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Methodenartikel

Etablierung und Pflege von patienteneigenen Prostatakrebs-Organoiden: Ein detailliertes experimentelles Protokoll

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DOI:

10.3791/68912

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14. November 2025

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1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Heterogenität des Prostatakarzinoms und die Resistenz gegen die Behandlung bleiben Herausforderungen. Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die wichtige elterliche Tumoreigenschaften erhalten. Dieses standardisierte Modell unterstützt das Wirkstoffscreening und die Weiterentwicklung der Präzisionsmedizin.

Zusammenfassung

Prostatakrebs (PCa) ist eine hochgradig heterogene bösartige Erkrankung und eine der Hauptursachen für krebsbedingte Mortalität bei Männern, mit erheblichen klinischen Herausforderungen bei der Bewältigung von Behandlungsresistenz und Krankheitsprogression. Bestehende präklinische Modelle, wie z. B. zweidimensionale (2D) Zelllinien und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDXs), haben Einschränkungen bei der getreuen Rekapitulation der Komplexität von PCa, einschließlich der Tumorheterogenität, der Androgenrezeptor (AR)-abhängigen Signalgebung und der Wechselwirkungen in der Mikroumgebung. Um diese Lücke zu schließen, stellt diese Studie ein robustes und reproduzierbares Protokoll für die Etablierung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) vor, die die genetischen, phänotypischen und histologischen Merkmale der elterlichen Tumoren erhalten. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Organoiden sowohl aus lokalisiertem als auch aus fortgeschrittenem PCa und bietet ein biologisch relevantes Modell für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, des Ansprechens auf Medikamente und der Entdeckung von Biomarkern. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Protokolls, Organoide aus einer Vielzahl klinischer Proben zu generieren, die im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und in der Präzisionsmedizin eingesetzt werden können. Durch das Angebot eines standardisierten Arbeitsablaufs, der wichtige technische Herausforderungen adressiert, unterstreicht diese Studie die Bedeutung von PDOs als vielseitige Instrumente für die Förderung der Prostatakrebsforschung und die Entwicklung effektiverer therapeutischer Strategien.

Einleitung

Prostatakrebs (PCa) ist nach wie vor eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen bei Männern weltweit und nach Lungenkrebs die zweithäufigste krebsbedingte Mortalität. Jüngsten epidemiologischen Studien zufolge ist die weltweite Inzidenz von PCa stetig gestiegen, und es wird prognostiziert, dass die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen von Prostatakrebs von 1,4 Millionen im Jahr 2020 auf 2,9 Millionen im Jahr 2040 steigenwird 1. Trotz Fortschritten in der Früherkennung und der Entwicklung neuartiger Therapien, einschließlich der Androgenentzugstherapie (ADT) und zielgerichteter Wirkstoffe, bleibt Prostatakrebs aufgrund seiner Heterogenität und der unvermeidlichen Entwicklung von Behandlungsresistenzen, insbesondere in fortgeschrittenen Stadien2, eine bedeutende klinische Herausforderung. Der kastrationsresistente Prostatakrebs (CRPC), der nach ADT-Versagen auftritt, stellt eine tödliche Form der Erkrankung dar, die durch schlechte Überlebenschancen und begrenzte Therapieoptionen gekennzeichnetist 3. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die das Fortschreiten der Krankheit und die Resistenz antreiben, ist daher entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Verbesserung der Patientenergebnisse.

Die Entwicklung präklinischer Modelle, die die Komplexität des menschlichen Prostatakrebses genau nachahmen, ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Forschung auf diesem Gebiet. Traditionelle 2D-Zellkulturen sind zwar weit verbreitet, können aber die in vivo beobachtete zelluläre Heterogenität, Tumorarchitektur und Mikroumgebung nicht rekapitulieren 4. Infolgedessen ist der translationale Nutzen dieser Modelle begrenzt, insbesondere für die Untersuchung der Tumorprogression, der Arzneimittelresistenz und der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumormikroumgebung5. Im Gegensatz dazu haben sich patienteneigene Xenotransplantate (PDXs) und Organoidkulturen als ausgefeiltere Werkzeuge herausgestellt, um die Lücke zwischen konventionellen Zelllinien und klinischen Tumoren zu schließen 4,5,6.

Organoide Kultursysteme haben die Krebsmodellierung revolutioniert. Diese dreidimensionalen (3D) Strukturen stammen aus Patientengeweben und können die histologischen, genomischen und phänotypischen Merkmale des ursprünglichen Tumors beibehalten 7,8,9,10. Wichtig ist, dass Prostatakrebs-Organoide kritische Merkmale der Krankheitsheterogenität beibehalten, einschließlich AR-Signalwege, Resistenz gegen Behandlung und genomische Instabilität, was sie zu idealen Werkzeugen für die translationale Forschung macht11. Im Vergleich zu PDX-Modellen sind Organoide kostengünstiger, skalierbarer und anfälliger für genetische Manipulationen, was das Wirkstoffscreening mit hohem Durchsatz, die Entdeckung von Biomarkern und funktionelle Studien erleichtert. Organoid-Plattformen haben bereits vielversprechende Ergebnisse bei anderen bösartigen Erkrankungen, einschließlich Darm-, Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, gezeigt, was ihr Potenzial für die personalisierte Onkologie unterstreicht 4,12.

