Ein Laufband-basiertes Mausmodell zur Untersuchung von Hitzewallungen mit kontinuierlicher Überwachung der Hauttemperatur

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert ein Mausmodell für Hitzewallungen in den Wechseljahren, indem sie Ovariektomie mit belastungsinduzierter Thermogenese und kontinuierlicher hochauflösender Überwachung der Schwanzhauttemperatur kombiniert.

Zusammenfassung

Hitzewallungen beeinträchtigen die Lebensqualität von Frauen in den Wechseljahren erheblich, doch die zugrundeliegenden neuronalen Mechanismen und wirksamen Therapien sind nach wie vor wenig verstanden. Eine große Herausforderung in diesem Bereich war der Mangel an zuverlässigen Tiermodellen und nicht-invasiven Methoden zur kontinuierlichen Überwachung der Hauttemperatur. Hier wurde ein Mausmodell entwickelt, das Ovariektomie mit belastungsinduzierter Thermogenese kombiniert, um Hitzewallungen zu untersuchen. Mit Hilfe eines telemetrischen Loggers, der durch eine 3D-gedruckte Heckhülse gesichert war, wurde die Temperatur der Schwanzhaut in einem stressfreien Zustand kontinuierlich überwacht. Darüber hinaus stellten Infrarotkameras eine ergänzende Methode zur Überwachung der Wärmeerzeugung und -ableitung dar, die eine umfassendere Beurteilung der Körpertemperatur ermöglichte. Unter Verwendung dieses Modells wurde festgestellt, dass ovariektomierte Mäuse einen höheren Anstieg der Hauttemperatur und eine niedrigere Körperkerntemperatur aufwiesen, was den in den Wechseljahren beobachteten Hitzewallungsphänotyp effektiv nachahmte. Dieser Ansatz etabliert ein präzises Modell für die Überwachung von Hitzewallungen und wird für Forscher in den Bereichen Thermoregulation, Neurowissenschaften und klinische Wechseljahrsstudien wertvoll sein.

Einleitung

Hitzewallungen gehören zu den häufigsten und störendsten Symptomen der Menopause und beeinträchtigen die Lebensqualität erheblich¹. Diese Episoden sind gekennzeichnet durch einen plötzlichen Anstieg der Hauttemperatur, gefolgt von einem vorübergehenden Abfall der Körperkerntemperatur², oft begleitet von erhöhter Herzfrequenz, Angstzuständen und Schwindel³. Trotz ihrer tiefgreifenden Auswirkungen sind wirksame Behandlungen nach wie vor begrenzt⁴, was die Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses der zugrunde liegenden Mechanismen unterstreicht.

Ein entscheidender Schritt bei der Untersuchung von Hitzewallungen ist die Entwicklung zuverlässiger Tiermodelle, die thermoregulatorische Dysfunktionen genau nachbilden. Derzeit ist der primäre Ansatz die Ovariektomie (OVX), die zu veränderten Haut- und Körperkerntemperaturen führt⁵. Diese Veränderungen sind jedoch oft inkonsistent, da sie durch Stress oder Schwankungen der Umgebungstemperatur verfälscht werden können⁶. Darüber hinaus bleibt die Erfassung sporadischer Hitzewallungen eine Herausforderung. Alternative Methoden verwenden pharmakologische Wirkstoffe (z. B. Senktid, Capsaicin, Tamoxifen oder Naloxon), um eine akute kutane Vasodilatation bei Nagetieren auszulösen ^7,8,9. Während diese Verbindungen zu schnellen, messbaren Erhöhungen der Hauttemperatur führen, erschweren ihre invasive Verabreichung und dosisabhängige Wirkung die Interpretation thermoregulatorischer Reaktionen. Darüber hinaus bleibt unklar, ob die medikamenteninduzierte Vasodilatation die physiologischen Bedingungen natürlicher Hitzewallungen vollständig rekapituliert. Daher wird dringend ein verfeinertes und zuverlässigeres Tiermodell benötigt.

