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Forschungsartikel

Schützende Rolle von Klotho bei der Schädigung von Kardiomyozyten, verursacht durch Hypoxie-Reoxygenierung durch Regulation der NF-κb-Signalkaskade.

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DOI:

10.3791/68946

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5. Dezember 2025

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bewertet die schützende Rolle der Klotho-Überexpression in H9C2-Kardiomyozyten unter Hypoxie-Reoxygenierung mittels molekularer und funktioneller Tests.

Zusammenfassung

Diese Studie hatte zum Ziel, die schützende Rolle des Klotho bei Kardiomyozyten zu untersuchen, die einer Hypoxie-/Reoxygenierungs-(H/R)-Verletzung ausgesetzt sind. Ein in-vitro-H /R-Modell wurde unter Verwendung von H9C2-Ratten-Kardiomyoblasten entwickelt, die mit klotho-überexprimierenden lentiviralen Vektoren transfiziert wurden. Die Zellen wurden in sechs experimentelle Gruppen unterteilt: Kontrollgruppe, H/R, negative Kontrolle (NC), Klotho-Überexpression, PDTC (ein NF-κB-Inhibitor) und eine Kombinationsgruppe, die mit Klotho und Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurde. Die Klotho-Expressionswerte wurden durch quantitative Echtzeit-PCR und westliche Blotting bestimmt. Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels MTT-Test gemessen, während die Apoptose mittels Durchflusszytometrie bewertet wurde. Die Expression der Proteine, die am NF-κB-Signalweg beteiligt sind, wurde mittels Western Blotting analysiert, und die zelluläre Expression proinflammatorischer Zytokine wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung bewertet. Die Klotho-Überexpression erhöhte signifikant die Klotho-Spiegel in H9C2-Zellen und führte zu einer verbesserten Zelllebensfähigkeit, einer reduzierten Apoptose und einer verminderten zellulären Expression proinflammatorischer Zytokine im Vergleich zur H/R-Gruppe. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Klotho-Überexpression sowie die PDTC-Behandlung die Aktivierung des NF-κB-Pfades unterdrücken, was sich durch ein reduziertes p-P65/P65-Verhältnis und erhöhte p-IκBα/IκBα-Spiegel zeigt. Diese Effekte kehrten teilweise nach einer Kotherapie mit LPS wieder auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Klotho durch die Modulation der NF-κB-Signalübertragung, die Reduktion von Entzündungen und die Förderung des Zellüberlebens kardioschutz gegen H/R-induzierte Verletzungen verleiht. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung zugrunde liegen, sowie das therapeutische Potenzial von Klotho bei Herzentzündungen.

Einleitung

Der akute Myokardinfarkt (AMI) wird hauptsächlich durch Ischämie verursacht, gefolgt von Reperfusion, was umfangreiche Forschungen zu den Mechanismen der Myokardinhypoxie/Reoxygenierungs-(H/R)-Verletzung 1,2,3 angeregt hat. Ein entscheidender Aspekt der myokardialen H/R-Verletzung ist die Zellapoptose, die maßgeblich zum pathologischen Fortschreiten von AMI 4,5 beiträgt.

Jüngste Studien haben den nuklearen Faktor kappa B (NF-κB) Signalweg für myokardiale H/R-Schäden durch seine Modulation von Entzündungsreaktionen auf Reize wie Lipopolysaccharid (LPS) in Verbindung gebracht. Die Aktivierung von NF-κB erfolgt über zwei unterschiedliche Mechanismen: die kanonischen und nicht-kanonischen Wege9. Im kanonischen Weg basiert die Aktivierung auf der phosphorylationsinduzierten Degradierung des Inhibitors von kappa B alpha (IκBα)10. Es wurde jedoch auch berichtet, dass die Phosphorylierung der NF-κB-Untereinheit p65 die Apoptose antreiben kann, möglicherweise unabhängig von der IκBα-Degradation11. Klotho, ein transmembranäres Single-Pass-Protein, reguliert den Phosphat- und Kalziumstoffwechsel und hemmt die Insulinsignalübertragung 12,13,14. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Klotho hemmende Effekte auf die NF-κB-Aktivierung in verschiedenen Geweben ausübt, darunter Nieren-, Hippocampus- und alternde Zellen, und so Entzündungen und Gewebeschäden mindert 15,16,17. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Rolle von Klotho bei AMI und seine mögliche Wechselwirkung mit dem NF-κB-Weg während einer myokardialen H/R-Verletzung weitgehend unerforscht.