Die Etablierung und Aufrechterhaltung von Prostatakrebs-Organoiden (PCOs) stellt jedoch einzigartige technische Herausforderungen dar. Das Prostataepithel ist von Natur aus abhängig von der Androgensignalgebung und der Unterstützung der extrazellulären Matrix (ECM), was spezielle Kulturbedingungen erfordert. Darüber hinaus weist Prostatakrebs ein breites Spektrum an klinischen Verhaltensweisen auf, von lokalisierten hormonsensitiven Tumoren bis hin zu hochaggressiven, behandlungsrefraktären CRPC, was die Entwicklung reproduzierbarer organoider Systeme weiter erschwert11,12. Erfolgreiche Protokolle für die PCO-Generierung müssen diese biologischen Komplexitäten berücksichtigen, indem sie Schlüsselschritte optimieren, einschließlich der Gewebeverarbeitung, der enzymatischen Verdauung, der ECM-Einbettung und der Supplementierung mit kritischen Wachstumsfaktoren, Hormonen und kleinen Molekülen. Solche Protokolle sind unerlässlich, um die Treue von Organoiden zu ihren elterlichen Tumoren sicherzustellen und ihre Anwendung in nachgelagerten Analysen zu erleichtern.

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes und reproduzierbares Protokoll für die Etablierung und langfristige Aufrechterhaltung von gDOs vor. Unser Arbeitsablauf erstreckt sich über den gesamten Prozess, von der Gewebeentnahme und -verarbeitung von Biopsien und chirurgischen Proben bis hin zur Organoid-Passage, Kryokonservierung und Wiederbelebung (Abbildung 1). Dieses Protokoll wurde optimiert, um die phänotypische und genomische Integrität von Prostatakrebsgewebe zu erhalten und robuste 3D-Kultursysteme zu ermöglichen, die für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet sind, einschließlich genomischer Profilerstellung, Tests des Ansprechens auf Medikamente und funktioneller Assays. Insbesondere adressiert unsere Methode gängige technische Hürden, wie z. B. niedrige Erfolgsraten in der Organoidkultur, suboptimales Wachstum und Schwierigkeiten bei der anschließenden Passage, und bietet standardisierte Richtlinien, wodurch die Reproduzierbarkeit in allen Laboren erleichtert wird.

Die Entwicklung zuverlässiger Organoidmodelle für Prostatakrebs ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die translationale Forschung von immenser Bedeutung13. Diese Systeme bieten eine leistungsstarke Plattform für die Entschlüsselung von Krankheitsmechanismen, die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und die Weiterentwicklung präziser medizinischer Ansätze, die auf den einzelnen Patienten zugeschnitten sind. Durch die Schließung bestehender technischer Lücken und die Bereitstellung eines umfassenden Protokolls zielt unsere Arbeit darauf ab, die Einführung der Organoid-Technologie in der Prostatakrebsforschung zu beschleunigen und die weltweiten Bemühungen zur Bekämpfung dieser schwierigen Krankheit zu unterstützen14.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des Wuxi No. 2 People's Hospital geprüft und genehmigt (Zulassungsnummer: Y-38 (2023)). Alle Teilnehmer stellten schriftliche Einwilligungserklärungen zur Verfügung. Patientendaten wurden anonymisiert, um den Schutz der Privatsphäre in Übereinstimmung mit ethischen Standards zu gewährleisten.

