Diese Studie untersucht zirkadiane Variationen in der Freisetzung von Wachstumsfaktoren durch plättchenreiches Fibrin (PRF) und untersucht Korrelationen mit dem Cortisolspiegel, mit dem Ziel, das Timing von PRF-basierten regenerativen Verfahren zu optimieren.
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Forschungsartikel
Bewertung der zirkadianen Variation der Wachstumsfaktoren von plättchenreichem Fibrin: Eine Pilotstudie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Plättchenreiches Fibrin (PRF) hat umfangreiche klinische Anwendungen in der Zahnmedizin, insbesondere bei der Regeneration von Weich- und Hartgeweben, der Heilung von Extraktionsalveolen, der Behandlung von parodontalen Defekten, der Sinusaugmentation und mukogingivalen Eingriffen. PRF ist ein aus Blutplättchen gewonnenes, wachstumsfaktorreiches Biomaterial, das über ein einstufiges Zentrifugationsprotokoll hergestellt wird. Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob PRF-abgeleitete Wachstumsfaktoren zirkadiane Schwankungen zwischen den Morgen- und Abendstunden aufweisen. Zwanzig gesunde Freiwillige nahmen teil und gaben jeweils sechs venöse Blutproben ab, drei um 08:00 Uhr und drei um 20:00 Uhr. Von jedem Zeitpunkt an wurde ein Röhrchen für das vollständige Blutbild, eines für die Serum-Cortisol-Analyse und eines für die PRF-Vorbereitung (zentrifugiert bei 708 x gfür 12 Minuten) verwendet. Wachstumsfaktoren (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) in PRF wurden nach 24 h und 72 h mittels ELISA gemessen. Ihre Spiegel wurden zwischen den Zeitpunkten verglichen und mit dem Serum-Cortisolspiegel korreliert. Die FGFR-Gehalte waren nach 72 h signifikant höher als nach 24 h in abendlichen Proben. Für IGF-1, PDGF, VEGF oder TGFβ-1 wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen morgens und abends gefunden. Die Cortisolspiegel waren bei morgendlichen Proben nach 72 h und bei abendlichen Proben nach 72 h negativ mit IGF-1 korreliert; Es wurden jedoch keine weiteren signifikanten Korrelationen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Zeitpunkt der Blutentnahme keinen signifikanten Einfluss auf den Gehalt an PRF-Wachstumsfaktoren hat, was auf Flexibilität in den klinischen Protokollen in Bezug auf den Probenzeitpunkt hinweist.
Einleitung
Plättchenreiches Fibrin (PRF) ist ein Thrombozytenkonzentrat der zweiten Generation, das aufgrund seines autologen Ursprungs, seiner einfachen Zubereitung und seines biologisch aktiven Gehalts häufig in der regenerativen Zahnheilkunde verwendet wird1. PRF wird durch Zentrifugation von Vollblut ohne Antikoagulanzien gebildet und liefert eine Fibrinmatrix, die reich an Blutplättchen und Leukozyten ist, die Wachstumsfaktoren wie den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), den transformierenden Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-β1), den insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGFr) sezernieren. Diese Biomoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Zellproliferation, der Angiogenese, dem Umbau der extrazellulären Matrix und der Geweberegeneration2. Im Vergleich zu plättchenreichem Plasma (PRP), das Antikoagulanzien und exogene Aktivierung erfordert, wird PRF über einen einstufigen, gerinnungsfreien Prozess hergestellt, der ein physiologisches Fibringerüst mit eingeschlossenen Leukozyten und Blutplättchen ergibt. Diese Architektur unterstützt eine langsamere, nachhaltigere Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, was die Wundstabilität und die frühzeitige Gewebereparatur verbessern und gleichzeitig die Komplexität der Handhabung und die Kosten reduzieren 1,2. Darüber hinaus minimiert das Fehlen von Antikoagulanzien und Aktivatoren die manipulationsbedingte Variabilität und kann das native Thrombozytenverhalten besser erhalten, was praktische Vorteile für den Einsatz am Behandlungsstuhl und die Standardisierung zwischen den Bedienernbietet 2.