Aus methodischer Sicht bietet das in-vitro H/R-Modell mit H9C2-Ratten-Kardiomyoblasten mehrere Vorteile gegenüber Tiermodellen, darunter kontrollierte Sauerstoffspannung, Reproduzierbarkeit und reduzierte Variabilität. Darüber hinaus ermöglicht die lentiviral-vermittelte Klotho-Überexpression eine stabile und effiziente Modulation der Genexpression, was eine direkte Untersuchung ihrer funktionellen Wirkung ermöglicht. Diese Ansätze machen das Protokoll praktisch, kosteneffizient und für mechanistische Studien zugänglich, während sie gleichzeitig die ethischen und logistischen Herausforderungen von In-vivo-Experimenten vermeiden.

Aus praktischen Gründen werden H9C2-Zellen in der kardiovaskulären Forschung weit verbreitet eingesetzt, da sie viele kardiomyozytähnliche Eigenschaften behalten, obwohl sie nicht vollständig den Phänotyp reifer Kardiomyozyten nachahmen. Die ausgewählte H/R-Bedingung (5 Stunden Hypoxie gefolgt von 1 Stunde Reoxygenierung) fällt in einen Bereich, der üblicherweise zur Modellierung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen in vitro verwendet wird. Ebenso ist lentivirale Transduktion mit Multiplizitäten der Infektion (MOI) um 100 ein Standardansatz, um eine effiziente Überexpression mit handhabbarer Zytotoxizität zu erreichen. Während diese Merkmale die Anwendbarkeit des Protokolls verbessern, sollten Einschränkungen wie eine unvollständige Wiederholung der In-vivo-Umgebung anerkannt werden. Daher zielt die vorliegende Studie darauf ab, zu untersuchen, wie Klotho Myokardzellen vor H/R-Verletzungen schützt, und ein reproduzierbares Protokoll zur Bewertung ihrer Wechselwirkung mit der NF-κB-Signalübertragung zu etablieren.

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Protokoll

Alle Verfahren mit der H9C2-Ratten-Kardiomyoblastzelllinie (ATCC, CRL-1446) wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheitsvorschriften durchgeführt. An dieser Studie waren weder Tiere noch Menschen direkt beteiligt. Abbildung 1 zeigt den grafischen Arbeitsablauf der experimentellen Design- und Analysepipeline. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur

Die H9C2-Ratten-Koronamyoblastenzelllinie (ATCC, CRL-1446) wurde in flüssigem Stickstoff mit einem Gefriermedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, hoher Glukose, 4,5 g/L) kryokonserviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO). Zur Bergung wurden die gefrorenen Fläschchen schnell in einem 37 °C Wasserbad für 2–3 Minuten aufgetaut und sofort in vorgewärmtes DMEM überführt. Das Kulturmedium wurde mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 3,7 g/L Natriumbicarbonat und 1 mM Natriumpyruvat hergestellt. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ gehalten. H9C2-Zellen zwischen den Passagen 6 und 20 wurden für alle Experimente verwendet. Frühe Passagen (P20) wurden nicht verwendet, um passagebedingten phänotypischen Drift zu vermeiden.