Bewegung ist ein bekannter Modulator der Körpertemperatur und wurde mit der Induktion von Hitzewallungen beim Menschen in Verbindung gebracht¹⁰. Einige Studien haben erzwungene Bewegung bei Mäusen genutzt, um Wärmeableitungsmuster nachzuahmen, die Hitzewallungen ähneln 11,12,13. Obwohl dieser Ansatz ein nicht-invasives Mittel zur Provokation von Temperaturschwankungen darstellt, ist die Überwachung der Hauttemperatur bei aktiven Mäusen, insbesondere mittels Infrarot-Thermografie, eine technische Herausforderung. Darüber hinaus erfordert eine umfassende Beurteilung von Hitzewallungen-ähnlichen Symptomen eine kontinuierliche, langfristige Aufzeichnung sowohl der Schwanz- (Haut) als auch der Körperkerntemperatur.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein optimiertes Mausmodell entwickelt, das die Ovariektomie mit Laufband-induziertem Training kombiniert, um zuverlässig Hitzewallungen-ähnliche thermoregulatorische Reaktionen hervorzurufen. Im Experiment wurden C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen unter Standardbedingungen (12:12 Hell-Dunkel-Zyklus, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% Luftfeuchtigkeit) untergebracht. Darüber hinaus wurde ein telemetrischer Temperaturlogger entwickelt, der durch eine 3D-gedruckte Schwanzhülse gesichert ist, um eine stressfreie, kontinuierliche Überwachung der Schwanztemperatur bei frei beweglichen Mäusen zu ermöglichen. Die Infrarot-Thermografie wurde ebenfalls integriert, um ergänzende Daten über die Wärmeerzeugung und -ableitung zu liefern. Dieses Modell wird als wertvolles Werkzeug dienen, um die Mechanismen von Hitzewallungen zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu evaluieren.

Protokoll

Diese Methoden wurden für Mausmodelle entwickelt. Studien an Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fudan University (2021JS0040) genehmigt. Vor der Umsetzung des Protokolls wurden die Tiere in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. In dieser Studie wurden 8 bis 10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 20-23 g unter Standardbedingungen (12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 22 °C ± 1 °C, 50% ± 10% Luftfeuchtigkeit) untergebracht. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Bereiten Sie zehn 8-10 Wochen alte weibliche Mäuse vor, die unter Standardbedingungen (12:12 Hell-Dunkel-Zyklus, 22 °C ±1 °C, 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit) mit Ad-libitum-Futter und Wasser untergebracht sind.
2. Verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in OVX- und Scheingruppen (n = 5/Gruppe). Gruppenhaus zur Unterstützung der Synchronisierung von Brunstzyklen.
3. Einrichtung des Laufbandprotokolls
   1. Öffnen Sie die Laufbandsteuerungssoftware "TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2" auf dem angeschlossenen Computer (Ergänzende Abbildung 1).
   2. Initialisieren Sie eine neue experimentelle Datei, indem Sie in der Menüleiste Datei > Neue Datei initialisieren auswählen.
   3. Programmieren Sie das laufende Protokoll:
      1. Stellen Sie das erste Segment ein: 0-20 s Beschleunigung von 0-0,17 m/s.
      2. Stellen Sie das zweite Segment ein: 20-150 s konstante Geschwindigkeit bei 0,17 m/s.
      3. Stellen Sie das dritte Segment ein: 150-170 s Beschleunigung von 0,17-0,25 m/s.
      4. Stellen Sie das letzte Segment ein: 170-600 s konstante Geschwindigkeit bei 0,25 m/s^10,12.
         HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Experiment keine elektrische Stimulation, um zusätzlichen Stress zu vermeiden.

2. Überwachung des Östruszyklus

1. Schmieren Sie an 8 aufeinanderfolgenden Tagen täglich zur gleichen Zeit Vaginalabstriche auf einen Färbeobjektträger, indem Sie mit einer Pipette mit 100 μl sterilem PBS spülen.
2. Trocknen Sie die Proben auf Objektträgern 24 h lang in einem Abzug.
3. Tauchen Sie die Proben kurz in 100%iges Methanol bei Raumtemperatur.
   ACHTUNG: Methanol ist giftig durch Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie es in einem gut belüfteten Abzug, tragen Sie Nitrilhandschuhe und vermeiden Sie Funken/Flammen.
4. Verdünnen Sie den handelsüblichen 20× Giemsa-Farbstoff mit PBS auf 1×.
5. Die Methanol-Fixobjektträger mit 1× Giemsa im Dunkeln 1-2 h färben.
6. Untersuchen Sie die vaginale Zytologie, um die Östrusstadien auf der Grundlage dieser Studien zu bestimmen^14,15.
7. Fahren Sie mit den Experimenten fort, wenn sich die Mäuse in der Prostrus befinden (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig mit Mäusen um, um stressbedingte Zyklusstörungen zu vermeiden. Vermeiden Sie tiefes Einführen von Pipettenspitzen, um eine Scheinschwangerschaft zu verhindern.