1. Probenentnahme

  1. Entnahme von Gewebe
    1. Vorbereitung vor der Probenahme
      1. Einschlusskriterien: Stellen Sie sicher, dass alle Teilnehmer eine bestätigte Diagnose von Prostatakrebs haben, die durch pathologische oder bildgebende Untersuchungen festgestellt wurde. Leiten Sie Tumorproben aus chirurgischen Resektionen, Biopsien oder anderen klinischen Proben ab. Stellen Sie sicher, dass alle Teilnehmer 18 Jahre oder älter sind und keine anderen bösartigen Erkrankungen haben, um mögliche Interferenzen durch andere Krebsarten in der Studie zu Prostatakrebs auszuschließen. Holen Sie von allen Teilnehmern die schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ein und erlauben Sie die Verwendung ihrer Proben für die wissenschaftliche Forschung.
      2. Ausschlusskriterien: Patienten ausschließen, deren Proben nicht genügend Tumorgewebe für die Kultur oder Analyse enthalten. Ausschluss von Patienten, die ihre Einwilligung widerrufen oder nicht in der Lage sind, die erforderlichen Proben während der Studie zur Verfügung zu stellen.
    2. Biopsieproben der Prostatakernnadel: Verwenden Sie eine spezielle Nadel, um Proben aus Prostatagewebe zu entnehmen. Legen Sie das Gewebe sofort in eine Konservierungslösung (Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung)) und transportieren Sie es auf Eis ins Labor, wobei eine Lieferung innerhalb von 24 Stunden sichergestellt wird.
      HINWEIS: Gezieltes Targeting von Prostatakrebsgewebe und Durchführung von Probenahmen an mehreren Stellen in verschiedenen anatomischen Regionen. Führen Sie 1-2 Punktionen pro Stelle durch, die jeweils ≥ 1 cm große Kernproben ergeben.
    3. Radikale Prostatektomie-Proben: Nach der Entnahme werden die Proben schnell in Konservierungslösung (adDMEM/F-12 Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung)) gegeben und auf Eis transportiert, um eine Lieferung an das Labor innerhalb von 24 Stunden sicherzustellen.
      HINWEIS: Weitere Gewebefragmente können durch radikale Prostatektomie15 gewonnen werden.
      Sammeln Sie Proben ≥ 1 g (≈ 5 mm Durchmesser), um die Kontamination durch normales Gewebe zu minimieren. Stimmen Sie sich präoperativ mit Ärzten ab, um Folgendes zu spezifizieren: 1) Tumorkern; 2) peritumorales Gewebe; 3) Normale Kontrolle. Priorisieren Sie feste Fragmente mit grau-gelben Verfärbungen. Wenn nicht vorhanden, implementieren Sie eine systematische Zufallsstichprobe. Informationen zur Probenentnahme finden Sie in Tabelle 1 .
  2. Probenaufbereitung
    1. Beschriftung und Kategorisierung: Beschriften Sie die entnommenen Gewebeproben eindeutig (einschließlich Patientenname, Krankenhausaufenthaltsnummer, Gewebename, Gewebestelle und Gewebetyp).
    2. Kryokonservierung: Gewebeproben sofort verarbeiten (≤ 12 Stunden nach der Entnahme). Die Proben werden in eine vorgekühlte (4 °C) Konservierungslösung (adDMEM/F-12 Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung)) gegeben und bei 4 °C gelagert. Fahren Sie innerhalb von 4-6 Stunden mit weiteren experimentellen Schritten fort, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  3. Transport und Lagerung
    1. Kühlkettentransport: Transportieren Sie die Gewebeproben unter niedrigen Temperaturbedingungen ins Labor.
    2. Probenregistrierung: Überprüfen und registrieren Sie bei Ihrer Ankunft im Labor die Probeninformationen im Detail, einschließlich der grundlegenden persönlichen Daten des Patienten, des Gewebetyps, des Namens und der Probenahmestelle.
  4. Laborannahme und Inspektion:
    1. Probeninspektion: Öffnen Sie die Proben in einer Biosicherheitswerkbank und untersuchen Sie sie auf Verlust, Kontamination oder sichtbare Anomalien.
    2. Probendissektion: Entnehmen Sie die Probe und legen Sie sie in eine Kulturschale. Verwenden Sie eine Gewebeschere oder ein Skalpell, um die Probe in kleine Stücke (ca. 1-3 mm³) zu teilen, um sie in nachfolgenden Experimenten zu verwenden.

