Pharmakophormodellierung für Targets mit umfangreichen Ligandenbibliotheken: Eine Fallstudie zu SARS-CoV-2 Mpro

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Konstruktion eines Konsensus-Pharmakophor-Modells vorgestellt, indem molekulare Merkmale aus mehreren Liganden integriert werden. Diese Methode ist anwendbar für die Wirkstoffforschung, die auf jedes biologische Ziel mit bekannten ligandengebundenen Konformationen abzielt, und ermöglicht die Identifizierung wichtiger Interaktionsmerkmale für das virtuelle Screening und das rationale Wirkstoffdesign.

Zusammenfassung

Ein Pharmakophor definiert die räumliche Anordnung molekularer Merkmale, die für optimale Wechselwirkungen zwischen einer Verbindung und ihrem biologischen Ziel erforderlich sind. Diese Modelle können abgeleitet werden, indem die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen einem Ziel und einer Reihe bekannter Liganden in ihren Bindungskonformationen analysiert werden. Ein Konsensus-Pharmakophor integriert gemeinsame Merkmale mehrerer Liganden, wodurch die Modellverzerrung reduziert und die Vorhersagekraft verbessert wird. Die Generierung eines robusten Konsensus-Pharmakophors aus einem großen und chemisch vielfältigen Ligandensatz stellt jedoch eine technische Herausforderung dar.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Konstruktion von Konsensus-Pharmakophoren unter Verwendung von ConPhar vor, einem Open-Source-Informatikwerkzeug, das entwickelt wurde, um pharmakophore Merkmale über mehrere ligandengebundene Komplexe hinweg zu identifizieren und zu clustern. Das Protokoll umfasst die Modellgenerierung, -verfeinerung und -anwendung auf das virtuelle Screening ultragroßer molekularer Bibliotheken. Als Fallstudie haben wir die Methode auf die SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro) angewendet, wobei wir hundert nicht-kovalente Inhibitoren verwendeten, die mit dem Ziel cokristallisiert waren. Das resultierende Pharmakophormodell erfasste wichtige Interaktionsmerkmale in der katalytischen Region von Mpro und ermöglichte die Identifizierung neuer potenzieller Liganden.

Diese Strategie ist auf jedes biologische Ziel anwendbar, für das ligandengebundene Konformationen verfügbar sind. Es ist besonders wertvoll für Targets mit umfangreichen Ligandendatensätzen und unterstützt die rationale Wirkstoffforschung, indem es die Identifizierung neuer Kandidaten mit gewünschten Interaktionsprofilen rationalisiert.

Einleitung

Die Pharmakophormodellierung ist eine grundlegende Technik im computergestützten Wirkstoffdesign, die die Identifizierung wesentlicher molekularer Merkmale ermöglicht, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind ^1,2. Ein Pharmakophor definiert die räumliche Anordnung von Merkmalen wie Wasserstoffbrückendonatoren, Akzeptoren, aromatischen Ringen und hydrophoben Regionen, die für die molekulare Interaktion zwischen einem Liganden und einem biologischen Ziel erforderlich sind³. Wenn mehrere Liganden-Ziel-Komplexe verfügbar sind, entweder aus der experimentellen Kristallographie oder aus der molekularen Modellierung, können die gemeinsamen Interaktionsmuster in Konsensus-Pharmakophormodelle integriert werden, wodurch die Robustheit des Modells erhöht und die Genauigkeit des virtuellen Screenings verbessert^{wird 4,5}.

Trotz der Nützlichkeit von Konsensus-Pharmakophoren bleibt ihre Erzeugung eine technische Herausforderung, insbesondere wenn die Liganden strukturell unterschiedlich sind. Für die Generierung von Pharmakophoren aus einzelnen Liganden stehen mehrere Softwaretools zur Verfügung, es fehlen jedoch standardisierte Verfahren zur Integration mehrerer Merkmalssätze in ein kohärentes Modell ^6,7. Darüber hinaus bieten nur wenige Plattformen End-to-End-Workflows, die Feature-Clustering, Filterung und Export in Formaten unterstützen, die mit Screening- und Visualisierungstools kompatibel sind⁸. Diese Einschränkungen haben die breite Einführung von Konsensus-Pharmakophoren in groß angelegten Wirkstoffforschungsbemühungen eingeschränkt.

