CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

Zusammenfassung

Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.

Zusammenfassung

Entomopathogene Nematoden (EPNs) der Gattungen Steinernema und Heterorhabditis pflegen mutualistische Interaktionen mit symbiotischen Bakterien Xenorhabdus bzw. Photorhabdus . Gemeinsam infizieren und töten diese Nematoden-Bakterien-Paare Insektenwirte, die hauptsächlich aus Larven aus den Reihen der Lepidoptera und Coleoptera bestehen, und bilden ein handhabbares dreiteiliges System zur Analyse der molekularen Grundlage von Mutualismus und Parasitismus. Ein wichtiger Schritt zur vollständigen Nutzung dieses Modells ist die Entwicklung stabiler und transgenerationeller genetischer Werkzeuge in EPNs. Hier demonstrieren wir eine zuverlässige CRISPR–Cas9-Genom-Editierungsplattform im aufkommenden Modell Steinernema hermaphroditum, einer Art, die sowohl in vivo als auch in vitro leicht erhalten wird und sich sehr gut für gonadale Mikroinjektionen eignet. Wichtig ist, dass seine hermaphroditische Fortpflanzung die Entstehung und Pflege homozygoter Mutantenlinien erheblich vereinfacht. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für effiziente, gezielte Gendisruption unter Verwendung der mikroinjektionsbasierten Abgabe von Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexen. Als Konzeptnachweis modifizierten wir das konservierte, muskelassoziierte Gen unc-22 und erzeugten einen charakteristischen Muskelzuckungs-Phänotyp, der die gezielte Mutagenese in diesem System validiert. Diese CRISPR–Cas9-Plattform öffnet die Tür für stabile genetische Manipulationen in S. hermaphroditum, wie etwa die Expression von Transgenen, und bietet einen Rahmen, der auf weitere EPN-Arten von landwirtschaftlicher und ökologischer Bedeutung ausgeweitet werden kann.

Einleitung

Entomopathogene Nematoden (EPNs) sind insektentötende Parasiten, die artspezifische mutualistische Partnerschaften mit ihren bakteriellen Symbionten eingehen¹. EPNs bestehen aus zwei Familien: Steinermatidae und Heterorhabditidae, die mit gramnegativen Bakterien der Photorhabdus- bzw. Xenorhabdus-Arten ^2,3 assoziiert sind. Während des freilebenden infektiösen Juvenilstadiums (IJ) der Steinernema-Nematoden befinden sich die Xenorhabdus-Bakterien in einer Darmtasche des Nematoden, bekannt als Rezeptakel, und beim Eindringen des Insektenwirts in den Hämocoel werden die Bakterien freigesetzt, vermehren sich und töten das Insekt durch Septikämie ^3,4. In dieser mutualistischen Beziehung produzieren die Bakterien antimikrobielle und insektizide Verbindungen, die gegen die Immunantwort des Wirts schützen und dem^Nematoden ernährungsphysiologische Unterstützung bieten. Im Gegenzug profitieren die Bakterien vom Schutz des Nematodenwirts gegen Umweltmikroben und werden bei ihrer Ausbreitung auf neue Insektenbeute ^6,7 erleichtert.

In den letzten Jahrzehnten wurde die Partnerschaft zwischen Steinernema und Xenorhabdus als leistungsstarkes experimentelles System etabliert, um verschiedene Aspekte parasitärer und mutualistischer Interaktionen zu untersuchen, wie etwa das Wirtssuchen von Insekten³, bakterielle Besiedlung im Nematodenwirt⁸ und adaptive Verhaltensweisen symbiotischer Bakterien, die deren Übergänge zwischen Nematoden und Wirtsorganismen ermöglichen⁹. EPNs sind auch wichtige Arten für die Bodennachhaltigkeit und werden als organische Schädlingsbekämpfungsmittel zur Förderung der landwirtschaftlichen Produktivität^eingesetzt.