2. Experimentelle Verfahren

  1. Herstellung von primären Gewebezellsuspensionen
    1. Konservierung: Legen Sie die gesammelten Gewebeblöcke in sterile konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass die Gewebe nach Typ kategorisiert sind. Beschriften Sie jede Tube entsprechend. Geben Sie Konservierungslösung (adDMEM/F-12 Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung)) in jedes Röhrchen, bis das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Lagern Sie die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Gewebetypen sollten sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorgewebe umfassen. Probenetiketten sollten in der Regel die Nummer der Krankenakte enthalten.
    2. Gewebetrennung: Mit einer sterilisierten Pinzette werden die Prostatakrebs-Gewebeproben in eine mittelgroße Kulturschale überführt. Waschen Sie das Tuch 2-3 Mal mit 2 ml Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (D-PBS), um Blut und Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe, Muskeln und andere nicht-epitheliale Bestandteile mit einer Pinzette mit feiner Spitze, wobei nur die Epithelregionen erhalten bleiben. Anschließend zerkleinern Sie das gereinigte Gewebe mit einer Schere in kleine Fragmente von ca. 1-3 mm³ Größe.
      HINWEIS: Die vollständige Entfernung von nicht-epithelialen Komponenten ist für Downstream-Anwendungen von entscheidender Bedeutung, da die Kontamination von Stroma- oder Fettgewebe die Effizienz und Spezifität der Zellisolierung verringern kann. Halten Sie während des gesamten Eingriffs sterile Bedingungen aufrecht, um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination zu minimieren.
    3. Gewebeverdauung: Übertragen Sie die vorbereiteten Gewebestücke in Gewebeverarbeitungsröhrchen. Geben Sie die Lösung für den Aufschluss des Tumorgewebes (Tabelle 2) in jedes Röhrchen. Aktivieren Sie das Aufschlussgerät (Einzelzellsuspensionspräparat) mit dem Dissoziationsprogramm für mittelhartes Gewebe für die enzymatisch-mechanische Dissoziation.
      HINWEIS: Das Aufschlussprotokoll lautet wie folgt: Vorwärtsdrehung bei 200 U/min für 3 s, Rückwärtsdrehung bei 200 U/min für 3 s, Vorwärtsdrehung bei 300 U/min für 4 s, Rückwärtsdrehung bei 300 U/min für 4 s, Vorwärtsdrehung bei 600 U/min für 5 s, Rückwärtsdrehung bei 600 U/min für 5 s, Vorwärtsdrehung bei 400 U/min für 3 s, Rückwärtsdrehung bei 400 U/min für 3 s. Diese Abfolge besteht aus einem Zyklus, der dreimal wiederholt werden sollte. Nachdem Sie die ersten beiden Zyklen abgeschlossen haben, fahren Sie mit langsamer Drehung bei 20 U/min für ca. 25 Minuten fort. Die Dauer kann je nach Versuchsbedingungen angepasst werden. Verdauen Sie das Gewebe bei 37 °C für 40 min bis 1 h.
    4. Verdaubeendigung: Geben Sie der Zellsuspension ein gleiches oder doppeltes Volumen an FBS-supplementiertem adDMEM/F-12-Medium zu, um die enzymatische Aktivität zu beenden.
      HINWEIS: Wenn unverdaute Rückstände zurückbleiben, sammeln Sie den Überstand, fügen Sie dem Rückstand frische Verdauungsenzyme hinzu und setzen Sie die Verdauung bei 37 °C für weitere 15-20 Minuten fort. Überwachen Sie den Prozess regelmäßig und kombinieren Sie Zellsuspensionen aus beiden Verdauungsschritten.
    5. Filtration: Befeuchten Sie ein 100-μm-Zellsieb mit 1 mL adDMEM/F-12-Medium und filtrieren Sie dann die Zellsuspension. Spülen Sie das Gewebeverarbeitungsröhrchen und das Zellsieb zweimal mit 5 ml adDMEM/F-12-Medium, das mit einer Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung) versetzt wurde. Sammeln Sie das Filtrat in einem sterilen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie die Suspension durch ein 70-μm-Sieb und sammeln Sie alle Zellsuspensionen in einem neuen 50-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Anzahl der Filtrationsschritte und die Porengröße der Siebe können je nach den Eigenschaften der Probe angepasst werden.
    6. Lyse roter Blutkörperchen: Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension bei 200 × g für 5 min bei 25 °C. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen. Inkubieren Sie die Suspension 2-3 Minuten lang auf Eis.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für die Lyse roter Blutkörperchen kann je nach Effizienz der Lyse angepasst werden. Eine längere Inkubation kann zu einem erhöhten Zelltod führen. Es wird empfohlen, die Probe unter einem Mikroskop zu überwachen, um eine vollständige Lyse der roten Blutkörperchen ohne übermäßige Schädigung anderer Zelltypen zu gewährleisten.
    7. Beenden Sie die Lyse: Geben Sie 6 ml adDMEM/F-12-Medium, ergänzt mit einer Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung), zur Zellsuspension. Die Mischung wird in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen von 15 mL überführt und bei 200 x g für 5 min bei 25 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Zellpellet 1-2 Mal mit dem gleichen zugesetzten Medium und geben Sie die endgültige Zellsuspension in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen.
    8. Beurteilung der Lebensfähigkeit: Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau-Lösung und beobachten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter einem Mikroskop.
      HINWEIS: Wenn signifikante Mengen an abgestorbenen Zellen oder Ablagerungen beobachtet werden, führen Sie eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bei 50 x g für 5 min bei 25 °C durch, um sie zu entfernen, bevor Sie mit der Zählung fortfahren.
    9. Zellzählung: Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml adDMEM/F-12-Medium, verdünnen Sie die Suspension nach Bedarf (typischerweise in einer Verdünnung von 1:20) und geben Sie 6 μl der verdünnten Suspension auf ein Hämozytometer, um die Zellen unter einem Mikroskop zu zählen.
    10. Sammlung von Zellpellets: Zentrifuge bei 200 x g, 25 °C, für 5 min. Sammeln Sie das endgültige Zellpellet in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen.

