Methodenartikel

Dissektion von kraniofazialem Gewebe von Zebrafischen nach Färbung mit Alcian Blue

DOI:

10.3791/68900

⸱

12. September 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das hier beschriebene Protokoll stellt ein einfaches und leicht verständliches Verfahren zum Färben und Präparieren von kraniofazialen Knorpeln bei einer 5 Tage alten Zebrafischlarve dar. Es kann verwendet werden, um die Anatomie, Form und Größe dieser Strukturen unter verschiedenen Entwicklungsbedingungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner optischen Transparenz ein hervorragendes Wirbeltiermodell, um die Mechanismen zu untersuchen, durch die sich kraniofaziale Knorpel im Embryo bilden. Kraniofaziale Knorpel können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, das Neurocranium und das Viszerocranium, die wiederum in zahlreiche Knorpelgruppen unterteilt werden können, die zur Unterstützung des Gehirns notwendig sind und unter anderem den Ernährungs- und Atmungsapparat bilden. In diesem Protokoll wird zunächst ein einfaches und etabliertes Färbeverfahren im Zebrafisch beschrieben, um diese Knorpelgruppen sichtbar zu machen, gefolgt von einer Methodik zur Präparierung und Trennung des Neuro- und des Viszerokraniums. Aus diesen Dissektionen können einfache Form- und Größenmetriken leicht gewonnen werden, und in diesem Protokoll wird dies für den Gaumen demonstriert, der Teil des vorderen Neurokraniums ist, ein Gewebe, das häufig bei den meisten kraniofazialen Erkrankungen beim Menschen betroffen ist. Das Protokoll kann auch in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen auf einfache Weise repliziert werden und bietet somit ein wertvolles Lehrmittel für Studenten im Grundstudium, um in die kraniofaziale Morphologie eingeführt zu werden.

Einleitung

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Der kraniofaziale Knorpel bei Wirbeltieren entspringt einer multipotenten Zellpopulation, die als kraniale Neuralleistenzellen bezeichnetwird 1. Diese Zellen werden in frühen Embryonen zunächst in den dorsalen Rändern der Neuralplatte spezifiziert, die dann große Strecken zurücklegen, um die kraniofaziale Region und die Rachenbögen zu erreichen, bevor sie sich differenzieren 2,3. Die Signalmechanismen, die diese Wanderung und Differenzierung antreiben, sind bei Wirbeltieren weitgehend konserviert 4,5. Trotzdem sind Organisation, Größe und Form der einzelnen Knorpelelemente bei allen Arten unterschiedlich, was zu unterschiedlichen kraniofazialen Morphologien führt6. Insbesondere der Zebrafisch hat sich als leistungsfähiges Modellsystem für die Untersuchung der kraniofazialen Morphogenese herausgestellt, da die Embryonen bis zum Larvenstadium transparent sind. Mit einfachen Färbeverfahren zur Markierung des Knorpels wurde die Morphologie vieler kraniofazialer Strukturen im Zebrafisch unter verschiedenen Störungen der Signalwege charakterisiert 7,8,9 sowie wenn Embryonen oder Larven häufigen Schadstoffen in der Umwelt ausgesetzt sind10. Die hier beschriebene Alcianblau-Färbung zur Markierung des Knorpels beinhaltet die Verwendung von nicht-sauren Bedingungen, die von Walker und Kimmelstandardisiert wurden 11, die anschließend von vielen Zebrafischlaboratorien verwendet wurden, die an der kraniofazialen Entwicklung arbeiten 5,12,13,14,15,16,17,18,19, einschließlich der Beschreibung der Nutzung in der Sekundarstufe20. Durch die säurefreie Färbung bleiben die knöchernen Strukturen intakt, so dass Knorpel und Knochen zusammen mit Alcianblau bzw. Alizarinrot gefärbt werden können. Es fehlt jedoch ein detailliertes Protokoll für die Färbung sowie für die präzise Dissektion der kraniofazialen Knorpel, insbesondere zur Unterstützung solcher Studien in ressourcenbegrenzten Umgebungen.