Trotz der raschen Entwicklung genetischer Werkzeuge in den symbiotischen Bakterien Xenorhabdus und Photorhabdus¹² waren konsistente genetische Werkzeuge in EPNs selten. Gonadale Mikroinjektion wurde sowohl bei Heterorhabditis als auch bei Steinernema-Nematoden ^13,14 erfolgreich etabliert. Zuvor wurde die gonadale Mikroinjektion in Heterorhabditis bacteriophora eingesetzt, um bei der ersten Nachfolgegeneration^13,15 konsequent doppelsträngige RNA zur Gen-Knockdown zu liefern. Kürzlich wurde die CRISPR-Cas9-Genom-Editierung in Steinernema entwickelt, die durch gonadale Mikroinjektion verabreicht wurde und zu präzisen, stabilen und erblichen Mutationen führte¹⁴.

Eine Steinernema-Art, S. hermaphroditum, wurde als sehr gut handhabbar gezeigt und hat großes Potenzial als aufkommendes genetisches Modellorganismus ^4,14. Ursprünglich aus dem Boden in Indonesien¹⁶ isoliert und in Indien¹⁷ erneut isoliert, ist S. hermaphroditum durchgehend hermaphroditisch, mit einer kleinen Anzahl von Männchen in jeder Generation – zwei Merkmale, die die Anpassung genetischer Werkzeuge des klassischen Modellnematoden C. elegans⁴ erleichtern. Darüber hinaus wurde das Genom von S. hermaphroditum sequenziert und zu Chromosomen zusammengesetzt, was die Aufgabe der Identifizierung potenzieller Cas9-Zielstellen und der Entwicklung von Primern¹⁸ vereinfacht.

Während der Mikroinjektion von EPN wird eine Injektionsmischung mit geeigneten Reagenzien wie dsRNAs, Cas9-Proteinen oder Guide-RNAs über eine aus einer Quarzkapillare gezogene Nadel an die Gonade des Synzytialnematoden abgegeben. Das entsprechende Volumen und der Druck der Injektion führen zu einem sichtbaren 'Fluss' der Flüssigkeit durch den Gonadenarm. Da diese Nematoden ein Paar synzytiale Gonaden besitzen, die aus Keimzellkernen bestehen, die denselben Zytosol¹⁹ teilen, ermöglicht dieser Mikroinjektionsansatz, mehrere Keimzellen zur Bearbeitung zugänglich zu machen, bevor die Zytokinese eintritt, wodurch die Keimzellkerne in sich entwickelnde Oocyten²⁰ getrennt werden. Obwohl die gonadale Mikroinjektion als konsistente Methode zur genetischen Modulation bei mehreren Arten von Nicht-Modellnematoden^{dient, ist} es entscheidend, die Injektionstechniken an die geeigneten gonadalen Strukturen, das Lebensstadium und den physiologischen Zustand jeder Nematodenart anzupassen, um Erfolg und hohe Effizienz bei der Verabreichung sicherzustellen. Wiederherstellungstechniken nach der Injektion und die Pflege der Mutantenlinien sind beide wichtig, um diese Methode kosteneffizient zu machen.

Diese Studie demonstriert ein CRISPR-Cas9-Genom-Editierungsprotokoll in Steinernema hermaphroditum. Die gonadale Mikroinjektion wird im jungen Erwachsenen beschrieben, einem Stadium, das widerstandsfähig gegen Hochdruck-Mikroinjektion ist und empfänglich für Gen-Editierung¹⁴ ist. Darüber hinaus werden detaillierte Methoden zur Erhaltung erblicher und stabiler mutierter Linien bereitgestellt, sowohl durch Kryokonservierung als auch durch Vermehrung durch Insekten.