3. Etablierung von Organoiden aus primären Zellsuspensionen

  1. Seeding: Bestimmen Sie das erforderliche Volumen des Matrixgels basierend auf der Zellzahl. Übertragen Sie mit vorgekühlten Pipettenspitzen (bei -20 °C gelagert) vorsichtig das entsprechende Volumen des Matrixgels auf das Zellpellet. Mischen Sie die Zell-Gel-Mischung vorsichtig auf Eis und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, um eine gleichmäßige Aussaat und eine optimale Integrität des Matrixgels zu gewährleisten.
    HINWEIS: Tauen Sie das Matrixgel vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C auf. Stellen Sie sicher, dass alle Handhabungswerkzeuge, einschließlich Pipettenspitzen und Röhrchen, vorgekühlt sind, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern.
  2. Plattierung: Geben Sie das Zell-Matrix-Gel-Gemisch auf eine 24-Well-Kulturplatte mit geringer Adhäsion und tragen Sie ca. 30 μl pro Tropfen auf. Stellen Sie sicher, dass jeder Tropfen mehr als 10.000 Zellen enthält, um eine effektive dreidimensionale (3D) Strukturbildung zu unterstützen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Verdünnung des Matrixgels. Um die strukturelle Integrität zu erhalten und die 3D-Kulturbildung zu unterstützen, sollte das Matrixgel mehr als 70 % des Gesamtvolumens der Mischung ausmachen. Organoide, die aus menschlichen Biopsie- und Prostatektomieproben gewonnen wurden, sind von Natur aus gleichwertig und unterscheiden sich hauptsächlich in der Ausbeute lebensfähiger Zellen, und in diesem Protokoll wurden identische Aussaatdichten angewendet.
  3. Inkubation: Legen Sie die Kulturplatte für 5 min bei 37 °C mit 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator, damit sich das Matrixgel vorläufig verfestigen kann. Drehen Sie die Platte um und lassen Sie sie 20 Minuten lang ruhen, um das Matrixgel in 3D-Form zu halten. Geben Sie 800-1000 μl Kulturmedium (Tabelle 3) in jede Vertiefung. Tauschen Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage aus.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Matrixgel während des Inversionsschritts nicht gestört wird, um die 3D-Struktur zu erhalten.

4. Organoid-Passage

  1. Organoid-Entnahme und -Aufbereitung: Mit einer vorgekühlten Pipettenspitze das Matrixgel mechanisch aufbrechen, um die Organoid-Cluster zu fragmentieren. Spülen Sie jede Vertiefung 1-2 Mal mit adDMEM/F-12 Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung). Die fragmentierten Cluster werden zusammen mit dem Nährmedium in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Bei 200 × g 5 min bei 25 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Wenn Organoide einen Durchmesser von 100 μm erreichen (typischerweise am 14. Kulturtag). Wenn ein zu hohes mittleres Volumen die mechanische Störung beeinträchtigt, saugen Sie einen Teil des Mediums an, bevor Sie die Cluster aufbrechen. Restliches Matrixgel, das an der Plattenoberfläche haftet, vorsichtig mit einer Pipettenspitze abkratzen und 2-3 Mal mit adDMEM/F-12 Medium + Gesteinsinhibitorlösung (1:2000 Verdünnung) spülen. Alle Spülgänge sollten mit der Erstentnahme gepoolt werden, um eine maximale Ausbeute zu erzielen.
  2. Organoide Dissoziation: Resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 2 ml vorgewärmter rekombinanter Trypsin-ähnlicher Enzymlösung. Pipettieren Sie auf und ab, um die Dissoziation einzuleiten, und inkubieren Sie dann 15-30 Minuten lang bei 37 °C. Überwachen Sie die Dissoziation unter dem Mikroskop alle 5 Minuten, bis kleine Zellcluster (ca. 5-6 Zellen pro Cluster) das Feld dominieren, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
    HINWEIS: Die rechtzeitige Beendigung der Verdauung ist entscheidend, um eine übermäßige Dissoziation zu vermeiden und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Häufige mikroskopische Beobachtungen stellen sicher, dass die Verdauung zum optimalen Zeitpunkt für die Clusterbildung gestoppt wird.
  3. Beenden Sie den Verdau: Beenden Sie den Verdau, indem Sie ein gleiches oder doppeltes Volumen adDMEM/F-12-Medium hinzufügen, das mit fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird, um die enzymatische Aktivität zu löschen. Bei 200 x g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  4. Entfernung des Matrixgels: Resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL Zellrückgewinnungslösung und inkubieren Sie es 20-40 Minuten lang bei 4 °C, um das restliche Matrixgel aufzulösen. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschgang zweimal mit adDMEM/F-12 Medium, um Reste der Matrizenbestandteile zu entfernen. Übertragen Sie das fertige Pellet zur weiteren Verarbeitung in ein steriles 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen.
    HINWEIS: Die Inkubation bei niedrigen Temperaturen ist entscheidend für eine effektive Depolymerisation des Matrixgels bei gleichzeitiger Erhaltung der Zellintegrität. Minimieren Sie die Zeit außerhalb der kalten Umgebung, um eine vorzeitige Re-Gelierung zu verhindern.
  5. Aussaat und Kultur: Fahren Sie mit der erneuten Aussaat der dissoziierten Organoid-Cluster fort, indem Sie die in den Schritten 3.1 bis 3.3 beschriebenen Verfahren befolgen. Stellen Sie die richtige Zelldichte und das richtige Matrixgelverhältnis für eine optimale 3D-Strukturbildung sicher.
    HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Kryokonservierung, das Auftauen, das Wiedereinbetten und die histologische Verarbeitung von Organoiden sind auf Anfrage erhältlich.