Um diese Lücke zu schließen, wurde ConPhar als neuartiges Open-Source-Tool entwickelt, das speziell für die systematische Extraktion, das Clustering und die Konsensmodellierung pharmakophorer Merkmale aus umfangreichen Sätzen von vorausgerichteten Liganden-Ziel-Komplexen entwickelt wurde. Im Gegensatz zu bestehender Software bietet ConPhar eine flexible Parameterabstimmung, eine automatisierte Funktionsintegration und Kompatibilität mit mehreren Ausgabeformaten, was die Generierung robuster Konsensmodelle erleichtert, die für virtuelle Screening-Pipelines geeignet sind. Dieses Tool überwindet damit bisherige Engpässe im Umgang mit großen und chemisch unterschiedlichen Ligandenbibliotheken und verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in den Arbeitsabläufen der Pharmakophormodellierung.

Um diesen Ansatz zu demonstrieren, stellen wir ein reproduzierbares Protokoll zur Konstruktion von Konsensus-Pharmakophormodellen aus Sammlungen von Liganden-Ziel-Komplexen vor. Der Workflow integriert Open-Source-Tools für die Extraktion von Pharmakophormerkmalen, Clustering, Visualisierung und nachgelagerte Anwendungen. Als Fallstudie haben wir das Protokoll auf die SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro) angewendet, ein kritisches therapeutisches Ziel mit umfangreichen strukturellen Daten⁹. Wir haben einen Datensatz von 100 nicht-kovalenten Liganden kuratiert, die mit Mpro kokristallisiert wurden (PDB-Einträge vom 27. Mai 2025), ohne Apo-Formen und redundante Komplexe. Einzelne pharmakophore Merkmale wurden extrahiert und mit ConPhar, einem speziell für das Feature-Clustering entwickelten Tool, zu einem Konsensusmodell zusammengeführt¹⁰. Dieser Fall veranschaulicht die Fähigkeit des Protokolls, konservierte Interaktionsmuster aufzudecken und ein rationales Screening ultragroßer Bibliotheken zu unterstützen.

Protokoll

1. Methode 1

1. Bereiten Sie Liganden für die Konsensus-Pharmakophor-Generierung vor
   1. Richten Sie alle Protein-Liganden-Komplexe mit der PyMOL-Software¹¹ aus.
   2. Extrahieren Sie jeden ausgerichteten Ligandenkonformer und speichern Sie ihn als separate Datei im SDF-Format.
      HINWEIS: Andere Formate wie MOL, MOL2 und PDB können auch für das hier beschriebene Protokoll verwendet werden.
2. Generieren von Pharmakophor-JSON-Dateien mit Pharmit¹²
   1. Laden Sie jede Ligandendatei einzeln auf Pharmit hoch, indem Sie die Option "Features laden" verwenden (siehe Materialtabelle für einen Link zu Pharmit).
   2. Verwenden Sie die Option Save Session , um die entsprechende Pharmakophor-JSON-Datei herunterzuladen.
3. Organisieren Sie die JSON-Dateien für die Verwendung in ConPhar
   1. Speichern Sie alle heruntergeladenen JSON-Dateien in einem einzigen Ordner. Diese Dateien werden in der nächsten Methode in die Google Colab-Umgebung hochgeladen.