Obwohl die Gesichtsskelettstruktur bei erwachsenen Zebrafischen ziemlich komplex ist und aus 43 Knorpelknochen besteht21, ist der kraniofaziale Knorpel in einer Larve 5 Tage nach der Befruchtung (dpf), die gerade die Fähigkeit zur Nahrungsaufnahme erworben hat, relativ einfach und kann grob in ein dorsales Neurokranium und ein ventrales Viscerocranium unterteilt werden4. Diese Strukturen stützen das Gehirn, tragen zum Ernährungsapparat bei und führen zu Stützknorpeln für das Kiemengewebe. Das hier beschriebene Protokoll wird es ermöglichen, Zebrafischknorpel mit Alcianblau zu färben, gefolgt von einem detaillierten Verfahren zum Präparieren des Neuros und des Viszerokraniums in separate Strukturen, was letztendlich eine sorgfältige Charakterisierung der Form und Größe verschiedener Knorpel in diesen Strukturen ermöglichen wird. Als Beispiel messen wir die Abmessungen der vorderen Region des Gaumens (Gaumen), der sogenannten Siebbeinplatte, die ein Teil des Neurokraniums ist.

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Protokoll

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Die in dieser Studie verwendeten Erhaltungs- und Versuchsverfahren für Zebrafische wurden von der institutionellen Tierethikkommission unter der Referenz TIFR/IAEC/2023-1 genehmigt.

1. Vorbereitung des Reagenzes

  1. E3-Medien:
    1. Bereiten Sie 50x Stamm 1 vor, indem Sie 3,25 g Natriumphosphat zweibasisch (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g Kaliumdihydrogenphosphat (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g Natriumchlorid (4,084 mM NaCl) und 0,48 g Kaliumchlorid (0,128 mM KCl) in 1 l destilliertem Wasser mischen.
    2. Bereiten Sie 50x Brühe 2 vor, indem Sie 2,43 g Calciumchlorid (0,33 mM CaCl2) und 4,07 g Magnesiumsulfat (0,33 mM MgSO4) in 1 l destilliertem Wasser mischen.
    3. Zur Herstellung von 500 mL 1x E3-Medium zu 480 mL destilliertem Wasser fügen Sie je 10 mL aus den Brühen 1 und 2 (pH = 7,4) hinzu.
      HINWEIS: Tragen Sie während der Zubereitung dieser Lösungen Handschuhe.
  2. 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung):
    1. 100 mL 1x PBS bei 68 °C vorwärmen. 4 g PFA zugeben und die Lösung bei 68 °C unter regelmäßigem Mischen inkubieren, bis das PFA vollständig aufgelöst ist.
      HINWEIS: Tragen Sie bei der Zubereitung dieses Reagenzes Handschuhe und eine Maske, vorzugsweise unter einem Abzug, da PFA hochgiftig ist.
  3. 0,05% ige MS-222 (allgemein bekannt als Tricain) Lösung:
    1. 4% Tricain-Brühe in E3 herstellen und bei 4 °C lagern. Um 10 ml Tricain-Brühe herzustellen, fügen Sie 0,40 g MS-222 in 7 ml E3 hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen mit der Lösung vorsichtig, um es zu mischen, und füllen Sie das Volumen auf 10 ml auf. Um 50 ml 0,05%ige Tricainlösung herzustellen, fügen Sie 625 μl des 4%igen Stammes zu 49,375 ml E3 hinzu.
      HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und eine Maske, während Sie dieses Reagenz vorbereiten.