Protokoll

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Nematodenpräparation vor der Mikroinjektion

1. Bereiten Sie Nematoden-Growth Media (NGM)-Platten vor, die mit den Bakterien Xenorhabdus griffiniae und Comamonas aquaticus besät sind.
   HINWEIS: Züchten Sie S. hermaphroditum-Nematoden auf ihrem einheimischen symbiotischen Bakterium Xenorhabdus griffiniae vor der Mikroinjektion, um das Wachstum der Nematoden zu maximieren und injizierte Tiere auf dem Bakterium Comamonas aquaticus zurückzugewinnen, um das Überleben nach der Injektion zu erhöhen¹⁴.
   1. Streifen Sie das Bakterium X. griffiniae auf LB-Pyruvat-Agarplatten (2,5 g Hefeextrakt, 5 g Trypton, 2,5 g Natriumchlorid, 0,5 g Natriumpyruvat, 7,5 g Agar in 500 ml Wasser) und über Nacht bei 30 °C inkubieren.
   2. Streifen Sie das Bakterium C. aquaticus auf LB-Agarplatten und brüten Sie über Nacht bei 37 °C aus.
   3. Wähle eine einzelne Bakterienkolonie aus, um dunkles LB-Flüssigmedium zu inokulieren (5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton, 5 g Natriumchlorid in 1 L Wasser). Bakterienkulturen über Nacht (maximal 16 Stunden) mit Belüftung (X. griffiniae bei 30 °C und C. aquaticus bei 37 °C) anbauen.
   4. NGM-Agar vorbereiten: (3 g NaCl, 2,5 g Pepton und 20 g Agar zu 975 ml Wasser hinzugefügt, mit 1 ml Cholesterin, 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO₄, 25 ml 1 M KPO₄ nach der Autoklavierung hinzugefügt) 10 ml pro 60 mm x 15 mm Petrischale.
   5. Samenbakterien: Geben Sie einige Tropfen der Bakterienkultur über Nacht auf jede NGM-Agarplatte und schütteln Sie sie vorsichtig, um die bakteriellen Tröpfchen in einem Fleck zu verteilen.
   6. Inkubieren Sie mit Bakterien gesäte NGM-Platten bei Raumtemperatur, damit Agar trocknen und Bakterien wachsen können.
      HINWEIS: Teller mit X. griffiniae-Samen sollten so bald wie möglich verwendet werden; C. aquaticus-Platten können 1–2 Wochen bei Zimmertemperatur gelagert werden.
2. Nematoden-Inszenierung
   HINWEIS: Wählen Sie das J3-Stadium des Hermaphroditen in der Nacht vor der Injektion und am Tag der Injektion junge Erwachsene.
   1. Nehmen Sie S. hermaphroditum-Nematoden auf die vorbereiteten NGM-Platten, die mit X. griffiniae besät sind. Inkubieren Sie bei einer Temperatur von 25–28 °C für optimales Wachstum.
   2. Am Abend vor der Mikroinjektion nehmen Sie das J3-Stadium der Hermaphroditen auf NGM-Agar, das mit X. griffiniae ausgesät ist.Wie in Abbildung 1A gezeigt, wird das J3-Stadium anhand der Größe des Nematoden und der Morphologie der Gonaden und der Vulva geschätzt.
   3. Am Tag der Mikroinjektion wählen Sie junge erwachsene Hermaphroditen (Abbildung 1B).