2. Methode 2

1. Einrichten der Google Colab-Umgebung
   1. Starten Sie ein neues Google Colab-Notebook: Öffnen Sie Google Colab im Webbrowser, erstellen Sie ein neues Notebook und passen Sie die Einstellungen an, um eine frühere Version zu verwenden, indem Sie Runtime → Change runtime → 2025.07 Runtime Version auswählen.
   2. Installieren Sie Conda und PyMOL. Der Code, der für die Installation von Conda und PyMOL in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      # CondaColab installieren: Aktiviert die Unterstützung der Conda-Umgebung in Google Colab
      von IPython.utils importieren io
      Importieren Sie tqdm.notebook
      Importieren von Betriebssystemen
      Gesamt = 100
      mit tqdm.notebook.tqdm(total=total) als pbar:
      mit io.capture_output() wie erfasst:
      # CondaColab installieren
      !pip install -q condacolab
      Condacolab importieren
      condacolab.install()
      pbar.update(10)
      # Aktualisieren Sie den Python-Pfad, um installierte Pakete zu finden
      SYS importieren
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.update(20)
      # Installieren Sie das PyMOL-Bundle mit Mamba aus dem Schrödinger-Kanal
      %shell mamba install -c schrödinger, pymol-bundle --yes
      pbar.update(90)
   3. Überprüfen der erfolgreichen Ausführung: Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken. Nach erfolgreicher Ausführung erscheint ein horizontaler grüner Balken über der Zelle (siehe Abbildung 1).
2. Installieren Sie das ConPhar Python-Paket und importieren Sie die erforderlichen Module
   1. Installieren und importieren Sie ConPhar. Der Code, der für die Installation des ConPhar-Pakets und den Import der erforderlichen Module in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      # Installieren Sie das ConPhar Pharmakophor-Analysepaket
      Pymol importieren
      !pip install conphar
      von Conphar. Pharmakophore importieren parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json, compute_concensus_pharmacophore
      Importieren von Betriebssystemen
      Pandas als PD importieren
      HINWEIS: Die import-Anweisung von conphar. Pharmakophore sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in mehrere Zeilen unterteilt, sollten jedoch als eine einzige durchgehende Linie eingegeben werden. Das ConPhar-Tool (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) befindet sich in aktiver Entwicklung. Das aktuelle Protokoll verwendet eine stabile Version (0.1.2), die für die beschriebene Vorgehensweise validiert wurde. Benutzer werden aufgefordert, diese Version zu verwenden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
   2. Erfolgreiche Installation bestätigen: Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken. Nach erfolgreicher Installation und Import von ConPhar-Tools erscheint eine Bestätigungsmeldung (siehe Abbildung 2).
3. Laden einzelner Pharmakophormodelle aus JSON-Dateien
   1. Erstellen Sie einen Ordner für Pharmakophor-JSON-Dateien. Der Code, der zum Erstellen eines Ordners zum Speichern der Pharmakophor-Eingabedateien in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      # Erstellen Sie einen Ordner zum Speichern von JSON-Eingabedateien.
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=Wahr)
      HINWEIS: Mit diesem Befehl wird der Ordner automatisch erstellt, wenn er noch nicht vorhanden ist.
   2. JSON-Dateien in den Ordner hochladen: Klicken Sie auf das Ordnersymbol im linken Bereich von Colab, öffnen Sie den neu erstellten Ordner und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Hochladen auszuwählen. Fügen Sie die erforderlichen JSON-Dateien hinzu (siehe Abbildung 3).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dateien dem erwarteten Format entsprechen, das von Pharmit generiert wurde.
4. Analyse und Konsolidierung pharmakophorer Merkmale
   1. Extrahieren Sie pharmakophore Merkmale aus hochgeladenen Dateien. Der Code, der zum Parsen der hochgeladenen JSON-Dateien, zum Extrahieren pharmakophorer Merkmale und zum Speichern in einem einzigen DataFrame in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      p4_table=pd. DataFrame()
      für Datei in os.listdir('/content/JSON_FOLDER'):
      Wenn '.json' in der Datei:
      versuchen:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/Inhalt/JSON_FOLDER/{Datei}")
      p4['ligand']=file.replace('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table,p4],ignore_index=Wahr)
      außer Ausnahme:
      bestehen
      p4_table
   2. Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken, um den konsolidierten DataFrame zu generieren (siehe Abbildung 4). Der resultierende konsolidierte DataFrame fasst alle pharmakophoren Merkmale, die aus einzelnen Liganden extrahiert wurden, in einer einheitlichen Tabelle zusammen und erleichtert so das nachgelagerte Clustering und die statistische Analyse.
      HINWEIS: Das Skript enthält eine grundlegende Ausnahmebehandlung, um fehlerhafte JSON-Dateien während der Verarbeitung zu umgehen und eine Unterbrechung des Workflows zu verhindern. Angesichts der großen Anzahl von Dateien ist es unpraktisch, jede Datei vorher zu überprüfen. Stattdessen kann das Skript so geändert werden, dass der Name jeder Datei ausgegeben wird, die nicht geladen werden kann, sodass der Benutzer sie einzeln überprüfen und korrigieren kann.
5. Generieren und Speichern des Konsensus-Pharmakophors
   1. Zeigen Sie alle pharmakophoren Deskriptoren an. Der Code, der erforderlich ist, um die pharmakophoren Deskriptoren zu visualisieren, die aus den Eingabedateien in Google Colab extrahiert wurden, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
   2. Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken, um die Clusterbildung pharmakophorer Merkmale zu visualisieren (siehe Abbildung 5). Feature-Clustered Outputs gruppieren ähnliche pharmakophore Merkmale über mehrere Liganden hinweg basierend auf ihren räumlichen Positionen, was die Identifizierung konservierter Interaktionsmuster ermöglicht.
   3. Speichern Sie das Pharmakophormodell im PyMOL-Format. Der Code, der zum Generieren und Speichern des Konsensus-Pharmakophor-Modells in einem PyMOL-kompatiblen Format in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
   4. Führen Sie die Zelle aus, um die entsprechende PSE-Datei zu erstellen (siehe Abbildung 6).
   5. Speichern Sie das Pharmakophormodell im JSON-Format. Der Code, der zum Generieren und Speichern des Konsensus-Pharmakophor-Modells in einem Pharmit-kompatiblen Format in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      'ConPhar_pharmit.json')
   6. Führen Sie die Zelle aus, um die entsprechende .json Datei zu erzeugen (siehe Abbildung 6).
   7. Generieren Sie Feature-Clustered-Ausgaben und Dendrogramme. Der Code, der zum Generieren von Konsensus-Pharmakophor-Dateien erforderlich ist, die nach Merkmalstyp gruppiert sind, einschließlich PyMOL- und Pharmit-kompatiblen Formaten, und Dendrogramm-Visualisierungen in Google Colab wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      Konsens,Links=compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=Wahr,out_folder='/Inhalt')
   8. Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken (siehe Abbildung 7). Die Ergebnisse zeigen Dendrogramm-Visualisierungen, die in Form eines Baums die hierarchischen Beziehungen zwischen geclusterten pharmakophoren Merkmalen darstellen und den Benutzern helfen, den Grad der Ähnlichkeit und räumlichen Nähe zwischen Clustern zu interpretieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden mehrere Ausgabedateien und Abbildungen im angegebenen Ordner gespeichert.
   9. Exportieren Sie die Konsensus-Pharmakophor-Ergebnisse in eine CSV-Datei. Der Code, der zum Speichern der endgültigen Konsensus-Pharmakophor-Tabelle im CSV-Format in Google Colab erforderlich ist, wird hier in kursiver Form als Referenz bereitgestellt, und das vollständige ausführbare Skript ist auch in der unterstützenden Datei 1 verfügbar.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', Index=Falsch)
   10. Führen Sie die Zelle aus, indem Sie auf das Wiedergabesymbol klicken oder Umschalt + Eingabetaste drücken, um die Konsensus-Pharmakophordaten zur weiteren Analyse in eine CSV-Datei mit dem Namen consensus_result.csv zu exportieren (siehe Abbildung 8).
       HINWEIS: Die CSV-Datei erleichtert nachgelagerte Anwendungen wie statistische Analysen oder Visualisierungen in Tabellenkalkulationssoftware.
6. Verwenden Sie das Konsensus-Pharmakophor für das virtuelle Screening
   1. Exportieren Sie das Konsensus-Pharmakophor im JSON-Format. Stellen Sie sicher, dass die Datei Raumkoordinaten für alle Features enthält. Dieses Format ist direkt mit webbasierten Screening-Tools wie Pharmit¹² kompatibel. Um ein virtuelles Screening durchzuführen, laden Sie die JSON-Datei des Pharmakophors über die Option Features laden auf den Pharmit-Server hoch. Der Server ermöglicht die Verfeinerung des Modells durch Ändern, Hinzufügen oder Entfernen von Funktionen sowie das Screening mit großen Verbindungsbibliotheken, wie z. B. PubChem¹³oder ZINC¹⁴.
      HINWEIS: Alle Skripte, die zur Reproduktion der in dieser Studie beschriebenen Analysen erforderlich sind, sind in der unterstützenden Datei 1 enthalten und können auch interaktiv über https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing aufgerufen werden. Die Leser werden aufgefordert, eine persönliche Kopie des Colab-Notizbuchs zu erstellen, um die Analysen auszuführen und zu ändern, ohne das ursprüngliche Skript zu ändern.