5. Organoide Kryokonservierung

  1. Organoid-Entnahme: Nehmen Sie die Kulturplatte aus dem Inkubator und dissoziieren Sie die Organoid-Hydrogel-Aggregate mechanisch mit einer vorgekühlten Pipettenspitze. Die dissoziierten Aggregate werden zusammen mit dem Nährmedium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Spülen Sie die Vertiefungen 2-3 Mal mit adDMEM/F-12 medium und kombinieren Sie die Waschgänge mit der Primärsuspension. Bei 200 × g 5 min bei 25 ΰC zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Um eine maximale Ausbeute zu gewährleisten, brechen Sie die Organoid-Aggregate vorsichtig auf, ohne übermäßige Schäden zu verursachen. Alle Waschungen sollten mit der Erstentnahme kombiniert werden, um den Verlust von Organoiden während des Entnahmeprozesses zu reduzieren.
  2. Enzymatische Dissoziation: Geben Sie 2-4 ml vorgewärmte rekombinante trypsinähnliche Enzymlösung in ein konisches Röhrchen zum Organoid-Pellet und mischen Sie die Suspension vorsichtig. Inkubieren Sie die Suspension bei 37 °C für 15-20 Minuten. Überwachen Sie den Dissoziationsprozess alle 5 Minuten mikroskopisch.
    HINWEIS: Falls erforderlich, pipettieren Sie vorsichtig, um größere Cluster in kleinere Aggregate (ca. 5-6 Zellen pro Cluster) aufzuteilen. Für die Kryokonservierung sind kürzere Aufschlusszeiten erforderlich, um eine übermäßige Dissoziation und einen Verlust der Zelllebensfähigkeit zu verhindern. Häufige Beobachtungen stellen sicher, dass die Verdauung zu einem geeigneten Zeitpunkt beendet wird, um die Integrität der Organoide zu erhalten.
  3. Beendigung des Verdauungsversuchs: Fügen Sie ein gleiches oder größeres Volumen des mit FBS ergänzten adDMEM/F-12-Mediums hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS:Wenn das Pellet frei von Matrixgelresten ist, fahren Sie mit Schritt 5.5 für die Kryokonservierung fort. Wenn die Kontamination mit dem Matrixgel weiterhin besteht, fahren Sie mit Schritt 5.4 fort.
  4. Entfernung des Matrixgels (optional): Befolgen Sie das in Schritt 4.4 beschriebene Verfahren, um das Matrixgel zu entfernen. Das Pellet in 2 mL Zellrückgewinnungslösung resuspendieren und 20-40 Minuten bei 4 °C inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang 1-2 Mal, um eine vollständige Entfernung des Matrixgels zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die Entfernung von Matrixgelresten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass nur dissoziierte Zellen kryokonserviert werden. Eine unvollständige Gelentfernung kann die Lebensfähigkeit und strukturelle Integrität der Organoide nach dem Auftauen beeinträchtigen.
  5. Kryokonservierung: Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,5 mL Organoid-Gefriermedium durch sanftes Pipettieren, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. Die Suspension wird in ein Kryofläschchen überführt und zur kurzfristigen Konservierung bei -80 °C gelagert. Nach 24 Stunden werden die Durchstechflaschen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Kryokonservierungsmedium gründlich mit den Zellen vermischt ist, um ein ungleichmäßiges Einfrieren zu verhindern, das zu Zellschäden führen kann. Die Fläschchen sollten unmittelbar nach der Kurzzeitlagerung auf flüssigen Stickstoff umgestellt werden, um eine langfristige Konservierung zu gewährleisten und einen Zellabbau zu verhindern.