Trotz seiner weit verbreiteten klinischen Anwendung ist die zeitliche Dynamik der bioaktiven Komponenten von PRF nach wie vor wenig verstanden. Der zirkadiane Rhythmus, ein intrinsischer biologischer 24-Stunden-Zyklus, beeinflusst verschiedene physiologische Systeme, einschließlich der Immunfunktion, der Hormonsekretion und hämatologischer Parameter 3,4. Cortisol, das primäre zirkadiane Hormon, erreicht am frühen Morgen seinen Höhepunkt und nimmt im Laufe des Tages allmählich ab5. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Thrombozytenaktivität, die Aggregationskapazität und die Anzahl der Thrombozyten auch durch zirkadiane Mechanismen moduliert werden können, was Auswirkungen auf die Gerinnung und die Wundheilung hat6.
Da PRF direkt aus dem peripheren Blut gewonnen wird, könnte der zirkadiane Zeitpunkt der Blutentnahme möglicherweise den Thrombozytenaktivierungsstatus und die anschließende Freisetzung von Wachstumsfaktoren während der Fibrinpolymerisation beeinflussen. Obwohl die täglichen Schwankungen der Thrombozytenzahl und der Wachstumsfaktoren in plättchenreichem Plasma zuvor von Aoto et al. analysiert wurden7, gibt es keine Studien, die systematisch untersuchen, ob PRF, das zu verschiedenen Tageszeiten hergestellt wurde, messbare Unterschiede in seiner Zusammensetzung der Wachstumsfaktoren aufweist. Daher zielt diese Pilotstudie darauf ab, die zirkadiane Variation von PRF-abgeleiteten Wachstumsfaktoren zu untersuchen, indem morgens und abends Proben von gesunden Personen verglichen werden. Darüber hinaus untersuchten wir die Cortisolspiegel im Serum zu jedem Zeitpunkt und untersuchten ihre Korrelationen mit der Freisetzung von PRF-Wachstumsfaktoren. Das Verständnis dieser zeitlichen Variabilität kann dazu beitragen, klinische Protokolle zu optimieren und zur Standardisierung von PRF-basierten regenerativen Behandlungen beizutragen. Die Nullhypothese dieser Studie war, dass der zirkadiane Zeitpunkt der Blutentnahme die Konzentration von Wachstumsfaktoren, die aus plättchenreichem Fibrin (PRF) freigesetzt werden, nicht signifikant beeinflusst; Basierend auf der bekannten zirkadianen Regulation der Thrombozytenaktivität und der Hormonsekretion wurde jedoch zunächst die Hypothese aufgestellt, dass der Zeitpunkt der Blutentnahme (morgens vs. abends) den Gehalt an PRF-Wachstumsfaktoren verändern kann. Aus klinischer Sicht ist die Klärung, ob der Gehalt an PRF-Wachstumsfaktoren empfindlich auf zirkadiane Schwankungen reagiert, wichtig für die Standardisierung regenerativer Protokolle. Wenn die Freisetzung von Wachstumsfaktoren über den Tag hinweg weitgehend stabil bleibt, können Ärzte beruhigt sein, dass der Zeitpunkt der Venenpunktion die Behandlungsergebnisse nicht wesentlich beeinflusst, was eine flexible Planung der Verfahren ermöglicht. Treten hingegen subtile Unterschiede bei ausgewählten Faktoren auf, wie z. B. bei der Angiogenese oder der Gewebereparatur, könnte der Zeitpunkt der Blutentnahme in Fällen optimiert werden, in denen ein maximales Regenerationspotenzial gewünscht wird, z. B. bei beeinträchtigten Heilungsbedingungen.