Abbildung 1: Screenshot des ersten Codeblocks, der zum Einrichten der Google Colab-Umgebung durch die Installation von CondaColab verwendet wurde. Während der Ausführung wird ein horizontaler blauer Fortschrittsbalken über der Zelle angezeigt, der nach erfolgreichem Abschluss grün wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Screenshot des zweiten Codeblocks, der zur Installation des ConPhar-Pakets in Google Colab verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Screenshot der Pharmakophor-JSON-Dateien, die erfolgreich in den dafür vorgesehenen Ordner in Google Colab hochgeladen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Screenshot des Codes, der verwendet wird, um pharmakophore Merkmale aus den JSON-Dateien zu extrahieren und sie in einem einzigen DataFrame zu konsolidieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Visualisierung des Clusterings von pharmakophoren Merkmalen, die während der Erstellung des Konsensus-Pharmakophor-Modells generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Screenshot der erfolgreichen Generierung der Konsensus-Pharmakophor-Dateien in PyMOL- und Pharmit-kompatiblen Formaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Screenshot der Generierung von Konsensus-Pharmakophordateien, geclustert nach Merkmalstyp, einschließlich Ausgaben für PyMOL-, Pharmit- und Dendrogramm-Visualisierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Screenshot des erfolgreichen Exports der Konsensus-Pharmakophor-Daten in die consensus_result.csv-Datei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Einhundert Mpro-Komplexe, die mit verschiedenen nicht-kovalenten Inhibitoren kokristallisiert waren, wurden ausgerichtet, wie in Abbildung 9A dargestellt. Jeder Ligand wurde dann als einzelne Datei extrahiert (Abbildung 9B) und anschließend auf den Pharmit-Server hochgeladen. Die Sitzung wurde gespeichert, um eine entsprechende JSON-Datei zu generieren (siehe Abbildung 9C).

