Methodenartikel

Nachweis von aggregationsanfälligem Verhalten in mutierten P53 V157F Brustkrebszellen mittels Multipunkt-Thioflavin-T-Fluoreszenz

DOI:

10.3791/68921

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30. Dezember 2025

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hs578T-Brustkrebszellen mit der p53-V157F-Mutation zeigen eine signifikant höhere Thioflavin-T-Fluoreszenz im Vergleich zu MCF7-Zellen, was auf eine erhöhte Proteinaggregation hinweist. Mehrpunktfluoreszenzmessungen verbessern die Nachweisgenauigkeit und Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von β-blattreichen Aggregaten und unterstreichen die Bedeutung aggregationsanfälliger p53-Mutationen in der Krebsforschung und der Entwicklung therapeutischer Strategien.

Zusammenfassung

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Der Tumorsuppressor p53, codiert vom TP53-Gen , spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. TP53-Mutationen , insbesondere Hotspot-Varianten, finden sich in etwa 50 % der menschlichen Krebsarten und können zum Verlust tumorsuppressiver Funktionen oder zum Erwerb von Gain-of-Function-Eigenschaften führen, einschließlich der Aggregation in prionähnliche Strukturen.

In dieser Studie untersuchten wir die Aggregationstendenz der p53 V157F-Mutation in Hs578T-Brustkrebszellen im Vergleich zu MCF7-Zellen, die Wildtyp-p53 exprimieren. Die Proteinaggregation wurde mittels Thioflavin T (ThT)-Färbung und anschließend Fluoreszenzquantifizierung in 96-Well-Plattentests untersucht. Die Zellen wurden mit einer ThT/Hoechst-Lösung gefärbt, gewaschen und mit einem Mikroplattenleser unter definierten Anregungs-/Emissionsparametern analysiert. Quantitative Analysen mit Einpunkt- und Vierpunkt-Fluoreszenzmessungen zeigten, dass Hs578T-Zellen eine 3,20- bis 4,26-fache Erhöhung der ThT-Fluoreszenzintensität im Vergleich zu MCF7 aufwiesen, was auf signifikant erhöhte Werte von β-blattreichen oder amyloidähnlichen Aggregaten hindeutet. Mehrpunktmessungen bestätigten das weitverbreitete und konstante Vorkommen von Proteinaggregaten auf der Bohrlochoberfläche. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von Multipunkt-Plattenlesung zur präzisen Erkennung der Proteinaggregation in zellbasierten Analysen.

Einleitung

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Das TP53-Gen, das das Tumorsuppressorprotein p53 codiert, ist in etwa 50 % der menschlichen Krebsartenmutiert 1,2. Solche Mutationen heben nicht nur die tumorsuppressiven Funktionen von p53 auf, sondern fördern in bestimmten Hotspot-Varianten auch die Bildung prionenähnlicherAggregate 3,4. Diese aggregierten Formen des mutierten p53 erwerben häufig Gain-of-Function-Eigenschaften, darunter eine erhöhte Resistenz gegen Krebstherapien 5,6. Daher ist es entscheidend, zu bestimmen, welche p53-Hotspot-Mutationen anfällig für Aggregation sind, um die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien bei p53-mutanten Krebsarten 7,8 zu steuern.

In unseren früheren Studien beobachteten wir, dass spezifische p53-Mutationen in Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom (HNSCC) und Brustkrebszelllinien starke Thioflavin-T-(ThT)-Färbungssignale aufweisen, was auf das Vorhandensein aggregierter Proteine hinweist. ThT ist ein Benzothiazol-Farbstoff, der speziell an β blattreiche Amyloidstrukturen bindet und bei der Bindungvon 9 eine verstärkte Fluoreszenz erzeugt. Zum Beispiel zeigte die Detroit 562 HNSCC-Zelllinie, die die p53 R175H-Mutation trägt, starke ThT-Fluoreszenzsignale10. Ebenso zeigten zwei weitere HNSCC-Zelllinien, TW01 und HONE-1, die beide die p53 R280T-Mutation aufwiesen, ebenfalls eine ausgeprägte ThT-Färbung11. In diesen Fällen kolokalisierten ThT-Signale mit p53, was das Vorhandensein aggregierter p53 10,11 unterstützte.