3. Ovariektomie Operation

1. Erfassen Sie das Gewicht der Mäuse und betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation zu halten.
2. Die Haare im dorsolateralen Bereich beidseitig vor den Hinterbeinen rasieren und mit 70% Ethanol und Jod abwechselnd 3 Mal desinfizieren.
3. Machen Sie einen 1 cm langen paravertebralen Schnitt in der Haut und verwenden Sie ein stumpfes Instrument, um die Haut vom darunter liegenden Muskelgewebe zu trennen. Machen Sie dann den Schnitt in der Muskelwand. Legen Sie die Fettpolster der Eierstöcke mit Wattestäbchen frei.
4. Ligate die Blutgefäße der Eierstöcke mit Nähten. Exzidierung der Eierstöcke mit chirurgischer Schere¹⁶.
5. Schließen Sie den Schnitt in Schichten, Muskeln und Haut mit nicht resorbierbaren Nähten. Reinigen Sie die Haut um die Operationsstelle herum vorsichtig mit Kochsalzlösung, um getrocknetes Blut oder antiseptische Peelingreste zu entfernen.
6. Schneiden Sie zur Scheinkontrolle ein Stück des Fettpolsters ab, ohne die Eierstöcke zu berühren.
7. Überwachen Sie die Gesundheit der Mäuse täglich für 7 Tage nach der Operation.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mäuse während des gesamten Anästhesieprozesses auf einem Heizkissen bei etwa 35 °C aufbewahrt werden.

4. Implantation eines Kerntemperaturloggers

1. Programmierung und Initialisierung des Loggers (ergänzende Abbildung 2).
   1. Setzen Sie den Temperaturlogger senkrecht in die Dockingstation ein.
   2. Klicken Sie in der Menüleiste der Software auf Recorder > Connect .
   3. Wählen Sie in der Menüleiste > Neue Messgröße bearbeiten .
   4. Wählen Sie "Mehrere Aufnahmeintervalle" aus den Optionen des Aufnahmemodus.
   5. Parameter einstellen: Startdatum: [JJJJ-MM-TT HH:MM], Enddatum: [JJJJ-MM-TT HH:MM], Aufnahmeintervall: 5 min.
   6. Fügen Sie der Sequenz die Einstellung "Intervalle" hinzu.
   7. Klicken Sie auf Rekorder > Neue Messsequenz starten.
2. Rasieren und desinfizieren Sie unter Narkose die Haut des Bauches.
   HINWEIS: Dieses Implantationsverfahren mit Bauchtemperaturlogger kann zusammen mit einer OVX-Operation durchgeführt werden, um mehrere Operationen zu vermeiden.
3. Machen Sie einen 2 cm langen Hautschnitt in der Mittellinie, etwa 1 cm unterhalb des Zwerchfells.
4. Verlängern Sie den Schnitt entlang der Linea alba, um die Bauchhöhle zu öffnen.
5. Führen Sie den Kerntemperaturlogger vorsichtig in die Bauchhöhle entlang der Sagittalebene ein.
   HINWEIS: Die richtige Platzierung ist entscheidend für genaue Temperaturmessungen. Vermeiden Sie eine oberflächliche Positionierung in der Nähe der Haut, da die Umgebungstemperatur die Messungen beeinträchtigen kann.
6. Vernähen Sie den Bauchschnitt mit 5-0 nicht resorbierbaren Nähten.
7. Desinfizieren Sie den Bauch mit Jodlösung.
   HINWEIS: Überwachen Sie das Tier während der Genesung genau. Halten Sie eine warme Umgebung mit einem Heizkissen aufrecht, bis die Mäuse vollständig wach sind.