Abbildung 9: Ligandenvorbereitung für die Konsensus-Pharmakophor-Modellierung. (A) Strukturelle Ausrichtung von drei repräsentativen Mpro-Komplexen, die mit nicht-kovalenten Inhibitoren kokristallisiert sind. (B) Überlagerung der 100 Liganden, die in dieser Studie enthalten sind. (C) Hochladen jedes Liganden auf den Phartit-Server mit der Option "Funktionen laden", gefolgt von der Generierung einer JSON-Datei über die Option "Sitzung speichern". Beide Optionen sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der vollständige Satz von JSON-Dateien wurde verwendet, um das Konsensus-Pharmakophor-Modell zu generieren, das 1450 pharmakophore Merkmale umfasste, die in 110 Cluster gruppiert waren: 23 aromatische (Aro), 30 Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA), 16 Wasserstoffbrückendonoren (HBD), 36 hydrophobe (Hyd) und 5 negativ geladene (Anionen) Cluster (Abbildung 10A, Ergänzende Tabelle 1). Wir identifizierten die größeren Cluster für jedes Merkmal für ihre Einbeziehung in das Konsensmodell. Unter den Aro-Clustern haben wir diejenigen mit mehr als 20 Elementen ausgewählt. Aus den HBA-, HBD- und Hyd-Gruppen haben wir Cluster mit mindestens 50 Elementen beibehalten. Keiner der Anionencluster hatte mehr als 4 Mitglieder, so dass sie aus dem Konsensusmodell ausgeschlossen wurden (Abbildung 10B). Diese numerischen Schwellenwerte (>20 Mitglieder für Aro; ≥50 für HBA, HBD und Hyd) wurden empirisch basierend auf der Verteilung der Clustergrößen definiert, um die am stärksten konservierten und am dichtesten besiedelten Interaktionsmuster zu priorisieren.