  4. 0,4 % Alcianblau-Stammlösung in 70 % Ethanol
    1. Zur Herstellung von 2 ml der Stammlösung werden 8 mg Alcianblau in 1 ml 50%igem Ethanol gelöst. Die Lösung 15-20 Minuten lang bei 37 °C erhitzen und regelmäßig mischen, um sie aufzulösen. Sobald sich der Fleck aufgelöst hat, machen Sie die Lösung zu 70 % Ethanol, indem Sie 900 μl 100 % Ethanol und 100 μl destilliertes Wasser hinzufügen.
      HINWEIS: Die Stammlösung kann bis zu 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
  5. Fleckenlösung -- 0,02 % Alcianblau, 200 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) und 70 % Ethanol
    1. Zur Herstellung von 5 ml Alcianblau-Färbelösung 1 mL 1 M MgCl2, 3,5 mL 100 % Ethanol und 250 μL 0,4 % Alcianblau-Fond (8 mg Alcianblau in 2 ml 70 % Ethanol) zu 250 μl Wasser geben und gut mischen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Fleckenlösung frisch vor, um ein optimales Färbeergebnis zu erzielen.
  6. Bleichlösung:
    1. Mischen Sie gleiche Volumina von 3 % Wasserstoffperoxid (H2O2) und 2 % Kaliumhydroxid (KOH). Um 2 ml Bleichlösung herzustellen, mischen Sie 1 ml 3% Wasserstoffperoxid und 1 ml 2% Kaliumhydroxid.
      HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung frisch vor, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen. Da H2O2 lichtempfindlich ist, schützen Sie es so weit wie möglich vor Lichteinwirkung. Tragen Sie beim Umgang mit H2, O2 und KOH Handschuhe.
  7. Lösung I: 20 % Glycerin + 0,25 % KOH
    HINWEIS: Da Glycerin hochviskos ist, pipettieren Sie mit Vorsicht. Tragen Sie bei der Zubereitung dieser Lösungen Handschuhe.
    1. Zur Herstellung von 5 ml Lösung I fügen Sie 2 ml 50 % Glycerin und 625 μl 2 % KOH zu 2,375 ml Wasser hinzu und mischen Sie gut.
  8. Lösung II: 50 % Glycerin + 0,25 % KOH
    1. Zur Herstellung von 5 ml Lösung II 3,570 ml 70 % Glycerin und 625 μl 2 % KOH zu 805 μl Wasser hinzufügen und gut mischen.
  9. Lagerlösung: 50 % Glycerin + 0,1 % KOH
    1. Zur Herstellung von 5 ml Aufbewahrungslösung 3,570 ml 70 % Glycerin und 250 μl 2 % KOH zu 1,180 ml Wasser hinzufügen und gut mischen.
  10. 3% Agarose
    1. 3 g Agarose in 100 ml destilliertem Wasser auflösen. Mikrowelle, bis die Lösung klar ist.
  11. 0,1 % PBST (0,1 % Tween 20 in 1x PBS)
    1. Um 1 l 1x PBS herzustellen, fügen Sie 8 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 in 1.000 mL destilliertes Wasser hinzu. Mischen Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Um 500 ml 0,1 % PBST zu erhalten, fügen Sie 5 ml 10 % Tween 20 bis 495 ml 1x PBS hinzu.
  12. 0,50 μg/ml DAPI-Lösung
    1. Stellen Sie 10 mg/mL DAPI-Aktien in 1x PBS her. Um 10 mL 0,50 μg/ml DAPI-Lösung herzustellen, fügen Sie 0,50 μl des Stoffes zu 10 mL 1x PBS hinzu und schütteln Sie es kräftig, um sicherzustellen, dass sich DAPI vollständig auflöst.
      HINWEIS: Tragen Sie bei der Zubereitung dieser Lösungen Handschuhe. Schützen Sie DAPI vor Licht, da es lichtempfindlich ist. Der DAPI-Vorrat kann bei 4 °C länger als ein Jahr gelagert werden.

