01063. Nicht mehr unterstützt
Formaldehyd	Fisher Chemical	Kat#F79-500
Gel-Apparat	Thermowissenschaftlich	Eule EasyCast B1
GeneRuler DNA-Leiter-Mix	Fermentas	SM0333
Glasperlen	Fisher Scientific	11312A
Glasrutschen	VWR	48300-026
Innova 2300 Plattformschüttler	Neubraunschweig	NB-2300
Kimwipes	Kimtech	06-666
Laborzentrifuge für 1,5-mL-Röhren	Eppendorf	2525
Laborzentrifuge für 50-mL-Röhren	Eppendorf	5804
Lithiumacetat-Dihydrat	Sigma-Aldrich	L4158-250G
Master cycler nexus X2	Eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Mikropipetten p2, p20, p200 und p1000 sowie entsprechende Spitzen	Rainin	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Mikroskopabdeckungsglas	Fisher Scientific	12541014
Nocodazol	Calbiochem	Katze#487928; CAS: 31430-18-9; Los#B35705
Orange G	Sigma-Aldrich	O7252
PFLOCK	Hampton Research	HR2-591
Peptongranuliert	Fisher-Bioreagenzien	BP9725-5
Phusion HF-DNA-Polymerase	New England BioLabs	M0530L
Pipet-X	Rainin	PX-100R
Kaliumphosphat, dibasisch	Thermowissenschaftlich	424195000
Kaliumphosphat, monobasisch	Thermowissenschaftlich	424200025
Stromquelle	Bio-Rad	23786
Starte Acquire Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	Erhalten Sie mit DV Ultra
Tris Base	Fisher-Bioreagenzien	BP152-10
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Röhrenrotator	VWR	10136-084
Wasserbad	VWR	WBE10A11B
Wasser, Ultra Pure	Apex Bioresearch Produkte	18-194
Granulierter Hefeextrakt	Fisher-Bioreagenzien	BP9727-5