Abbildung 10: Clustering von pharmakophoren Merkmalen aus 100 Mpro-Liganden-Komplexen. (A) Verteilung von 1450 pharmakophoren Merkmalen: aromatisch (Aro) in violett, Wasserstoffbrückenakzeptor (HBA) in orange, Wasserstoffbrückendonor (HBD) in weiß, hydrophob (Hyd) in grün und negativ geladen (Anion) in rot. (B) Cluster mit ≥10 Mitgliedern werden für Aro, HBA, HBD und Hyd angezeigt; Alle Anionen-Cluster werden angezeigt. Die größten Cluster – definiert als solche mit ≥20 Elementen für Aro und ≥50 Elementen für HBA, HBD und Hyd und ≥4 Elementen für Anion – werden mit gestrichelten Kugeln hervorgehoben. Die Anzahl der Elemente in jedem der größten Cluster wird explizit angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Daher umfasste unser Konsensus-Pharmakophor-Modell 11 Merkmale: 3 aromatische (Aro) Merkmale, Aro 1, 2 und 3, abgeleitet von Clustern mit 20, 24 bzw. 45 Mitgliedern; 4 Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA), HBA 1, 2, 3 und 4, aus Clustern mit 51, 55, 77 bzw. 81 Mitgliedern; 2 Wasserstoffbrückendonatoren (HBD) aus Clustern mit 51 bzw. 71 Mitgliedern; und 2 hydrophobe (Hyd) Merkmale aus Clustern mit 50 bzw. 52 Mitgliedern (siehe Abbildung 11A).

Das Pharmakophormodell wurde verwendet, um die PubChem-Datenbank mit der zuvor berichteten Strategie zu durchsuchen¹⁰, aber es wurden keine Übereinstimmungen gefunden. Um die Flexibilität der Suche zu erhöhen, wurde das aromatische Merkmal Aro 1 - abgeleitet vom kleinsten und am wenigsten repräsentativen Cluster - entfernt. Diese Anpassung führte zur Identifizierung von zwei Treffern, einschließlich eines Konformers der Verbindung mit den PubChem CIDs 101267741 und 10285538 (siehe Abbildung 11B). Die chemische 2D-Struktur der Verbindung 101267741 ist in Abbildung 11C dargestellt. Interessanterweise passt diese identifizierte Mischung gut in die Mpro-Bindungstasche. Eine vergleichende Analyse mit dem co-kristallisierten Liganden 38a¹⁵ (PDB-ID: 9HAJ) zeigt, dass der pharmakophor-passende Konformer von 101267741 sogar tiefer als 38a in den S1- und S2-Subtaschen von Mpro vergraben ist. 38a nimmt jedoch einen breiteren Bereich der Tasche ein, hauptsächlich aufgrund seiner Ethylcarboxamid-Seitenkette, die sich in Richtung der S1'-Tasche erstreckt. Nichtsdestotrotz betreffen die wichtigsten intermolekularen Wechselwirkungen von 38a andere Einheiten und nicht diese Seitenkette. Im Gegensatz dazu bildet die Verbindung 101267741 11 intermolekulare Wechselwirkungen, darunter sieben Wasserstoffbrückenbindungen und vier hydrophobe Kontakte. Verglichen mit den drei Wasserstoffbrückenbindungen und zwei hydrophoben Wechselwirkungen, die von 38a gebildet werden, erscheint der Bindungsmodus von Verbindung 101 stärker (Abbildung 11D).