In Brustkrebszellen zeigten MDA-MB-231 (p53 R280K-Mutation) und T47D (p53 L194F-Mutation) ebenfalls eine starke ThT-Färbung mit klarer p53/ThT-Kolokalisation12. Im Gegensatz dazu zeigten MCF7-Zellen, die Wildtyp-P53 exprimieren, und MDA-MB-468-Zellen (p53 R273H-Mutation) jeweils nur schwache ThT-Signale12. Ähnlich zeigten OECM-1 HNSCC-Zellen mit der p53 V173L-Mutation niedrige ThT-Färbungswerte10.

Im Vergleich zu anderen Methoden zur Erkennung von Proteinaggregationen – wie Filterfall-Assays, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Immunfärbung mit aggregatspezifischen Antikörpern – bietet die ThT-Fluoreszenzanalyse mehrere Vorteile. Es ist zerstörungsfrei, schnell und sowohl für lebende als auch für feste Zellen anwendbar, ohne umfangreiche Verarbeitung. Während Filterfall-Assays unlösliche Aggregate effektiv erfassen, erfordern sie eine starke Denaturierung und sind für den Einsatz in lebenden Zellenungeeignet 13. TEM ermöglicht eine direkte Visualisierung der Fibrillmorphologie, ist jedoch arbeitsintensiv und mit geringemDurchsatz 14. Die aggregatspezifische Immunfärbung ermöglicht die In-situ-Detektion mit konformationsabhängigen Antikörpern, wobei die Verfügbarkeit und Spezifität vonAntikörpern begrenzt sein können. Im Gegensatz dazu bietet ThT-Fluoreszenz – insbesondere in Kombination mit Mehrpunktplatten-Ablesen – einen einfachen, quantitativen und räumlich zuverlässigen Ansatz zur Erkennung β blattreicher oder amyloidähnlicher Strukturen.

Praktische Überlegungen sind ebenfalls entscheidend für die Reproduzierbarkeit. ThT-Fluoreszenz korreliert linear mit der Amyloidkonzentration über einen weiten Konzentrationsbereich (0,2–500 μM), und das Spitzensignal wird typischerweise bei 20–50 μM erreicht, abhängig vom Protein, wobei ThT-Selbstfluoreszenz bei ≥5 μM auftreten kann, und höhere Konzentrationen können die Aggregationskinetik16 beeinflussen. Daher wird allgemein eine Arbeits-ThT-Konzentration von etwa 10–20 μM empfohlen, um die Empfindlichkeit auszugleichen und potenzielle Auswirkungen auf die Aggregationsprozessezu minimieren. In unserem Protokoll wird der 1.000-fache ThT-Bestand (12 mM) um 1:1.000 verdünnt, sodass eine Arbeitskonzentration von etwa 12 entsteht. μM, das innerhalb dieses empfohlenen Bereichs liegt.

ThT bindet bevorzugt an β blattreiche Amyloidstrukturen, die charakteristisch für Amyloidfibrillen sind. Diese Spezifität entsteht durch die Wechselwirkung des Farbstoffs mit der Kreuz-β-Architektur der Amyloidfibrillen, wobei die von β-Strängen gebildeten Oberflächen Bindungsstellen für ThT bilden. Folglich erkennt ThT möglicherweise nicht effektiv andere fehlgefaltete oder nicht-amyloide Aggregate, die diese β-blattreiche Struktur17 nicht aufweisen. Daher ist ThT zwar ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von Amyloidfibrillen, aber es ist ratsam, komplementäre Validierungsmethoden anzuwenden – wie Kolokalisierung mit p53-Immunfluoreszenz oder biophysikalische Ansätze –, um die Identität und Spezifität der detektiertenAggregate 10,18 zu überprüfen.