2. CRISPR-Cas9-Vorbereitung für Mikroinjektion

1. Auswahl der CRISPR-crRNAs und der Speicherung von Reagenzien
   1. Extrahieren Sie die Zielgensequenz aus dem Referenzgenom Steinernema hermaphroditum mit BlastP, PRJNA982879.
   2. Wählen Sie eine früh kodierende Exonsequenz, wenn möglich, vorzugsweise das erste Exon, und geben Sie die Sequenz mit den Standardeinstellungen²⁶ in CRISPRScan ein, um eine Liste möglicher CRISPR-RNAs (crRNAs) zu erstellen.
   3. Sprengen Sie die obersten crRNAs gegen das Genom von S. hermaphroditum , um sicherzustellen, dass nur einzigartige crRNAs ausgewählt werden.
      HINWEIS: Optional: Bestätigen Sie die Sequenz der Zielregion des Genoms durch PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung vor dem crRNA-Design, um eine effiziente Bindung von crRNAs sicherzustellen.
   4. Lagert die CRISPR-RNAs (crRNAs) und universelle transaktivierende CRISPR-RNAs (TracrRNAs) jeweils bei 100 μM im Duplexpuffer bei -80 °C.
   5. Cas9-Protein bei 10 mg/mL bei -20 °C oder -80 °C aufbewahren. Lagern Sie 1 M KCl bei 4 °C.
2. Herstellung des 2%-Agarose-Polsters für die Injektion (adaptiert von Berkowitz et ^al.27)
   1. Schmelze 2 % Agarose in Wasser in einer Mikrowelle.
   2. Übertragen Sie 50 μL geschmolzenen Agarose auf ein Deckglas (48 x 60 mm Nr. 1). Decken Sie den Agarosetropfen sofort mit einem weiteren Deckglas ab.
   3. Lass die Agarose 20 Minuten bei Zimmertemperatur trocknen. Entfernen Sie das obere Deckglas. Beschrifte die Vorderseite des Agarose-Pads.
      HINWEIS: Optional: Backen Sie das Agarosepad über Nacht bei 37 °C, um das Agarosepad weiter zu trocknen.
   4. Lagere die 2%-Agarose-Binden monatelang bis jahrelang bei Zimmertemperatur.
3. Nadelvorbereitung
   1. Stelle Quarznadeln mit den folgenden Parametern auf einem Laserfilamentzieher her. Mit dem in dieser Studie verwendeten Nadelzieher lautet das vorgeschlagene Programm wie folgt: Hitze: 700, Filament: 4, Geschwindigkeit: 60, Verzögerung: 145, Zug: 175.
   2. Ziehen Sie die Quarznadeln (OD: 1,0 mm, ID: 0,7 mm) unmittelbar vor der Injektion oder im Voraus heraus und bewahren Sie sie in einer Pipettenaufbewahrungsbox auf.
      HINWEIS: Alternativ haben wir auch Erfolg mit Borosilikatnadeln (OD: 1,2 mm, ID: 0,68 mm). Beachte, dass verschiedene Nadelgrößen zu unterschiedlichen Größen von Nadelhaltern passen.