Abbildung 11: Pharmakophor-Suche in der PubChem-Datenbank. (A) Das vollständige Konsensus-Pharmakophor-Modell enthält 11 Merkmale: 3 aromatische (violett), 4 Wasserstoffbrückenakzeptoren (orange), 2 Wasserstoffbrückendonatoren (weiß) und 2 hydrophob (grün). (B) Der Konformer der Verbindung PubChem 101267741 nach Entfernung des Aro 1-Merkmals mit dem reduzierten Pharmakophormodell ausgerichtet, und (C) Die zweidimensionale chemische Struktur der Verbindung wurde identifiziert. (D) Vergleichende Analyse der Bindungsmodi der Verbindung 38a (magenta; von PDB-ID: 9HAJ) und der Verbindung PubChem CID 101267741 (grün) zur katalytischen SARS-CoV-2-Mpro-Tasche. Die entsprechenden intermolekularen Wechselwirkungen für jede Verbindung sind auf der rechten Seite dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen sind als gestrichelte Linien in Blau bzw. Grau dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Unterstützende Datei 1: Pharmakophor-Workflow-Skript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Unterstützende Tabelle 1: Clustering-Zusammenfassung der pharmakophoren Merkmale. Anzahl der Cluster, Mitglieder pro Cluster, Schwerpunktkoordinaten und Cluster-Radien Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Modellierung von Pharmakophoren unterstützt die rationale Wirkstoffforschung¹⁶. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll wurde für die Generierung eines Konsensus-Pharmakophors für die SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro) ausgehend von Dutzenden von nicht-kovalenten Inhibitoren verwendet, kann aber auf jedes biologische Ziel mit bekannten ligandengebundenen Konformationen angewendet werden, insbesondere auf solche mit umfangreichen Ligandendatensätzen. Im Vergleich zu einzelnen Pharmakophoren oder rein ligandenbasierten Modellen erhöht dieser Konsensusansatz die Robustheit und reduziert die Verzerrung durch die Integration mehrerer Ligandenkonformationen. Das von diesem Protokoll generierte Konsensus-Pharmakophor-Modell kann auf verschiedene molekulare Bibliotheken angewendet werden, einschließlich öffentlicher Datenbanken wie ChEMBL¹⁷und ZINC¹⁴, kommerzieller Sammlungen und proprietärer hauseigener Verbindungsbibliotheken. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die Erforschung breiter und vielfältiger chemischer Räume in virtuellen Screening-Kampagnen und erhöht so die Wahrscheinlichkeit, neuartige bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Somit unterstützt dieser Workflow die Identifizierung neuartiger bioaktiver Verbindungen mit den gewünschten Interaktionsprofilen.

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die genaue Vorbereitung und Ausrichtung von Liganden-Ziel-Komplexen. Eine präzise Vorausrichtung der Liganden in ihren bioaktiven Konformationen ist unerlässlich, um eine sinnvolle und zuverlässige Integration von Merkmalen zu gewährleisten, da eine Fehlausrichtung die Vorhersagekraft des Modells schwächen kann¹⁰. Um eine optimale Ausrichtung zu erreichen, empfehlen wir eine strukturelle Überlagerung mit konservierten Proteinbindungsstellenresten oder Rückgratatomen. Bei Datensätzen mit unterschiedlichen Liganden verbessert die Ausrichtung wichtiger Interaktionspunkte oder pharmakophorer Merkmale die Konsistenz im gesamten Satz. Darüber hinaus wird eine sorgfältige manuelle Inspektion und Korrektur von Ausreißer-Ligandenkonformationen empfohlen, um Artefakte zu vermeiden, die die Modellgenauigkeit beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus erleichtert der Open-Source-Charakter von ConPhar die Integration in andere Rechenworkflows sowie erweiterte Anpassungen der Clustering-Parameter. Erfahrene Benutzer können die Clustering-Parameter pharmakophorer Merkmale modifizieren, um ein Gleichgewicht zwischen Modellallgemeinheit und Spezifität zu erhalten. Diese Modifikationen können durch die Größe des Ligandendatensatzes, die chemische Vielfalt oder die Zielkomplexität gesteuert werden. Wenn es sich beispielsweise um sehr unterschiedliche Liganden handelt, kann durch schrittweises Clustering oder Subgruppenanalyse relevante Merkmale besser erfasst^{werden 18}.

Das ConPhar-Tool befindet sich derzeit in der aktiven Entwicklung. Dies bietet eine erhebliche Flexibilität für Anwender, die das Tool an spezifische Forschungsbedürfnisse anpassen möchten, einschließlich der Integration mit komplementären Software-Pipelines. Da die Software jedoch weiterhin Änderungen erfahren kann, wird den Benutzern empfohlen, offizielle Updates zu überwachen und die versionsspezifische Dokumentation zu konsultieren. Das Melden von aufgetretenen Problemen trägt zu einer kontinuierlichen Verbesserung und einer breiteren Validierung durch die Community bei. Unser Protokoll wird Modelle mit umfassenden Interaktionsmustern erstellen, so dass sie für das virtuelle Screening großer Bibliotheken eingesetzt werden können. In unseren repräsentativen Ergebnissen haben wir das erhaltene Pharmakophor zur Identifizierung von zwei neuen potentiellen Liganden für die katalytische Region von Mpro verwendet. Letztendlich rationalisiert diese Konsensus-Pharmakophor-Methode die Trefferidentifikation und beschleunigt die Lead-Optimierung.