2. Lentivirale Überexpression von Klotho in H9C2-Zellen.

Ein selbstinaktivierender lentiviraler Vektor der dritten Generation, der das vollwertige Ratten-Klotho-(Kl)-Gen unter der Kontrolle des EF1α-Promotors codiert, wurde eingesetzt, um eine stabile Überexpression in H9C2-Zellen herzustellen. Das Konstrukt enthielt einen P2A-EGFP-Reporter zur Visualisierung, ein posttranskriptionelles regulatorisches Element (WPRE) des Woodchuck-Hepatitis-Virus und einen zentralen Polypurintrakt (cPPT) zur Transkriptstabilität sowie eine Puromycin-Resistenzkassette, die vom PGK-Promotor zur Selektion gesteuert wurde. Lentivirale Partikel wurden in HEK293T Zellen produziert, indem das Transferplasmid mit psPAX2 (gag/pol/rev) und pMD2.G (VSV-G) Plasmide im Verhältnis 4:3:1 mit Polyethylenein (PEI; DNA: PEI = 1:3, w/w). Supernatanten wurden bei 48 und 72 Stunden gewonnen, durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 10 Minuten geklärt, durch eine 0,45 μm PES-Membran gefiltert und durch Ultrazentrifugation bei 25.000 × g für 2 Stunden bei 4 °C konzentriert. Virale Pellets wurden in PBS mit 1 % rindischem Serumalbumin (BSA) resuspendiert, und funktionelle Titer (TU/mL) wurden durch eine Limiting-Dilution-Infektion von HEK293T Zellen mit EGFP-Anzeige bei 72 Stunden bestimmt. H9C2-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 2 × 105-Zellen pro Welle ausgesaat, was zum Zeitpunkt der Transduktion zu etwa 60 % Konfluenz führte. Lentivirale Partikel wurden mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 in 1 mL frisches Kulturmedium mit Polybren (8 μg/mL) ergänzt, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Das Inokulum wurde nach 12 Stunden entfernt und durch 2 ml vollständiges Medium ersetzt. 72 Stunden nach der Infektion wurde die Transduktionseffizienz durch EGFP-Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft. Zur Etablierung stabiler Zelllinien wurde Puromycin (2 μg/mL, vortitriert) 3–5 Tage ab 48 Stunden nach der Infektion angewendet, mit Mittelwechsel alle 48 Stunden. Die Überexpression von Klotho wurde durch RT-qPCR und Immunoblotting bestätigt. Alle lentiviralen Verfahren wurden unter der Eindämmung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt, und alle viralen Abfälle wurden mit 10 % Bleichmittel für mindestens 30 Minuten vor der Entsorgung inaktiviert.

3. Versuchsgruppen

H9C2-Zellen wurden in 6-Well-Platten (Wachstumsfläche 9,6 cm²) mit 3 × 10⁵-Zellen pro Bohrloch ausgesaat, was nach 24 Stunden etwa 70%–80 % Konfluenz ergab, der erforderlichen Dichte für die Verarbeitung von Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) und den anschließenden Assays. Nach der nächtlichen Anhaftung wurden die Zellen in sechs experimentelle Gruppen eingeteilt: (1) Kontrollgruppe, die keine zusätzliche Behandlung erhielt; (2) H/R-Gruppe, die Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) in einer versiegelten modularen Hypoxiekammer durchlief, gefolgt von 5 Stunden Hypoxie (1 % O₂, 94 % N₂, 5 % CO₂) und 1 Stunde Reperfusion (5 % CO₂), wie zuvor beschrieben18; (3) Negative Kontrollgruppe (NC), in der Zellen 24 Stunden vor der H/R-Behandlung mit einem leeren Vektor transfiziert wurden; (4) Klotho-Gruppe, in der Zellen mit lentiviralen Vektoren transfiziert wurden, die Klotho 24 h codieren, bevor die H/R-Behandlung durchgeführt wurde; (5) Pyrrolidin-Dithiocarbamat-Behandlungsgruppe (PDTC), die 24 Stunden vor H/R-Behandlungmit 200 mg/L NF-κB-Signalweginhibitor PDTC behandelt wurde; (6) Klotho + LPS-Gruppe, in der Zellen mit lentiviralen Vektoren transfiziert wurden, die für Klotho codieren, und anschließend mit Lipopolysaccharid bei 1 mg/L für 24 Stunden behandelt wurden, bevor die H/R-Behandlung20 begann.