3. CRISPR-Cas9 Mikroinjektion und Rückgewinnung der Nematoden nach Mikroinjektion

1. Bereite die CRISPR-Cas9-Mikroinjektionsmischung vor (adaptiert von Wang et ^al.28)
   1. Bereiten Sie frische Guide-RNA-Duplexe vor, indem Sie die ausgewählten crRNAs und universelle TracrRNA in einem Verhältnis von 1:1 mischen, also der Gesamtmenge von crRNA zu TracrRNA in einer PCR-Röhre:
      crRNA #1 (100 μM) - 1,5 μL
      crRNA #2 (100 μM) - 1,5 μL
      TracrRNA (100 μM) - 3,0 μL
      HINWEIS: Bei Verwendung von Co-CRISPR zielt crRNA #1 auf das unc-22-Markergen ab, während crRNA #2 durch eine andere Sequenz ersetzt werden kann, die ein zweites interessierendes Gen anspricht.
   2. Inkubieren Sie das PCR-Rohr in einem Thermocycler bei 94 °C für 2 Minuten und kühlen Sie dann auf Raumtemperatur ab.
   3. Fügen Sie die Injektionsmischung zusammen, indem Sie Folgendes kombinieren und dann 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      gRNA-Duplexe (ab Schritt 3.1.1) - 2,7 μL
   4. Mischen Sie dreimal, indem Sie das PCR-Röhrchen schnippen, gefolgt von einem kurzen Drehen (10–15 Sekunden) in einer Mini-Zentrifuge, um den Inhalt des Röhrchens aufzufangen. Nach dem endgültigen Mixen länger, bis zu 1 Minute.
2. Lade und zerstöre die Nadel
   1. Laden Sie die Nadel mit 1–2 μL Injektionsgemisch mit einer Mikrolader-Spitze.
   2. Setzen Sie die Nadel an den Pipettenhalter (Nadelhalter) zusammen und brechen Sie die Spitze auf, indem Sie die Nadel über ein Stück doppelseitiges Klebeband ziehen, das mit Halocarbonöl bedeckt ist. Teste die Öffnung der Nadel mit der CLEAN-Funktion des Mikroinjektors.
3. Mikroinjektion in die synzytialen Gonaden eines jungen erwachsenen Nematoden
   1. Übertragen Sie einen kleinen Tropfen Halocarbonöl auf ein 2%-Agarose-Pad.
   2. Unter dem Sektierenden Stereoskop verwenden Sie einen dünnen (weichen) Platindraht, um einen jungen erwachsenen Hermaphroditennematoden aufzuheben und ihn in einem M9-Puffer (pro Liter: 3 g KH₂PO4, 11,3 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, mit 1 ml 1 M MgSO₄ nach der Autoklavierung hinzuzufügen), um Bakterien zu entfernen (siehe junger erwachsener Nematode in Abbildung 1).
   3. Übertragen Sie die gewaschene Nematode auf ein Agarosepad und legen Sie sie in den Tropfen des Halokarbonöls. Verwenden Sie einen weichen Platindraht, um den Nematoden vorsichtig zu bürsten, bis das Tier bewegungsunfähig ist.
   4. Legen Sie das Agarose-Pad vorsichtig auf die Mikroinjektionsphase. Die Ausrichtung des gonadalen Synzytiums sollte etwa in einem Winkel von 45° zur Nadel zeigen. Beginne mit einer 5-fachen Vergrößerung und wechsle dann zu 20- und 40-facher Vergrößerung für die Injektionen.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Nadel das Synzytium durchdringt, und nutzen Sie dann die CLEAN-Funktion des Mikroinjektors , um die Injektionsmischung mit etwa 99 psi einzuführen, bis ein klarer gonadaler Fluss der injizierten Flüssigkeit festgestellt wird, um sicherzustellen, dass Reagenzien die Keimzellen im gonadalen Synzytium erreichen.
   6. Wenn der zweite Gonadenarm zugänglich ist, bewegen Sie die Stufe, um die Nadel für die Injektion in den zweiten Arm zu positionieren.
4. Nematodenerholung nach der Injektion
   1. Unmittelbar nach der Injektion wird das injizierte Tier in 1–2 μL M9-Puffer auf dem Agarose-Pad wieder suspendiert.
   2. Mit einem dünnen Platindraht nimm den eingespritzten Nematoden vom Agarose-Pad und spüle das Öl mit M9-Puffer ab.
   3. Wiederholen Sie die Nematoden auf NGM-Platten mit einem Rasen aus C. aquatica-Bakterien (NGM-Plattenpräparation: siehe Schritt 1.1), was die Überlebensrate der Nematoden nach der Injektion erhöht¹⁴. Über Nacht bei 25 °C inkubieren.
   4. Am nächsten Tag isolieren Sie jeden injizierten Nematoden (P0) auf eine einzelne NGM-Platte, die mit X. griffiniae ausgesät ist. Lassen Sie P0-Tiere über Nacht F1-Nachkommen produzieren (entweder durch Eiablegen oder Beuteln) zur Phänotypisierung und Genotypisierung (siehe Schritt 4).

