High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Zusammenfassung

Darin beschreiben wir die Protokolle zur Messung der Menge an fluoreszierendem Phospholipid, die spezifisch aus Lipidspenderpartikeln durch High-Density-Lipoprotein (HDL) entfernt wird, das im gesamten menschlichen Plasma oder Serum vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass diese Metrik der HDL-Funktionalität das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt.

Zusammenfassung

Die Plasmaspiegel des HDL-Cholesterins (High-Density-Lipoprotein) (HDL-C) sind derzeit eine wichtige Kennzahl für die klinische Beurteilung des Risikos für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die HDL-vermittelte Entfernung von Plaque-Lipiden aus Zellen und extrazellulären Ablagerungen in der Arterienwand ist eine von mehreren anti-atherogenen Funktionen von HDL, die für seine umgekehrte Assoziation mit dem CVD-Risiko verantwortlich sein könnten. Die HDL-vermittelte Entfernung von zellulärem Cholesterin in vitro hat sich kürzlich als ein noch besserer Prädiktor für das CVD-Risiko erwiesen als HDL-C.

HDL setzt sich aus einer heterogenen Population von Partikeln zusammen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen. HDL-Partikel, die an der Entfernung von atherosklerotischen Plaquelipiden beteiligt sind, enthalten austauschbare Apolipoproteine, hauptsächlich Apolipoprotein A-I, die von den Partikeln dissoziieren und dann Plaquelipide entfernen. Nascent HDL wird durch die Solubilisierung und Entfernung von Phospholipiden und Cholesterin aus ABCA1-generierten zellulären Plasmamembrandomänen durch HDL-abgeleitete austauschbare Apolipoproteine gebildet. Dieser Prozess spielt eine entscheidende Rolle sowohl bei der Prävention als auch bei der Rückbildung von atherosklerotischen Plaques.

Darin beschreiben wir das Protokoll für den zellfreien, HDL-spezifischen Phospholipid-Efflux-Assay (HDL-SPE), von dem wir bereits gezeigt haben, dass er das Risiko eines CVD-Vorfalls vorhersagen kann. Dieser Assay misst speziell die HDL-Apolipoprotein-vermittelte Entfernung eines nicht austauschbaren fluoreszierenden Phospholipids aus einem Lipidspenderpartikel. Unsere klinischen Fall-Kontroll-Studien haben gezeigt, dass der HDL-SPE-Assay genauso gut und möglicherweise sogar besser abschneidet als der "Goldstandard"-Zell-basierte Cholesterin-Efflux-Kapazitäts-Assay, ein mühsamer und technisch komplexer Assay, bei dem häufig radioaktives Cholesterin verwendet wird.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Grundlagenforschern und klinischen Forschern gleichermaßen die Möglichkeit zu geben, die Funktionalität von HDL bei der Lipidmobilisierung mit einem einfachen, standardisierten, zellfreien Hochdurchsatz-Assay zu beurteilen. Dieser Assay kann von Grundlagenforschern verwendet werden, um Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die dem HDL-vermittelten Lipidausfluss zugrunde liegen, und um neue Therapeutika zu screenen, die die HDL-Funktionalität verbessern. HDL-SPE kann auch als klinischer Labordiagnostik-Assay für die Risikobewertung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dienen.

Einleitung

Der HDL-SPE-Assay (High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux) misst die HDL-Funktionalität und ist für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung und in klinischen Diagnoselabors vorgesehen, um (i) weitere Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die der HDL-vermittelten Entfernung von Lipiden aus atherosklerotischen Läsionen zugrunde liegen, (ii) als neue Plattform zur Verbesserung der klinischen Risikobewertung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu dienen und (iii) neue Therapeutika zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln.

HDL-Cholesterin (HDL-C) ist eine wichtige Determinante des CVD-Risikos¹, aber seine Nützlichkeit wird insofern beeinträchtigt, als erhöhte HDL-C-Spiegel (>80 mg/dl) mit einem höheren CVD-Risiko verbunden sind 2,3,4,5. Erhöhte HDL-C-Spiegel können die Akkumulation von dysfunktionalem HDL darstellen, das eine verminderte Fähigkeit hat, arterielle Plaquelipide zu entfernen⁶.