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Protokoll
Diese Studie wurde an der Abteilung für Parodontologie der Fakultät für Zahnmedizin der Universität Çukurova, Adana, Türkei, unter Beteiligung von 20 gesunden Freiwilligen durchgeführt. Vor der Aufnahme wurden alle Teilnehmer über das Ziel, die Methodik und die Verfahren der Studie informiert und eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die ethische Zulassung wurde von der Ethikkommission für klinische Forschung der Medizinischen Fakultät der Universität Çukurova erteilt (Genehmigung Nr.: 125/55, Datum: 16.09.2022). Alle Verfahren, einschließlich der grundlegenden Biosicherheitshinweise für den Umgang mit menschlichem Blut und der Anweisungen zur Abfallentsorgung für biologisch gefährliche Materialien und chemische Reagenzien, wurden in Übereinstimmung mit den NIH-CDC-Richtlinien8 durchgeführt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Auswahl der Teilnehmer
Die Teilnehmer der Studie waren gesunde Personen im Alter zwischen 18 und 25 Jahren, ohne bekannte systemische Erkrankung, die während der Eingriffe eine angemessene Kooperation zeigten. Personen wurden ausgeschlossen, wenn sie an einer systemischen Erkrankung litten, schwanger waren oder stillten oder Medikamente oder Hormone einnahmen, die hämatologische oder hormonelle Parameter beeinflussen könnten.
2. Blutentnahme und Gruppeneinteilung
Von jedem Teilnehmer wurden insgesamt sechs 10 ml venöse Blutproben entnommen, drei am Morgen (08:00 Uhr) und drei am Abend (20:00 Uhr). In der Studie wurden sterile PRF-Röhrchen aus additivfreiem Glas (10 ml) verwendet. In der Vormittagssitzung wurde Sonde 1 für das vollständige Blutbild (CBC), Sonde 2 für die Serumcortisolanalyse und Sonde 3 für die PRF-Vorbereitung, gefolgt von einer Wachstumsfaktoranalyse, verwendet. In der Abendsitzung wurde Sonde 4 für das CBC, Sonde 5 für die Serumcortisolanalyse und Sonde 6 für die PRF-Vorbereitung und Wachstumsfaktoranalyse verwendet. Basierend auf dem Zeitpunkt der Blutentnahme wurden die Proben in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 bestand aus reinem PRF, das aus Morgenblut (08:00 Uhr) hergestellt wurde, und Gruppe 2 bestand aus reinem PRF, das aus Abendblut (20:00 Uhr) hergestellt wurde.
3. PRF Vorbereitung
Die Blutproben wurden bei 708 x g für 12 min bei Raumtemperatur mit einer Zentrifuge zentrifugiert, die mit einem 40°-Festwinkelrotor und 10-ml-Glasröhrchen ausgestattet war. Das verwendete Gerät verfügte über einen zwischen 88 mm und 110 mm einstellbaren Rotorradius; In dieser Studie wurde ein Radius von 88 mm gewählt, um das Protokoll zu standardisieren. Während des Eingriffs wurden keine Antikoagulanzien verwendet. Nach der Zentrifugation wurde die resultierende PRF makroskopisch ausgewertet, um eine korrekte Bildung zu gewährleisten, die sich durch eine glatte und homogene Oberfläche, eine elastische und zylindrische Form und eine kompakte, feste Konsistenz auszeichnet.
4. Wachstumsfaktor-ELISA-Analyse
PRF-Gerinnsel wurden mit einer sterilen Schere vorsichtig von der Schicht der roten Blutkörperchen getrennt. Jedes Gerinnsel wurde gewogen und RPMI-1640 Kulturmedium wurde im Verhältnis 1:1 basierend auf dem Gewicht (g = ml) hinzugefügt, um die Inkubationsumgebung über alle Proben hinweg zu standardisieren und eine konsistente Diffusion löslicher Wachstumsfaktoren aus der PRF-Matrix zu gewährleisten. Dieses Verhältnis ermöglicht eine proportionale Extraktion basierend auf der Gerinnselgröße, wodurch die Variabilität der Wachstumsfaktorkonzentrationen aufgrund ungleicher Gerinnselmassen minimiert wird. Die Proben wurden in einem Orbitalschüttler bei 100 U/min und 3 °C für 24 h und 72 h inkubiert, um eine gleichmäßige Diffusion der Wachstumsfaktoren aus der PRF-Matrix in das Kulturmedium zu fördern. Nach der Inkubation wurden die Überstände gesammelt und bis zur Analyse bei -8 °C gelagert. Die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren wurden unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits, einschließlich FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF und TGF-β1, gemäß dem Vorbereitungsprotokoll des Herstellersquantifiziert 9,10.