4. Screening zur Bestätigung von CRISPR-Cas9-vermittelten Knockouts

1. Nikotinbasierter (VORSICHT) Test von F1 auf Zuckungen im Phänotyp bei Verwendung von UNC-22 als Co-CRISPR-Marker
   1. Übertrage F1-Nachkommen von injizierten P0-Tieren in eine Stelle mit 2% Nikotinlösung.
   2. Nehmen Sie ein zuckendes Tier aus der Nikotinzone und nehmen Sie das Tier sofort mit NGM-Agar aus, das mit X. griffiniae besetzt ist. Isoliere jedes zuckende F1 auf einer einzelnen Platte und lasse es F2-Tiere für die Genotypisierung produzieren (siehe Schritt 4.2).
2. Genotypisierung
   1. Wähle acht F2- oder F3-Nachkommen aus jeder F1-Twitching-Linie für die Genotypisierung. Diese Tiere umfassen wahrscheinlich sowohl +/mut heterozygote als auch mut/mut homozygote Tiere.
   2. Bereiten Sie einen frischen DNA-Extraktionspuffer vor, indem Sie 20 μL Proteinase K (10 mg/mL) zum 180 μL Wurmlysepuffer hinzufügen (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM MgCl₂, 0,45 % NP-40, 0,45 % Tween 20, 0,01 % Gelatine).
   3. Fügen Sie Nematoden zu 10 μL des DNA-Extraktionspuffers in PCR-Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 65 °C, dann 15 Minuten bei 95 °C, um genomische DNA zu extrahieren.
   4. Genotypisieren Sie die Nematoden, indem Sie den Cas9-Zielbereich gemäß den Anweisungen des Herstellers per PCR-Amplifizierung durchführen, wobei 1-2 μL Lysat aus Schritt 4.2.2 verwendet wird. Es ist wichtig, möglichst ausreichend Platz (mindestens 300 bp) zwischen den Cas9-Schnittstellen und den Primer-Bindungsstellen einzuplanen, falls große Deletionen auftreten.
      HINWEIS: Die Agarosegel-Elektrophorese kann verwendet werden, um eine erfolgreiche Verstärkung vor der Sequenzierung zu bestätigen.
   5. Reinigen Sie das PCR-Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers, um eine genaue Sanger-Sequenzierungs-Spuranalyse sicherzustellen.
   6. Sequenzieren Sie die in Schritt 4.2.4 erzeugten PCR-Amplikone mit Sanger-Sequenzierung und analysieren Sie die Chromatogramme mit dem ICE-Programm²⁹.
   7. Wenn mutierte Allele in Schritt 4.2.6 bestätigt sind, kehren Sie zur ursprünglichen F1-Zuckungsplatte zurück und isolieren Sie mindestens acht Hermaphroditen auf einzelnen Platten. Lassen Sie jeden einzelnen Nematoden Nachkommen produzieren und nehmen Sie dann einen Massengenotyp des Nachkommens auf, um die Homozygotie zu bestätigen. Homozygote Linien können im Labor wie in Schritt 5 beschrieben aufrechterhalten werden.

5. Wartung der CRISPR-Leitung

HINWEIS: Es gibt drei Hauptmethoden der Leitungspflege. Dazu gehören Trehalose-DMSO-basierte Kryokonservierung (Schritt 5.1), in-vivo-Passaging durch Wachswürmer (Schritt 5.2) und In-vitro-Wartung auf NGM-Platten (Schritt 5.3).