Der CEC-Assay (Cellular Cholesterol Efflux Capacity) war der erste In-vitro-Assay, der zur Messung der HDL-Funktionalität entwickelt wurde. In diesem Assay werden kultivierte Makrophagen (Maus oder Mensch), die typischerweise mit ³H- oder fluoreszierendem Bodipy-Cholesterin markiert sind, mit apoB-abgereichertem Plasma oder Serum inkubiert. Der prozentuale Cholesterinausfluss wird auf der Grundlage der Menge an zell- und medienassoziierter Fluoreszenz/Radioaktivität berechnet ^7,8,9. Es hat sich gezeigt, dass der CEC-Assay ein besserer Prädiktor für das Auftreten von CVD ist als HDL-C⁷. Der CEC-Assay ist nicht für die Umwandlung in einen routinemäßigen klinischen diagnostischen Assay geeignet, hauptsächlich aufgrund seiner Anforderungen an die Zellkultur und der langen Dauer (z. B. Tage). Darüber hinaus ist der CEC-Assay durch seine inhärente Variabilität begrenzt (z. B. verschiedene Zelltypen, Markierungstechniken und PEG-Depletion von β-Lipoproteinen, die die HDL-Zusammensetzung verändert¹⁰).

Mehrere Forschungsgruppen haben zellfreie HDL-Cholesterin-Efflux-Assays entwickelt, die als Werkzeuge zur Gewinnung neuer Erkenntnisse über die HDL-Funktion und zur möglichen Umsetzung in einen klinisch-diagnostischen Assay zur besseren Beurteilung des CVD-Risikos verwendet werden^{sollen 11,12}. Diese Efflux-Assays umfassen in der Regel mehrere Schritte und verwenden ein Lipiddonorpartikel, das mit einem fluoreszierenden Cholesterin markiert ist, und wie der CEC-Assay erfordern sie entweder die Depletion von β-Lipoproteinen oder alternativ die Erfassung von apoA-I-haltigen Partikeln unter Verwendung von Anti-ApoA-I-Antikörpern, um den HDL-Cholesterinausfluss im Plasma zu messen. Obwohl validiert wurde, dass diese alternativen Assays in unterschiedlichem Maße mit dem CVD-Risiko assoziiert sind, konnte bisher nur einer¹³, der den ApoA-I-Wechselkurs bewertet, das Risiko eines CVD-Vorfalls vorhersagen¹⁴. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Kinetik des Austauschs von ApoA-I in und außerhalb des Plasma-HDL unabhängig mit CEC¹⁵ assoziiert ist und bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom deutlich reduziert ist¹⁶. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere HDL-austauschbare Apolipoproteine in vitro sowohl Cholesterin als auch Phospholipide aus ABCA1-exprimierenden Zellen vermitteln ¹⁷.

Wir haben einen alternativen Ansatz zur Bewertung der HDL-Funktionalität entwickelt¹⁸. Der hier beschriebene einfache, schnelle und zuverlässige Assay benötigt nur zwei Komponenten, nämlich ganze menschliche (oder tierische) Plasma- oder Serumproben (frisch oder gefrieraufgetaut) und ein fluoreszierendes lipidbeschichtetes Donorpartikel. Der Assay misst die Fähigkeit von apoA-I und anderen HDL-assoziierten austauschbaren Apolipoproteinen im gesamten Plasma/Serum, ein nicht austauschbares, mit der Kopfgruppe markiertes fluoreszierendes Phosphatidylethanolamin (PE) aus einem lipidbeschichteten Donorpartikel¹⁸ zu entfernen (Abbildung 1).