Wir identifizieren jedoch die folgenden Einschränkungen des Protokolls: i) Abhängigkeit von qualitativ hochwertigen ligandengebundenen Strukturen, da niedrig aufgelöste Daten die Modellgenauigkeit verringern können; ii) das Risiko, einzigartige und wichtige Wechselwirkungen zu übersehen, die für bestimmte Liganden entscheidend sind, da die Konsensus-Pharmakophoren gemeinsame Merkmale betonen; und iii) die Reproduzierbarkeit kann durch unterschiedliche Merkmalsdefinitionen in verschiedenen Softwaretools beeinflusst werden¹⁹. Diese Einschränkungen können jedoch durch die Verfeinerung der Struktur eines Protein-Liganden-Systems durch Molekulardynamik-Simulationen²⁰, die Cluster-Retention auf der Grundlage von Benutzerwissen und den konsequenten Einsatz von Software zur Identifizierung pharmakophorer Merkmale überwunden werden.

Obwohl das Konsensus-Pharmakophor-Modell in diesem Protokoll nicht mit klassischen binären Metriken validiert wurde, wurde seine Vorhersagefähigkeit in einer früheren Studie nachgewiesen¹⁰. In dieser Arbeit wurde ein unabhängiger Testsatz von 78 chemisch unterschiedlichen Liganden verwendet, um ein Konsensus-Pharmakophor zu validieren, das mit der gleichen Methodik erstellt wurde. Das Validierungsset umfasste Liganden mit einer Tanimoto-Ähnlichkeit von ≤0,5, Molekülmassen zwischen 200 und 700 g/mol, ≤17 drehbare Bindungen und mindestens drei pharmakophore Merkmale. Das Modell identifizierte erfolgreich bekannte Wirkstoffe, was seine Anwendbarkeit in virtuellen Screening-Arbeitsabläufen und seine Robustheit bei chemisch unterschiedlichen Kandidaten unterstützt.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Konstruktion von Pharmakophormodellen, die umfassende Interaktionsmuster erfassen, die für das Ziel charakteristisch sind. Dies ist besonders wertvoll für Ziele mit umfangreichen Ligandendaten, wie z. B. virale Proteasen, Kinasen und nukleäre Rezeptoren²¹. Die generierten Modelle eignen sich für das virtuelle Screening großer Wirkstoffbibliotheken, was die Identifizierung neuer bioaktiver Kandidaten erleichtert. Durch die Hervorhebung konservierter und funktionell relevanter Merkmale unterstützt der Konsensus-Pharmakophor-Ansatz sowohl die Entdeckung von Treffern in der Frühphase als auch die anschließende Leitstrukturoptimierung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Google Colab	Google LLC	https://colab.google	Webbasierte Plattform zum Ausführen von Python-Notebooks; wird hier verwendet, um ConPhar- und PyMOL-Skripte für die Konsensus-Pharmakophor-Modellierung auszuführen.
Pharmit	Koes Lab an der Universität Pittsburgh	https://pharmit.csb.pitt.edu/search.html	Webplattform für interaktives virtuelles Pharmakophor-Screening und chemische Weltraumforschung, die das Hochladen von Ligandendateien und die Generierung von Pharmakophormerkmalen ermöglicht
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://www.pymol.org	Software zur molekularen Visualisierung und strukturellen Ausrichtung für Proteine Komplexe Überlagerung und Analyse von Liganden
Unterstützende Datei 1 Pharmakophor-Workflow-Skript	Google LLC	https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing	Vollständiges ausführbares Skript für die Installation von Conda, PyMOL und die Ausführung des Pharmakophor-Workflows in Google Colab. Auch als unterstützende Datei 1 bereitgestellt.