2. Entnahme von Embryonen

  1. Setzen Sie am Abend vor der Embryonenanforderung Paare aus männlichen und weiblichen Zebrafischen in Zuchtbecken ein, wobei männliche und weibliche Fische durch Barrieren getrennt sind.
  2. Entfernen Sie die Barrieren am nächsten Morgen und entnehmen Sie die Embryonen innerhalb von 15-20 Minuten nach der Entfernung der Barrieren.
    HINWEIS: Der Zeitpunkt der Entfernung der Barriere ist hilfreich bei der Stadienlagerung von Zebrafischembryonen und -larven.
  3. Die Embryonen werden bei 28,5 °C aufgezogen, bis sie 5 dpf erreichen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, das E3-Medium alle 2 Tage durch eine frische Charge vorgewärmtes E3 bei 28,5 °C zu ersetzen.

3. Alcian-Blau-Färbung

HINWEIS: Tragen Sie bei der Durchführung dieses Experiments Handschuhe

  1. Betäuben Sie 20-25 5 Tage alte Zebrafischlarven mit 0,05 % Tricain in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (MCT).
  2. Nachdem sich die Larven nicht mehr bewegen, was in der Regel ~4-5 Minuten dauert, entfernen Sie das Anästhetikum und fixieren Sie sie in 1,5 ml 4% PFA bei Raumtemperatur (RT) auf einer Wippe bei 60 U/min für 2 h.
  3. Entfernen Sie mit einer Pipette so viel wie möglich des Fixiermittels und geben Sie 1,5 ml 50 % Ethanol in die Probe. 10 min inkubieren, während Sie bei 60 U/min bei RT schaukeln.
  4. Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich mit einer Pipette und fügen Sie 1,5 ml der Alcianblau-Fleckenlösung hinzu.
  5. Inkubieren Sie die fixierten Larven in der Fleckenlösung für 18-20 h auf einer Wippe bei 60 U/min bei RT.
    HINWEIS: Eine kürzere oder längere Inkubationszeit kann dazu führen, dass bestimmte Regionen des Knorpels unter- bzw. überfärbt sind. Hier schienen 18-20 Stunden Färbung am besten zu funktionieren, um das Neuro und das Eingeweide einer 5 Tage alten Larve deutlich sichtbar zu machen.
  6. Entfernen Sie die Fleckenlösung, fügen Sie 1,5 ml destilliertes Wasser hinzu und inkubieren Sie 1-2 Minuten lang auf einer Wippe bei RT.
    HINWEIS: Die Färbung kann in diesem Schritt gestoppt werden, um die Zellgrenzen in den präparierten Knorpeln sichtbar zu machen. Ein Nachteil des Stoppens des Färbeprotokolls in diesem Schritt ohne Durchführung nachfolgender Reinigungsschritte besteht jedoch darin, dass die Grenzen zwischen Neuro und Viscerocranium immer noch leicht verschwommen bleiben und es schwieriger wird, die Dissektionen präzise durchzuführen.
  7. Geben Sie 1 ml der Bleichlösung in die Probe und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT im Freien ohne Abdeckung der Platte oder der Vertiefungen.
    HINWEIS: Decken Sie die MCTs während dieses Schritts nicht ab, da bei der Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und Kaliumhydroxid Sauerstoffgas entsteht, das dazu führen kann, dass die Abdeckung abspringt, wenn sie geschlossen ist.
  8. Entfernen Sie die Bleichlösung und führen Sie die folgenden Schritte zur Gewebereinigung durch.
    1. Geben Sie 1,5 mL Lösung I in die Probe und lassen Sie sie 40 Minuten lang bei RT bei 60 U/min auf einer Wippe.
    2. Entfernen Sie Lösung I und geben Sie 1,5 mL Lösung II in die Probe und lassen Sie sie 2 h lang bei RT bei 60 U/min auf einer Wippe.
      HINWEIS: Die Reinigungsschritte helfen, den überschüssigen Fleck zu entfernen, die optische Klarheit der Proben zu verbessern und so die Dissektionen effizient durchzuführen. Gehen Sie beim Wechsel der Lösungen vorsichtig mit den Proben um, da jede Beschädigung die zukünftige Analyse ihrer Morphologie beeinträchtigen kann.
  9. Entfernen Sie Lösung II und fügen Sie 1,5-2 mL der Aufbewahrungslösung hinzu. Aufgrund des Vorhandenseins von Glycerin sinken die gefärbten Proben innerhalb von 10 Minuten allmählich zu Boden.
    HINWEIS: Gefärbte Proben können mehr als ein Jahr bei 4 °C gelagert werden.