4. qRT-PCR

H9C2-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Bohrloch ausgesaat. Nach der Behandlung wurde die Gesamt-RNA mittels eines Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokolls isoliert. Kurz gesagt wurde pro Bohrloch 1 ml Reagenz zugesetzt, gefolgt von Chloroform-Extraktion, Isopropanol-Ausfällung und Waschen mit 75 % Ethanol. Das RNA-Pellet wurde an der Luft getrocknet und in RNase-freiem Wasser gelöst. RNA-Konzentration und Reinheit wurden spektrophotometrisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese wurde 1 μg Gesamt-RNA rückwärts transkribiert mit einem kommerziellen Reverse-Transkriptions-Set gemäß dem Protokoll des Herstellers, einschließlich genomischer DNA-Entfernung und zufälliger Hexamer-Priming. Quantitative Echtzeit-PCR wurde in einem Echtzeit-PCR-System mit SYBR Green-Chemie unter folgenden Bedingungen durchgeführt: erste Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Die Primer-Sequenzen wurden mit Primer-BLAST (NCBI) entwickelt und von einem kommerziellen Anbieter synthetisiert: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTTAT-3′; (2) β-Aktin (interne Kontrolle): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2^-ΔΔCT-Methode berechnet, und die Amplifikationsspezifität wurde durch einen einzelnen Schmelzkurven-Peak bestätigt.

5. Westlicher Fleck

Proteine wurden aus H9C2-Zellen mittels Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA)-Puffer (200 μL pro Bohrloch einer 6-Well-Platte) extrahiert, ergänzt durch einen Proteaseinhibitor-Cocktail auf Eis. Die Proteinkonzentrationen wurden durch einen Bicinchinainsäure-(BCA)-Test gemessen, und gleiche Mengen Protein (20–30 μg) wurden pro Leitung auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel zur elektrophoretischen Trennung geladen. Die Proteine wurden mit einem Nasstransfersystem bei 100 V 90 Minuten bei 4 °C auf Polyvinyliden-Difluorid-(PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch blockiert, die 1 Stunde lang in TBST bei Zimmertemperatur zubereitet wurde und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Klotho (1:500), Phospho-p65 (1:500), p65 (1:500), Phospho-IκBα (1:500), IκBα (1:500) und β-Actin (1:1000) inkubiert wurde. Nach drei Wascharbeiten mit TBST wurden die Membranen mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (1:1000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem verbesserten chemilumineszenz-Detektionssystem visualisiert, und die Signalintensitäten wurden mit der ImageJ-Software mit identischen Schwellenwerten quantifiziert.

6. MTT-Prüfung

H9C2-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10³ Zellen pro Bohrloch in 100 μL vollständigem Medium ausgesat und über Nacht inkubiert, um die Haftung zu ermöglichen. Ein 10 μL Volumen MTT-Lösung (5 mg/mL in PBS) wurde jedem Brunnen zugegeben und 4 Stunden bei 37 °C unter befeuchteten Bedingungen mit 5 % CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Supernatant vorsichtig entfernt, und 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden hinzugefügt, um die Formazankristalle aufzulösen, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur und sanftem Schütteln. Die Absorption wurde anschließend mit 490 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen. Das erwartete visuelle Ergebnis war das Auftreten violetter Formazankristalle in lebensfähigen Zellen vor der DMSO-Addition und eine homogene violette Lösung nach der Auflösung.

7. Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Behandlung durch Trypsinisierung entnommen und durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C entnommen. Das Zellpellet wurde in 100 μL 1× Bindungspuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4) wieder suspendiert. Annexin V-APC und Propidiumiodid (PI) wurden im Verhältnis 1:2 gemischt, um eine 15 μL Färbelösung herzustellen, die der Zellsuspension zugesetzt wurde. Die Mischung wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden 400 μL desselben Bindungspuffers hinzugefügt, und die Proben wurden sofort mit einem Durchflusszytometer analysiert. Insgesamt wurden 10.000 Ereignisse pro Probe gesammelt. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert. Die Zellen wurden zunächst anhand von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) gegartet, um Trümmer auszuschließen, gefolgt von Quadrant-Gating von Annexin V vs. PI, um lebensfähige Zellen (Annexin V-/PI-), frühe apoptotische Zellen (Annexin V+/PI-) und späte apoptotische/nekrotische Zellen (Annexin V+/PI+) zu unterscheiden. Die Annexin-V-positive/PI-negative Färbung deutete auf eine frühe Apoptose hin, während die doppelt positive Färbung von Annexin V/PI auf späte Apoptose oder Nekrose hindeutete.