5. ELISA-Schritte
Standards und Proben (je 100 μL) wurden in die Vertiefungen gegeben und 90 Minuten lang bei 3 °C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden 100 μl Biotin-markierter Antikörper in jede Vertiefung gegeben und 60 Minuten lang bei 3 °C inkubiert, gefolgt von drei weiteren Waschgängen. Dann wurden 100 μl Meerrettichperoxidase (HRP)-Lösung zugegeben und 30 Minuten lang bei 3 °C inkubiert. Nach weiteren drei Wäschen wurden 100 μl Substratreagenz zugegeben und 15 Minuten lang inkubiert. Schließlich wurden 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung gegeben und die Absorption bei 450 nm gemessen.
6. Statistische Analyse
Kategoriale Variablen wurden als Häufigkeiten und Prozentsätze ausgedrückt, während numerische Daten als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Minimum-Maximum) dargestellt wurden. Die Normalverteilung der numerischen Variablen wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet. Variablen, die nicht der Normalitätsannahme entsprachen, insbesondere die Wachstumsfaktorkonzentrationen und Cortisolspiegel, wurden mit nicht-parametrischen Tests analysiert, einschließlich des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests für paarweise Vergleiche und des Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten für Assoziationen. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software IBM SPSS Statistics durchgeführt. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Vergleiche wurden innerhalb des Subjekts zur Kontrolle der interindividuellen Variabilität durchgeführt.
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Ergebnisse
Alle 20 freiwilligen Teilnehmer (10 weibliche und 10 männliche Teilnehmer im Alter zwischen 18 und 25 Jahren) schlossen die Studie ohne Stichprobenverlust ab. Die vollständigen Blutbildergebnisse bestätigten, dass die Thrombozyten- und hämatologischen Parameter in allen Proben innerhalb der normalen Referenzbereiche lagen, was die Zuverlässigkeit der PRF-Präparate bestätigt.
Vergleich der Blutparameter zwischen morgens und abends
Die Cortisolspiegel waren in den morgendlich...
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Diskussion
Basierend auf der bekannten zirkadianen Regulation der Thrombozytenaktivität und der Hormonsekretion wurde zunächst die Hypothese aufgestellt, dass der Zeitpunkt der Blutentnahme (morgens vs. abends) den Gehalt an PRF-Wachstumsfaktoren verändern kann. Ziel dieser Studie war es, zu testen, ob eine solche zeitliche Variation existiert und wenn ja, ob sie mit dem Serumcortisolspiegel und hämatologischen Parametern korreliert. Die Studie wurde als Pilotstudie konzipiert, um die zirk...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ZRIEFUGEN-MASCHINE | DUO | 913023410238 | |
| ELISA-KITS | Feiner Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Katalog-Nr.:EH0165) | |
| ELISA-KITS | Feiner Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (Katalognummer:EH3531) | |
| ELISA-KITS | Feiner Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (Katalog-Nr.:EH0715) | |
| ELISA-KITS | Feiner Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (Katalog-Nr.: EH0327) | |
| ELISA-KITS | Feiner Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-Β 1(Katalog-Nr.: EH0287) | |
| PRF-Rohre |  | 6370 |
Referenzen
- Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
- Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
- Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
- Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
- Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
- Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
- Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
- Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
- ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
- Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
- Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
- Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
- Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
- Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
- Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
- Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
- Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
- McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
- Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
- Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
- Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
- Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
- Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
- Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
- Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
- Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
- Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
- Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
- Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
- Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
- Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).
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