Strukturelle Vorhersagestudien legen nahe, dass die p53 V157F-Mutation eine Konformation annimmt, die anfälliger für Aggregation ist als das Wildtyp-Protein19. In dieser Studie verglichen wir ThT-Fluoreszenzsignale zwischen Hs578T-Brustkrebszellen, die die aggregationsanfällige p53 V157F-Mutation beherbergen, und MCF7-Brustkrebszellen, die Wildtyp p53 exprimieren. Mit einem auf mehreren Plattenlesern basierenden ThT-Färbungstest versuchten wir, die Aggregationsneigung von p53 V157F im Vergleich zum Wildtyp-p53 zu bewerten.

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Protokoll

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1. Zell-Seeding

  1. Zur Bewertung der Zellviabilität werden 10 μL Trypan Blue mit 10 μL resuspendierten Zellen in 1x Dulbeccos Phosphatpuffersalzlösung (DPBS) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt und gründlich vermischt.
  2. Laden Sie 10 μL des Gemisch auf einen Zähler-Slide und zählen Sie dann die aktiven Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
  3. Basierend auf der Viabilitätszahl werden 30.000 lebensfähige Zellen pro Bohrloch in eine 96-Brunnen-Kulturplatte eingesät, wobei ein Bohrloch als nicht-gefärbte Kontrollquelle und die übrigen drei Brunnen für die Färbung verwendet werden.

2. Inkubation

  1. Die Kulturplatte in einen CO2-Inkubator setzen und 12 Stunden bei 37 °C inkubieren.

3. Herstellung von frischem ThT-Färbstoff (1.000x)

  1. Wiege 0,02 g (20 mg) ThT-Pulver und löse es in 5,0 mL deionisiertem Wasser. Gründlich mischen, bis das Pulver vollständig gelöst ist.
    HINWEIS: Diese Vorbereitung liefert eine 1.000x ThT Lagerlösung mit einer Endkonzentration von 4 mg/mL, was 12,5 mM entspricht (ThT hat ein Molekulargewicht von ~318,85 g/mol. Eine Lösung von 4 mg/mL entspricht 4 g/L. Teilt man 4 g/L durch 318,85 g/mol, ergibt man 0,0125 mol/L bzw. ~12,5 mM).

4. Herstellung eines ThT-Färbepuffers mit nuklearer Gegenfärbung

  1. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie Folgendes zu 1 ml 1x DPBS geben und vorsichtig mischen, um die Homogenität zu gewährleisten.
    1. Fügen Sie 1 μL frisch vorbereitetes 1.000x ThT-Material hinzu, was eine Endkonzentration von 12,5 μM (1x) ergibt.
    2. Fügen Sie 1 μL 1 mg/mL Hoechst 33342 Lagerlösung hinzu, was eine Endkonzentration von ~1 μg/mL (=1,6 μM) ergibt.

5. Verfärbung

  1. Entferne das Kulturmedium aus jedem Brunnen. Fügen Sie 100 μL des vorbereiteten ThT/Hoechst-Färbepuffers zu jedem Färbungsschacht hinzu. Fügen Sie 100 μL 1x DPBS zur unverfärbten Kontrolle hinzu.