4. Dissektion des kraniofazialen Skeletts

  1. Schmelzen Sie die 3%ige Agaroselösung in der Mikrowelle, bis die Lösung klar wird.
    HINWEIS: Nicht überhitzen, da die Lösung aus dem Kolben sprudeln kann. Überprüfen Sie die Lösung sorgfältig, während Sie diesen Schritt ausführen.
  2. Eine 90 mm große Petrischale mit 3 % Agarose bestreichen, indem die geschmolzene Agarose gegossen wird, bis ein Drittel der Tiefe der Petrischale bedeckt ist, und sie fest werden lässt. In dieser Petrischale werden Sezierungen durchgeführt.
    HINWEIS: Die Petrischalen mit Agarose-Beschichtung können eine Woche im Voraus zubereitet und bei 4 °C gelagert werden. Die Agarosebeschichtung bietet einen weicheren Untergrund, auf dem die Dissektionen durchgeführt werden können, ohne die Pinzette zu beschädigen.
  3. Reinigen Sie die zu verwendende Pinzette mit 70% Ethanol und wischen Sie sie mit einem sauberen Stück Standard-Laborseidenpapier ab.
  4. Übertragen Sie mit einer Pasteur-Pipette 3-4 gefärbte Larven zusammen mit 0,5 ml Aufbewahrungslösung in die mit Agarose beschichtete Petrischale.
    HINWEIS: Die Speicherlösung sorgt für mehr optische Klarheit bei der Durchführung der Dissektionen im Vergleich zur E3.
  5. Richten Sie eine fleckige Larve auf die Seite (Abbildung 1A) und kratzen Sie das Eigelb vorsichtig mit der Pinzette vom Körper der Larve ab
    HINWEIS: Abbildung 1B zeigt einen Embryo, bei dem das Eigelb entfernt wurde. Es empfiehlt sich, den vom Dotter abgeschabten Embryo in eine neue Petrischale zu übertragen, bevor mit weiteren Dissektionsschritten fortgefahren wird, damit die herumschwebende klebrige Dottermasse die Dissektion nicht beeinträchtigt.
  6. Nachdem das Eigelb entfernt wurde, halten Sie die Larve mit einer Pinzette an der Schwanzregion fest und entfernen Sie mit der anderen vorsichtig die Augen.
    HINWEIS: Abbildung 1C zeigt einen Embryo, bei dem das Eigelb und die Augen entfernt wurden. Die Augen sollten mit Vorsicht entfernt werden, da ihre Nähe zum kraniofazialen Skelett die Dissektion beeinträchtigen kann.
  7. Ziehen und kneifen Sie mit der Pinzette vorsichtig das Gehirn und andere Gewebe dorsal des Neurokraniums ab. Halten Sie die Larve mit einer Pinzette still und verwenden Sie die andere Pinzette, um einen Schnitt in der Mitte zu machen (Abbildung 1C, roter Pfeil), gefolgt von einem Abkneifen des Gewebes (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Seien Sie bei der Durchführung dieses Schritts vorsichtig bei der Entfernung des Gewebes, das näher an den vordersten Regionen des Neurokraniums liegt, da sich der Knorpel mit ihnen lösen kann.
  8. Trennen Sie den Kopf der Larve vom restlichen Körper. Die Kopfregion nach diesem Schritt enthält hauptsächlich das Neurocranium und das Eingeweide, die an zwei Punkten - am vorderen und hinteren Ende - miteinander verbunden sind, zusammen mit einigen kleinen ungefärbten Geweben, die an diesen kraniofazialen Strukturen befestigt sind (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Es ist schwierig, das ungefärbte Gewebe, das direkt am Neurokranium und am Viszerokranium befestigt ist, vollständig zu entfernen. Auch wenn einige Restgewebe vorhanden sein werden, hat ihr Vorhandensein keinen Einfluss auf die nachgelagerte Form- oder Größenanalyse, da sie unverfärbt sind.
  9. Trennen Sie vorsichtig die beiden Verbindungen zwischen dem Neurokranium und dem Viszerocranium, um sie zu trennen (Abbildung 1F, rote gestrichelte Linien). Siehe Abbildung 2 für Bilder des Neurokraniums und des Viszerocraniums sowohl bei intakten als auch bei präparierten Embryonen.
  10. Geben Sie auf einen sauberen Objektträger ein oder zwei Tropfen 100% Glycerin. Übertragen Sie mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig das präparierte Neurokranium oder Viszerokranium auf diesen Objektträger. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig ein Deckglas auf diese Taschentücher zu legen, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden, und versiegeln Sie das Deckglas auf allen Objektträgern mit Nagellack.
    HINWEIS: Diese Objektträger können mehr als ein Jahr lang bei 4 °C gelagert werden, ohne dass der Fleck verloren geht.

5. Quantifizierung der Abmessungen der Siebbalplatte

  1. Nehmen Sie Bilder des Gaumens mit einer Kamera auf, die am Stereomikroskop befestigt ist (Abbildung 2D). Wenn Sie keine wissenschaftliche Kamera haben, schließen Sie ein Standard-Smartphone an das Stereomikroskop an, um Bilder aufzunehmen.
  2. Laden Sie zur Quantifizierung das Bild eines Gaumens in FIJI22 und verwenden Sie dann das Linienwerkzeug, um die Breite und Höhe der Siebbeinplatte in Mikrometern zu messen (siehe Abbildung 3A-C) und bestimmen Sie die Abmessungen mit der Pixelauflösung der Kamera.
  3. Zeichnen Sie einen Umriss um die Siebbeinplatte und klicken Sie auf Analysieren | Maße einstellen | Fläche, um die Fläche der Siebbeinplatte zu erhalten (Abbildung 3D,E).