Die Donorpartikel in diesem Assay bestehen aus Calciumsilikathydratkristallen (CSH), die mit Cholesterin, dem Phospholipid Phosphatidylcholin (PC) und einem fluoreszierenden PE beschichtet sind. Austauschbare HDL-assoziierte Apolipoproteine, meist ApoA-I, die von HDL-Partikeln freigesetzt werden, binden an die Donorpartikel und dissoziieren dann von ihnen zusammen mit Donorpartikellipiden, einschließlich fluoreszierendem PE. Auf diese Weise erhält HDL, nicht aber die anderen Lipoproteine, die im gesamten Plasma/Serum vorhanden sind, spezifisch fluoreszierendes PE aus den Donorpartikeln ^18,19. Das gesamte Plasma/Serum wird mit den fluoreszierenden lipidbeschichteten Calciumsilikathydrat-Donorpartikeln (LC-CSH) und Kochsalzlösung bei 37 °C inkubiert, wobei es 1 h lang geschüttelt wird. Da LC-CSH etwa die doppelte Dichte von Wasser hat, lassen sich die Donorpartikel durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit leicht vom Plasma trennen.

Der in klinischen Studien gemessene prozentuale PE-Efflux wird typischerweise normalisiert, indem der Wert der von HDL im Überstand des Reaktionsgemisches einer klinischen Probe erfassten PE-Fluoreszenz durch den von HDL in einem menschlichen Referenzplasma erhaltenen Wert dividiert wird. Die Normalisierung auf ein Referenzplasma wird durchgeführt, um Schwankungen in der Reagenzienvorbereitung auszugleichen. Für Forschungsanwendungen kann der prozentuale PE-Ausfluss bestimmt werden, indem die überstehende PE-Fluoreszenz dividiert durch die Gesamtfluoreszenz (überstehende PE-Fluoreszenz + LC-CSH-Fluoreszenz) berechnet wird. Die Messwerte der überstehenden Fluoreszenz werden in eine Vorlage in Tabellenkalkulationsdateien eingefügt, um den %PE-Efflux zu berechnen (Ergänzende Tabelle 1 für dreifache Messungen und Ergänzende Tabelle 2 für doppelte Messungen). Die Anweisungen zum Durchführen dieser Berechnungen in der Tabelle werden als ergänzende Dateien zur Verfügung gestellt (Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2, Zusatzdatei 3, Zusatzdatei 4, Zusatzdatei 5, Zusatzdatei 6, Zusatzdatei 7 und Zusatzdatei 8), und ein Beispiel für eine Berechnung wird als Zusatzdatei 3 bereitgestellt.

Abbildung 1: HDL-SPE-Assay. Der HDL-spezifische Phospholipid-Efflux wird in 96-Well-Platten getestet. Kochsalzlösung, Calciumsilikathydratkristalle (grau), die mit Lipiden (LC-CSH) beschichtet sind, einschließlich nicht austauschbarem Lissaminrhodamin-markiertem Phosphatidylethanolamin (LRh-PE; rote Membranschichten), und bis zu 30 ganze Plasma-/Serumproben (gelb; in dreifacher Ausfertigung) werden auf 96-Well-Platten geladen. Nach dem Mischen für 1 h bei 37 °C in einem Thermomischer werden die Platten kurz zentrifugiert, um die LC-CSH-Donorpartikel zu pelletieren. Aliquots der Überstände, die HDL enthalten, das spezifisch mit LRh-PE markiert ist, werden auf eine schwarze Platte übertragen, die Detergens (zur Solubilisierung von Lh-Rh-PE) und Kochsalzlösung enthält. Anschließend wird die PE-Fluoreszenz mit einem Fluorimeter gemessen. Kochsalzlösung (Negativkontrolle; NC), zur Hintergrundkorrektur und gepooltes gesundes menschliches Plasma (Positivkontrolle; PC) für die Plattennormalisierung werden anstelle von Probenplasma/Serum in den letzten Satz von Vertiefungen geladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Die Blutentnahme erfolgt nach den Regeln der Deklaration von Helsinki von 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), die 2013 überarbeitet wurde, und sollte den institutionellen Richtlinien für die Einwilligungserklärung nach Aufklärung entsprechen.