1. Trehalose-DMSO-Kryokonservierung von Wildtyp- und Mutantenlinien
   HINWEIS: Mit der Trehalose-DMSO-Kryokonservierungsmethode⁴ kann S. hermaphroditum langfristig bei -80 °C gelagert und auf NGM-Medium wiedergewonnen werden. Nematoden werden in 2-ml-kryogenen Fläschchen eingefroren. Das optimale Einfrieren wird durch schrittweise Abkühlung mit einem Polystyrolschaumbehälter erreicht.
   1. Pflanzen Sie S. hermaphroditum auf NGM, die mit X. griffiniae ausgesät ist (siehe Schritt 1.1), bis die Mehrheit der Population J1 oder Hermaphroditen im Beutel ist.
      HINWEIS: Vermeiden Sie infektiöse Juvenilstadien (IJ), da sie mit dieser Methode nicht gut einfrieren.
   2. Waschen Sie Nematodenwürmer von NGM-Agarplatten im M9-Puffer ab und sammeln Sie sie in 15-mL-konischen Röhren bis zur 5-mL-Marke. Konzentration durch Zentrifugation (1372 x g für 1–2:30 Minuten ausreichen).
   3. Entfernen Sie den Supernatant und waschen Sie einmal im Trehalose-DMSO-Gefrierpuffer bei Raumtemperatur bei Raumtemperatur durch Zentrifugation gemäß den in Schritt 5.1.2 angegebenen Parametern.
   4. Die Würmer in einem 5-mL Trehalose-DMSO-Gefrierpuffer bei Raumtemperatur wieder suspendieren. Inkubiere bei Zimmertemperatur 30 Minuten mit dem Schlauch auf der Seite. Das erhöht die Überlebensrate.
   5. Gib 1 ml pro Röhre in 4 kryogenen Phiolen ab.
   6. Stellen Sie die Fläschchen in Polystyrolschaum-Boxen in den -80 °C Gefrierschrank.
   7. Eine Woche später: Testauftauen eines der Fläschchen.
   8. Füllen Sie die restlichen Phiolen in -80°C Gefrierboxen und lagern Sie sie dauerhaft.
   9. Das Testauftauen oder die Bergung von S. hermaphroditum aus gefrorenen Beständen
      1. Nehmen Sie ein Fläschchen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es bei Zimmertemperatur vollständig auftauen.
      2. Gießen Sie den flüssigen Inhalt auf eine frische NGM-Platte. Beachten Sie, dass die Zugabe eines symbiotischen Bakteriums nicht notwendig ist, da der gefrorene Bestand in der Regel genügend symbiotische Bakterien enthält. Die Würmer sollten innerhalb von Minuten bis Stunden mit der Erholung beginnen.
      3. Beobachte die Bewegung und Fortpflanzung des Nematoden. Nach ein oder zwei Tagen überträgt man mehrere Nematoden auf neue NGM-Platten, die mit X. griffiniae ausgesät sind.
2. In-vivo-Pflege durch die Galleria mellonella
   HINWEIS: Für das Wachstum in vivo vermehren Sie S. hermaphroditum-mutierte Linien durch Larven des 5^. Larvenstadiums von Galleria mellonella (Wachswurm). Diese Methode ist besonders nützlich für Linien, die nach der Kryokonservierung nicht mehr lebensfähig sind. Ein detailliertes und ähnliches Protokoll der natürlichen Vermehrung entomopathogener Nematoden durch Insekten und andere Medien für das EPN-Wachstum findet sich in (McMullen et ^al.30). Kurz gesagt:
   1. Lass Nematoden verhungern und auf NGM-Platten zu IJs werden.
   2. Verwenden Sie den M9-Puffer, um IJs von den NGM-Platten zu entfernen.
   3. Übertragen Sie IJs, um Galleria-Insekten mit der Weißen Falle zu infizieren.
3. Für die In-vitro-Wartung auf NGM-Platten folgen Sie den folgenden Schritten:
   1. Samen-NGM-Platten mit etwa 100 μL frischer flüssiger Kultur des Symbionten von S. hermaphroditum , X. griffiniae.
   2. Lassen Sie das bakterielle Patch vollständig trocknen, bevor Sie die Nematoden auf die Platte legen.
   3. Die Platten werden bei 25 °C gelagert und die Nematoden etwa einmal im Monat auf frisch ausgesäte Platten übertragen.

Ergebnisse

Zwei CRISPR-RNAs wurden entworfen (identifiziert durch die Pam-Standortnummer – Pam 3 und Pam 5) und zielen auf den Homologen S. hermaphroditum von unc-22 an zuvor veröffentlichten Pam-Standorten¹⁴ (Abbildung 2A). Jede crRNA wurde mit TracrRNA komplexiert, um eine einzelne Leit-RNA (sgRNA) zu bilden, und wurde in Cas9 eingebaut, um das Ribonukleoprotein wie in Schritt 3.1 beschrieben zu bilden. In diesem Protokoll wu...