6. Inkubation

  1. Stellen Sie den Teller für 30 Minuten an einen dunklen Ort bei Raumtemperatur (25 °C).

7. Waschen

  1. Saugen Sie vorsichtig die Färbungslösung aus jedem Brunnen ab oder entsorgen Sie die Zellmonoschicht nicht, wobei Sie darauf achten, die Zellmonoschicht nicht zu stören.
  2. Fügen Sie 100 μL 1× DPBS zu jedem Brunnen hinzu und ermöglichen Sie optional ein sanftes 30-sekündiges Einweichen.
  3. Saugen Sie vorsichtig ab oder entsorgen Sie die DPBS-Waschlösung.
  4. Wiederholen Sie die Waschung, indem Sie 100 μL frisches 1x DPBS zu jedem Brunnen geben, erneut ein optionales 30-sekündiges sanftes Einweichen ermöglichen, und dann die DPBS-Waschlösung entsorgen.
  5. Nach der zweiten Waschung geben Sie 100 μL frisches 1x DPBS zu jedem Brunnen.

8. Fluoreszenzmessung

  1. Bevor Sie das Fluoreszenzsignal ablesen, entfernen Sie die Kappe von der 96-Well-Platte. Messen Sie die Fluoreszenz mit einer von zwei Methoden: Einpunkt-Messung oder Vier-Punkt-Messung.
  2. Setzen Sie die 96-Well-Platte in einen Mikroplattenleser ein und messen Sie die Fluoreszenz mit folgenden Einstellungen: ThT-Fluoreszenz: Anregung bei 450 nm, Emission bei 490 nm; Hoechst 33342 Fluoreszenz: Anregung bei 360 nm, Emission bei 460 nm; Lesereinstellungen: Schütteln: 5 Sekunden vor dem Lesen; Leserichtung: Oberste Lektüre; Integrationszeit: 140 ms; Lesehöhe: 1,00 mm; Punkte pro Welll: 1 (Endpunkt) oder 4 (Brunnenscan); Bohrloch-Scan-Einstellung: (Dichte-Einstellung: 2; Punktabstand: 2,5).

9. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die Proteinaggregation wie folgt:
    figure-protocol-1
  2. Normalisieren Sie die ThT-Fluoreszenzintensität, indem Sie das Verhältnis in MCF7-Zellen auf 1 (Ausgangskontrolle) festlegen.

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Ergebnisse

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Um das Vorhandensein von β-blattreichen Proteinaggregaten in Brustkrebszellen zu untersuchen, wurden MCF7- und Hs578T-Zelllinien einer ThT-Färbung und anschließend einer Fluoreszenzquantifizierung unterzogen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wurden die Zellen in vier Brunnen einer 96-Well-Platte ausgesaat, wobei eine als unverfärbte Kontrollquelle bezeichnet wurde. Die übrigen drei Brunnen wurden gemäß dem Standardprotokoll mit ThT gefärbt. Die Fluoreszenz wu...

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Diskussion

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Beim Aussäen von Zellen in 96-Brunnenplatten ist es oft schwierig, eine gleichmäßige Verteilung über die Bohrlochoberfläche zu erreichen, da ein sanftes Schütteln oder Anklopfen der Platte zur Verteilung der Zellen nicht immer möglich ist. Diese ungleichmäßige Verteilung kann eine Variabilität der Signalintensität im gesamten Bohrloch verursachen. Die Mehrpunkt-Fluoreszenzmessung zeigte signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Regionen innerhalb desselben Bohrlochs, was diese Ver...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken dankbar für die technische Unterstützung des Basic Medical Core Laboratory am College of Medicine der I-Shou Universität. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des E-DA Hospital [EDAHJ114001 an C.-C.C.] und des National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt [NSTC 112-2813-C-214-032-B an B.-H. C]

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Brunnen-KulturplatteGanz einfachPC396-0100
KonterrutscheInvitrogenC10228
Countess II FL Automatisierter ZellenzählerThermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSGanz einfachCC704-0500
Eppendorfer RöhreGanz einfachPC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Molekulare Bauelemente735-0391 
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Trypan BlauInvitrogenT10282

Referenzen

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p53 AggregationThioflavin T F rbungNachweis von ProteinaggregationenMultipoint FluoreszenzTP53 MutationAmyloid AggregateMikroplattenleseger tHs578T ZellenFluoreszenzquantifizierung

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