6. Wiederherstellung von Organoiden

  1. Auftauen von kryokonservierten Organoiden: Kryofläschchen, die Organoide enthalten, aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff oder -80 °C entfernen. Tauchen Sie das Fläschchen sofort in ein 37 °C heißes Wasserbad und rühren Sie es vorsichtig um, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist. Sobald das Auftauen abgeschlossen ist, wird die Organoidsuspension mit einer vorgekühlten Pipettenspitze (-20 °C) in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
    HINWEIS: Ein schnelles und gleichmäßiges Auftauen ist entscheidend, um kryoinduzierte Zellschäden zu minimieren. Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, um eine vorzeitige Erwärmung und eine Neubildung des Matrixgels während des Transfers zu verhindern.
  2. Entfernung des Kryoprotektivs: Geben Sie vorsichtig 1-2 ml adDMEM/F-12-Medium entlang der Wand des konischen Röhrchens, um das Kryoprotektivum allmählich zu verdünnen. Vorsichtig durch Inversion mischen. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie in diesem Stadium kräftiges Pipettieren oder Vortexen, da plötzliche osmotische Verschiebungen und mechanische Belastung die Lebensfähigkeit der Organoide beeinträchtigen können. Ein langsamer Verdünnungsansatz minimiert den zellulären Schock.
  3. Waschen und Resuspendieren: Geben Sie 1 mL frisches adDMEM/F-12-Medium in das Pellet. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer vorgekühlten (-20 °C) Pipettenspitze, um eine vorzeitige Adhäsion des Matrixgels zu verhindern. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung einer niedrigen Temperatur während des Waschens ist unerlässlich, um einen thermisch induzierten Zusammenbau von Matrixgelkomponenten zu verhindern, der eine spätere Organoid-Reformation behindern könnte.
  4. Sammlung: Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschschritt 2-3 Mal, um eine vollständige Entfernung von Kryoschutzmittelresten und Verunreinigungen sicherzustellen.
  5. Aussaat und Kultur: Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in einem Organoid-Kulturmedium, das gemäß den experimentellen Anforderungen hergestellt wurde. Fahren Sie mit der Aussaat gemäß dem in den Schritten 3.1 bis 3.3 beschriebenen Protokoll fort und stellen Sie sicher, dass das richtige Verhältnis des Matrixgels und die richtige Zelldichte zur Unterstützung der Wiederherstellung der 3D-Struktur erforderlich sind.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit und Erholung der Zellen nach dem Auftauen hängt in hohem Maße von der schonenden Handhabung, der richtigen Verdünnung der Kryoprotektiva und der sofortigen Wiederherstellung einer unterstützenden 3D-Matrix-Gel-Umgebung ab.