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Ergebnisse

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Das kraniofaziale Skelett des Zebrafisches ist 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) vollständig knorpelig und kann daher mit Alcianblau gefärbt werden, einem basischen Farbstoff, der in der Lage ist, an Glykosaminoglykane zu binden, die in Knorpeln reichlich vorhanden sind23. Dies führt dazu, dass der Knorpel blau gefärbt wird (Abbildung 1), so dass er mit einem Standard-Stereomikroskop, das in den meisten Laborumgebungen für Studenten verfügbar ist, von anderen in der L...

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Diskussion

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Kraniofaziale Fehlbildungen machen einen Großteil aller Geburtsfehler beim Menschen aus und führen häufig zur Säuglingssterblichkeit. Die zugrunde liegende Ätiologie bei den meisten kraniofazialen Anomalien muss jedoch noch geklärt werden25. Kraniofaziale Strukturen sind bei jedem Wirbeltier komplex, und aus der Perspektive eines Grundstudiums besteht die erste Voraussetzung daher darin, ein Bildungsinstrument zu haben, das den Studenten einen allgemeinen Überblic...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Kalidas Kohale und seinem Team für die Instandhaltung der Fischanlage. SRN dankt der finanziellen Unterstützung durch das Department of Atomic Energy (DAE) der indischen Regierung (Projektidentifikationsnummer RTI4003, DAE OM Nr. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 vom 11.02.2020), das Programm der Partnergruppe der Max-Planck-Gesellschaft (M.PG. A MOZG0010) und dem Science and Engineering Research Board Start-up Research Grant (SRG/2023/001716). Wir danken Dr. Shweta Verma vom Labor für die aufschlussreichen Kommentare. Wir danken Swetha Nagarajan und Upal Chatterjee für ihre Hilfe bei der Erstellung von Figuren für das Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseLonza Biowissenschaften50004Zum Beschichten von Petrischalen
Alcian blau 8G Sigma-AldrichNr. A3157Zum Färben von Knorpeln
Calciumchlorid-DihydratSigma-Aldrich12022Zur Herstellung von Puffern
KameraOlympDP28Für die Aufnahme von Bildern
DAPIRoche Biowissenschaften10236276001Zur Markierung von Zellkernen
EthanolHoneywell32221Lösungsmittel für Alcianblau-Fleck
FIDSCHIAusführung: ImageJ 1.54f
ZangeDumontDumontZur Durchführung von Präparierungen
GlycerinMP Biomedizin193996Zum Herstellen von Waschungen und zum Einbetten von Proben 
WasserstoffperoxidMP Biomedizin194057Zur Herstellung von Bleichlösung
Magnesiumchlorid-HexahydratSARD BiowissenschaftenSBRC0217Zur Herstellung von Puffern
Magnesiumsulfat-HeptahydratSigma-AldrichNr. M2773Zur Herstellung von Puffern
MS-222 (Tricain)Sigma-AldrichNr. A5040Zur Betäubung von Larven
KaliumchloridSigma-AldrichNr. P9541Zur Herstellung von Puffern
KaliumhydroxidSigma-Aldrich484016Zur Herstellung von Puffern
Kaliumphosphat einbasischSigma-AldrichNr. P0662Zur Herstellung von Puffern
NatriumchloridSigma-AldrichNr. S3014Zur Herstellung von Puffern
Natriumphosphat zweibasischSigma-Aldrich71640Zur Herstellung von Puffern
StereoskopOlympSZX61Zur Durchführung von Präparierungen
Tween-20HIMEDIATC287Detergens, das zur Permeabilisierung der Zellen verwendet wird

Referenzen

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Kraniofaziale Dissektion beim Zebrab rblingAlcianblau F rbungkraniofazialer KnorpelNeurokranium DissektionViscerokranium DissektionEthmoidplatteGaumenmorphogeneseLichtblattmikroskopieGewebeaufhellungBildanalyse

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