Diskussion

Unkonventionelle genetische Modelltiersysteme bieten wertvolle Möglichkeiten, die Funktion eukaryotischer Gene innerhalb der ökologischen und physiologischen Kontexte zu untersuchen, in denen diese Eigenschaften natürlich auftreten, zum Beispiel in Anwesenheit eines parasitären Wirts oder des natürlichen Mikrobioms eines Organismus. Bei entomopathogenen Nematoden (EPNs) basiert die genetische Manipulation auf einigen Fällen RNAi-basierter Ansätze^13,32.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar (80-100 Mesh)	Fisher Scientific	BP26411	Verwendet auch in LB Pyruvatplatten
Agarose	Fisher Scientific	16500500	Verwendet auch im Genotypisierungsverfahren
Alt-R CRISPR-Cas9 TracrRNA	IDT	1072532
Alt-R S.p. Cas9-Nuklease V3	IDT	1081058
Borosilikatnadeln	Welt-Präzisionsinstrument	1B120F-4
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901
Cholesterin	VWR	433	5 mg/mL in Ethanol
Comamonas aquatica (DA1877)
Abdeckglas für Agarose-Pad	Hirnforschungslabore	#4860-1D	48 x 60 mm Dicke Nr1
CRISPRScan			https://www.crisprscan.org/
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301	0,5 M
DNA Clean und Concentrator-5	Zymo-Forschung	D4014
FemtoJet 4x Mikroinjektor mit Griffkopf-Set 4 Größe 0 Nadelhalter	Eppendorf/Calibre	5253000017
Larven von Galleria melonella 5. Stadium	GrubCo		https://www.grubco.com/index.cfm
Gelbildgebungssystem	Azure400	AZI400-01
Gel-Ladefarbe	Thermo Fisher Scientific	B72
Gelatine (2 %)	Sigma Aldrich	G1393
GelRed	Biotium	#41003
Genotypisierungsprimer: DNA-Oligo, 25 nmol	IDT	N/A
Gibco Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
Gibco Bacto Trypton	Fisher Scientific	DF0123-17-3	Verwendet auch in Dark LB, LB Pyruvatplatten
Gibco Bacto Hefeextrakt	Fisher Scientific	DF0127-17-9	Verwendet auch in Dark LB, LB Pyruvatplatten
Griffkopf-Set 4 Größe 1 Nadelhalter	Kaliber	EPE-5196083008	(in Kombination mit Borosilikatnadel 1B120F-4)
Halocarbonöl 700	Sigma Aldrich	H8898
Hartplatin-Drahtwurmpickel für die tägliche Pflege	Tritech-Forschung	PT-9901
Schlussfolgerung von CRISPR-Bearbeitungen (ICE)	Synthego	N/A	Software, die zur Analyse von Sanger-Sequenzen zur Identifizierung von Indels verwendet wird
KCl	Sigma Aldrich	P9541
Laser-Nadelzieher P-2000	Sutter	P-2000G
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266
Magnesiumsulfat (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506	Für den M9-Puffer, auch in NGM verwendet.
Microloader-Tipp 2x96ST	Kaliber	930001007
Mikromanipulator-Montageadapter für Zeiss Axio Observer und Axiovert 200	Tritech-Forschung	NZ-19-2
Mikroskop	Tritech	SMT1
Nikotin	Sigma Aldrich	N3876
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85124
Nukleasefreier Duplexpuffer	IDT	11-01-03-01
OneTaq MasterMix	NEB	M0486
Pipettenaufbewahrungsbox	Sutter-Instrumente	BX10
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma Aldrich	793590
Kaliumphosphat, dibasisch (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786	KOH für NGM
Kaliumphosphat, monobasisch (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655	Für den M9-Puffer, auch in NGM verwendet.
Proteinase K	Sigma Aldrich	P6556
Quarznadeln	Sutter-Instrumente	QF100-70-10
S. hermaphroditium Genom	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAs	IDT	N/A
Natriumchlorid (NaCl)	VWR	SS0430	Verwendet auch in M9, Dark LB, LB Pyruvate Plates
Natriumphosphat, dibasisch (Na2HPO4,7H20)	Sigma Aldrich	S9390	Für den M9-Puffer
Natriumpyruvat	Sigma Aldrich	P2256	Verwendet auch in LB-Pyruvatplatten
Weicher Platin-Drahtwurmpickel für Mikroinjektion	Surepure Chemetals	6824	Platin 90 %, Iridium 10 % Legierungsdraht, 0,002 Zoll Durchmesser x 5 Fuß lang
Standardnadelhalter	Tritech-Forschung	HI-7
<>Steinernema hermaphroditum
Stereomikroskop	Leica	Inveta 3
Trehalose	Cole-Parmer	EW-88195-99	0,08 m
Tris	Fisher Scientific	AM9855G	pH 8,0
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Vertikaler Mikromanipulator-Montageadapter	Tritech-Forschung	NR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)