7. Voranalyseverarbeitung für die Charakterisierung von Organoiden

  1. Organoid-Ernte: Dissoziieren Sie Aggregate mechanisch, wenn die Organoiddurchmesser 70-100 μm erreichen, und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit Medium für die nachfolgende Kultur. Spülen Sie die Vertiefungen 2-3 Mal mit adDMEM/F-12 medium aus und kombinieren Sie die Waschungen mit der Organoid-Suspension. Bei 200 × g 5 min bei 25 ΰC zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Verwenden Sie für kleine Entnahmen (z. B. 1-2 Vertiefungen) ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine effiziente Handhabung zu gewährleisten und Probenverluste zu reduzieren. Seien Sie vorsichtig, um die organoiden Strukturen während der Dissoziation nicht zu stören.
  2. Resuspension: Das Pellet in 1 mL adDMEM/F-12 Medium resuspendieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bei 200 × g 5 min bei 25 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Pellet vor der Zentrifugation gründlich resuspendiert wird, um ein Verklumpen zu verhindern und eine gleichmäßige Verarbeitung in den nachfolgenden Schritten zu ermöglichen.
  3. Waschen und Fixieren: Geben Sie 1 mL D-PBS zum Pellet und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren oder Inversion. Bei 200 × g 5 min bei 25 °C zentrifugieren, den Überstand entsorgen und den Waschschritt 1-2 Mal wiederholen. Fixieren Sie das Pellet mit 1-2 mL 4% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C.
    HINWEIS: Führen Sie die Waschschritte sorgfältig durch, um eine gründliche Entfernung von Medienresten und anderen Verunreinigungen zu gewährleisten. Die Fixierung in Paraformaldehyd ist entscheidend, um die Morphologie der Organoide für die spätere Analyse zu erhalten.
  4. Waschen nach der Fixierung: Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die fixierten Proben 2-3 Mal mit D-PBS und mischen Sie sie vorsichtig durch Fingerschnippen oder sanftes Inversionieren, um eine korrekte Verteilung des Waschpuffers zu gewährleisten und den Verlust von Organoiden zu verhindern.
    HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Reinigung nach der Fixierung ist unerlässlich, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen und Hintergrundflecken in nachgelagerten Anwendungen, wie z. B. der Immunhistochemie, zu reduzieren.
  5. Ethanol-Refixierung: Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 70%iger Ethanolmischung, mischen Sie es vorsichtig mit den Fingern und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bei 200 × g 5 min bei 4 ΰC zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: Die Ethanolfixierung in diesem Stadium trägt dazu bei, die Integrität der Organoide zu erhalten und die Proben für die Einbettung oder weitere Verarbeitung vorzubereiten. Achten Sie auf eine gleichmäßige Suspension in Ethanol, um eine ungleichmäßige Fixierung zu vermeiden.
  6. Matrixgel-Clearance (optional): Wenn Reste von Matrixgel im Pellet verbleiben, befolgen Sie das in Schritt 4.4 beschriebene Protokoll, um es zu entfernen. Dieser Schritt umfasst die Resuspendierung des Pellets in einer Zellrückgewinnungslösung und eine Inkubation bei 4 °C für 20-40 Minuten, gefolgt von einer Zentrifugation und mehreren Wäschen, um eine vollständige Gelentfernung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Das Entfernen des Matrixgels ist besonders wichtig für die nachgelagerte histologische Analyse oder Bildgebung, da das restliche Gel die Gewebeschnitte und -analyse beeinträchtigen kann.
  7. Agarose-Einbettung: Bereiten Sie etwa 6 ml 2%ige Agarose vor, indem Sie bei 96 °C während der Organoid-Ethanol-Fixierung schmelzen. Mischen Sie 100 μl der geschmolzenen Agarose mit dem Organoid-Pellet, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren. Übertragen Sie die Mischung in eine Form, erstarren Sie bei 4 °C und verarbeiten Sie sie dann zum Einbetten von Paraffin.
    HINWEIS: Wärmen Sie die Pipettenspitzen (mit abgeschnittenen Enden) vor, um ein Verstopfen zu vermeiden. Die Agarose-Einbettung erleichtert die Erhaltung der Organoidstruktur und ermöglicht gleichzeitig eine einfache Handhabung und Sektionierung. Vermeiden Sie Blasenbildung während des Mischens, um eine gleichmäßige Einbettung und optimale Gewebeschnittung zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Morphologische und dynamische Wachstumsmerkmale von patienteneigenen Prostatakrebs-Organoiden
Von Patienten stammende Prostatakrebs-Organoide wurden erfolgreich aus frischem Tumorgewebe etabliert, das während klinischer Verfahren entnommen wurde. Die anfängliche Organoidbildung wurde typischerweise innerhalb von 5-7 Tagen nach der Kultur beobachtet (Abbildung 2). In der Hellfeldmikroskopie zeigten Organoide ausgeprägte morphologische Merk...

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Diskussion

Die Etablierung von PDOs für PCa stellt einen entscheidenden Fortschritt in der präklinischen Modellierung dar und bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen 2D-Zellkulturen und PDXs16. Die in dieser Studie vorgestellte Methode ermöglicht die Erzeugung von Organoiden, die die histologischen, genetischen und phänotypischen Merkmale des ursprünglichen Tumors getreu rekapitulieren. Durch die Beibehaltung der Tumorheterogenität, einschließlich der AR-Signalgeb...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82172831) und dem Key Research Project der Jiangsu Provincial Health and Family Planning Commission (Grant No. X20240121).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
BiosicherheitsschrankJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
ZellwiederherstellungslösungCorning354253
ZentrifugeShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
ZentrifugenröhrenNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex reduzierter Wachstumsfaktor BME, Typ 2R& D3533-005-02
Kulturbehälter (24-Bohrloch-Platten mit geringer Adhäsion)ThermoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Elektronische WaageNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Fetales RinderserumGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
Befeuchteter Zellkultur-Inkubator (37 °Ü°; C, 5 % CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
KühlboxNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Mittelgroße KulturgerichteAbsinabs7005
N21-MAX Medienergänzung (50X)R& DAR008
N-AcetylcysteinSigmaA9165-5G
NikotinamidR& D3533-010-02
NormocinInvivogenANT-NR-2
Pipettenhilfe-PipettiergerätNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PipettenNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Einzellige SuspensionsvorbereitungsapparaturHeckantriebDSC-400
Gewebeschere/SkalpellNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Tumor-Dissoziations-Kit, MenschMiltenyi Biotec130-095-929
PinzetteNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
WasserbadChangzhou Zhongjie Experimental Instrument Manufacturing Co., LtdHH-600
Y-27632 DihydrochloridR& D1254/10

Referenzen

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Patientenabgeleitete OrganoideOrganoidkulturVerdauung von TumorgewebeEinbetten in Matrix GelOrganoiderhaltWirkstoffscreeningPr zisionsmedizinAndrogenrezeptor ExpressionBiomarker Entdeckung
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