8. Immunfluoreszenz

H9C2-Zellen wurden auf sterilen Glasdeckfolien in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch ausgesat und behandelt. Die Zellen wurden bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten permeabilisiert und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert. Coverslips wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) und IL-6 (1:100) inkubiert. Nach drei Waschphasen in PBS wurden die Zellen mit phycoerythrin-(PE)-markierten sekundären Antikörpern (1:500) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Kerne wurden 5 Minuten lang mit DAPI gekontert. Deckfolien wurden auf Glasfolien mit Antifade-Montagemedium montiert, und Fluoreszenzsignale wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Die Bilder wurden mit ImageJ (Version 1.54) analysiert. Rote Fluoreszenz zeigte die Expression von Zytokinen an, während blaue Fluoreszenz die Kerne markierte.

9. Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit SPSS-Software analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten angegeben. Für mehrere Gruppenvergleiche wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test angewendet. Ein P-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Die Überexpression von Klotho verbessert das Überleben der Zellen und schwächt die durch NF-κB vermittelte entzündliche Schädigung ab

Um die Effizienz der Genlieferung zu bestätigen, wurde die Klotho-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene quantifiziert. Klotho-überexprimierende Zellen zeigten einen robusten Anstieg im Vergleich zu sowohl der Hypoxie-/Reoxygenierungs- (H/R)- als ...

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Diskussion

In dieser Studie wurde die schützende Rolle von Klotho bei kardiomyozyten, die einer Hypoxie-/Reoxygenierungs-(H/R)-Verletzung ausgesetzt waren, untersucht, und eine Überexpression von Klotho verbessert die Zelllebensfähigkeit signifikant, reduziert Apoptose und unterdrückt die proinflammatoriske Zytokinexpression. Diese Effekte gingen mit reduzierter Phosphorylierung von p65 und verstärkter Phosphorylierung von IκBα einher, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der NF-κB-Signalübertrag...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4 % ParaformaldehydBiosharpXG1050
Annexin V APC/PI FärbelösungElabscienceE-CK-A217
cDNA-Synthese-KitQiagen205410
DAPI-LösungBioFroxx1155MG010
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)HyCloneSH30243.01B
ECL-Detektionsreagenz-KitMeilunbioMA0186-1
Elektrophorese-Netzteil (POWER PAC 200)Bio-RadPOWER PAC 200
Fetales Rinderserum (FBS)VivaCellC04001-500, C04002-500
Durchflusszytometer (Gallios)Beckman CoulterGallios
Fluoreszenzmikroskop (BK6000)Chongqing OptecBK6000
Formazan-LösungsmittelSolarbioM1020
HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperBethylA120-101P
LPS (NF-κ B-Pfad-Agonist)Sigma-AldrichL2630
Mikroplattenleser (Modell K3)ThermoK3
Modulare Inkubatorkammer (Hypoxiekammer)Billups-RothenbergMIC-101
MTT-LösungCayman21795
PDTC (NF-κ B-Signalweginhibitor)Sigma-AldrichP8765
PE-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperBiossBS-0295G-PE
Polybren (Hexadimethrinbromid)InvitrogenX2351
PVDF-MembranMerckISEQ00010
Rabbit Anti-Rat IL-1β AntikörperBiorbytorb378927
Rabbit Anti-Rat IL-6 AntikörperZEN BIO384702
Rabbit Anti-Rat Iκ BΑ AntikörperBiorbytorb223182
Rabbit Anti-Rat Klotho AntikörperBiorbytorb333711
Rabbit Anti-Rat p65 AntikörperBiorbytorb229138
Rabbit Anti-Rat Phospho-Iκ BΑ AntikörperBiorbytorb223035
Rabbit Anti-Rat Phospho-NF-κ B p65 AntikörperBiorbytorb304662
Rabbit Anti-Rat TNF-α AntikörperBiorbytorb106548
Rabbit Anti-Rat β-Aktin AntikörperHuabioET1702
Echtzeit-Quantitatives PCR-System (LightCycler 96)RocheLight Cycler96
RIPA Lysis-PufferMredaMO52447
SDS-PAGE Gel-VorbereitungssetElabscienceE-IR-R305
TRIzol-Reagenz-KitLebenstechnologien15596-018

Referenzen

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