5. Aufsatz für einen am Heck montierten Temperaturlogger

1. Programmierung und Initialisierung des Loggers (siehe Verfahren in Schritt 4.1, Ändern des Aufzeichnungsintervalls auf 2 Minuten).
2. Reinigen Sie den Schwanz mit einem Ethanol-Wisch. Desinfizieren Sie die 3D-Hülle mit 70% Ethanol und befestigen Sie den Temperaturlogger im Inneren der Hülle.
3. Tragen Sie schnell aushärtenden Klebstoff auf die Hülle auf. Positionieren Sie den Logger 1 cm von der Heckbasis entfernt (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass die Erkennungsfläche des Loggers in engem Kontakt mit der Haut steht. Stellen Sie sicher, dass der Logger auf der ventralen Seite des Schwanzes befestigt ist, um die Bewegungsbelastung zu minimieren.
4. Halten Sie es 2 Minuten lang mit Druck an Ort und Stelle. Verwenden Sie bei Bedarf eine kurze Narkose für eine präzise Platzierung.
   HINWEIS: Überwachen Sie täglich die Schwanzschwellung oder die Ablösung des Loggers nach der Platzierung. Ein ordnungsgemäß angeschlossenes Gerät kann mindestens 3 Tage lang gut bleiben.

6. Laufbandbetrieb und Datenerfassung

1. Akklimatisieren Sie die Mäuse während der Lichtphase 3 Tage lang an das Laufband unter Verwendung des Protokolls in Schritt 1.3.
   1. Platzieren Sie die Mäuse einzeln auf dem stationären Laufband. Planen Sie 10 Minuten für die Erkundung und Gewöhnung der Umgebung ein.
   2. Führen Sie das Protokoll aus:
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messen . Klicken Sie auf Start , um das Laufband zu initialisieren.
      2. Wählen Sie Profil starten , um das programmierte Ausführungsprotokoll zu starten.
2. Befestigen Sie den Hecktemperaturlogger 24 h vor den Experimenten, um eine gute Gewöhnung zu gewährleisten (siehe Schritt 5).
3. Laufband läuft in der leichten Phase des Experimentiertages:
   1. Zeichnen Sie die Ausgangstemperatur 10 Minuten vor dem Training 30 s lang mit einer Infrarotkamera auf. Gleichzeitig wird die Kerntemperatur mit dem implantierten Bauchtemperaturlogger erfasst.
   2. Lassen Sie Mäuse auf dem Laufband gemäß dem Protokoll in Schritt 1.3 laufen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mäuse 600 s lang ununterbrochen laufen. Wenn Mäuse aufhören zu laufen, ermutigen Sie sie vorsichtig mit einer Haarbürste zur fortgesetzten Bewegung.
   3. Setzen Sie die Mäuse nach dem Lauf des Laufbandes in saubere Käfige um. Messen Sie die Schwanztemperatur per Infrarot-Thermografie bei 0 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten und 15 Minuten nach dem Training.

7. Datenanalyse

1. Für Infrarot- und Kerntemperaturdaten:
   1. Berechnen Sie die Baseline als die durchschnittliche Temperatur vor dem Training.
   2. Plotten Sie ΔT (Temperatur-Baseline nach dem Training) für jeden Zeitpunkt.
2. Für Daten von Hecktemperaturloggern:
   1. Verwende den 10-minütigen Durchschnitt vor dem Training als Ausgangswert.
   2. Berechnen Sie ΔT in 2-Minuten-Intervallen für 15 Minuten nach dem Training.

Ergebnisse

Entwicklung eines zuverlässigen thermoregulatorischen Überwachungssystems

Um ein zuverlässiges Modell für die Messung der Kern- und Hauttemperatur zu erstellen, wurde eine kundenspezifische 3D-gedruckte Schwanzhülse entwickelt, die einen Temperaturlogger 1 cm von der Basis des Schwanzes entfernt sicher befestigt (Abbildung 1A), was eine kontinuierliche und präzise Messung der Wärmea...

Diskussion

Diese Studie etabliert ein praktisches und quantitatives Mausmodell zur Untersuchung von Hitzewallungen in den Wechseljahren und schließt damit eine kritische Lücke in diesem Bereich. Die Integration der Ovariektomie mit der belastungsinduzierten Thermogenese rekapituliert erfolgreich die Kernmerkmale menschlicher Hitzewallungen, nämlich einen raschen Anstieg der Schwanzhauttemperatur, gefolgt von einer Abnahme der Körperkerntemperatur¹⁸. Dieses Modell kombiniert ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Implantierbarer Temperaturlogger für Tiere	Stern-Oddi	DST nano-T
C57BL/6J Mäuse	GemPharmatech GmbH	N000013
Giemsa Färbelösung	Beyotime	Nr. C0133
Infrarot-Wärmebilder	VarioCAM	VC HD-Kopf 980
Laufband-Systeme	TSE	Treadmill_6M