1. Herstellung von fluoreszierenden Phospholipid-markierten Donorlipidpartikeln

1. Bildung von Lipidfilm
   ACHTUNG: Bereiten Sie Stammlösungen vor und geben Sie sie in einer chemischen Haube ab. Tragen Sie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille. Entsorgen Sie Chloroformlösungen in organischen chemischen Abfällen, Triton X-100-Lösungen (ohne Plasma) in chemischen Abfällen und plasmahaltige Lösungen in biologisch gefährlichen/medizinischen Abfällen.
   1. Kaufen Sie Lipid-Stammlösungen in Chloroform von einem Anbieter oder stellen Sie sie im Labor her:
      25 mg/ml: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC):
      10 mg/ml: Cholesterin
      1 mg/ml: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissaminerhodamin B-Sulfonyl) [LRh-PE]
      HINWEIS: Verwenden Sie luftdichte Glasröhren mit Schraubverschluss. Kappe mit Teflonband verschließen.
      Bei -20 ^°C lagern.
   2. Bestimmen Sie die benötigte Menge an LC-CSH und bereiten Sie die entsprechende Anzahl von Glasröhren vor.
      In einem chemischen Abzug wird in jedes 10 mm 150 mm Borosilikatglasröhrchen Folgendes gegeben: 472 μl DMPC-Stammlösung (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μl Cholesterin-Stammlösung (8,8 μmol, 3,39 mg) und 305 μl LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Zum Mischen kurz vorziehen.
   3. In einem chemischen Abzug wird das Lipidgemisch in einem Glasröhrchen unter einem sanften Strahl von N₂ 1 h lang getrocknet, so dass am Boden des Rohres ein trockener Lipidfilm entsteht.
      HINWEIS: Der Fluss von N₂ sollte nur ein leichtes Kräuseln auf der Flüssigkeitsoberfläche verursachen.
   4. Für Assays, die mehrere 96-Well-Platten über Tage oder Wochen erfordern, stellen Sie eine große Charge LC-CSH her, die in Röhrchen aliquotiert werden kann, oder verwenden Sie sie zur Herstellung gebrauchsfertiger LC-CSH-Platten, die bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Siehe Schritte 2.2.1 bis 2.2.2 unten.
2. Beschichtung von Calciumsilikathydrat mit fluoreszierendem Lipidfilm
   ACHTUNG: Tragen Sie einen Laborkittel, Handschuhe, eine Gesichtsmaske und eine Schutzbrille, wenn Sie mit Kalziumsilikathydrat umgehen.
   1. Setzen Sie einen Wägepapierkegel in das Glasröhrchen mit den getrockneten Lipiden ein. Geben Sie 80 mg Calciumsilikathydrat (CSH)-Pulver (Reagenz zur Lipidentfernung) in das Glasröhrchen, indem Sie den Wägepapierkegel verwenden, um das Pulver zum Boden des Röhrchens zu leiten. Geben Sie sofort 2 ml normale Kochsalzlösung in das Glasröhrchen, das die getrockneten Lipide und CSH enthält. Decken Sie die Oberseite der Tube mit Parafilm ab.
   2. Mit der Hand vortexen, um den Großteil des Lipids vom Boden des Glasrohrs zu entfernen. Führe das Glasrohr in ein Loch ein, das in einer Styroporplattform gemacht wurde, die an der Oberseite eines Wirbels befestigt ist. Befestigen Sie das Rohr mit verstärktem Klebeband an der Wirbelplattform.
      HINWEIS: Stellen Sie die Wirbelgeschwindigkeit so ein, dass das Gemisch etwa auf halber Höhe des Glasrohrs nach oben gerutscht ist.
   3. 10 Min. Vortexen. Vergewissern Sie sich nach dem Vortexen, dass kein Lipid an der Wand des Röhrchens verbleibt. Bei Bedarf manuell vortexen, bis kein Lipid mehr übrig ist. Übertragen Sie das Gesamtvolumen im Glasröhrchen mit einer 1-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Kunststoffröhrchen. Waschen Sie die Wände des Glasrohrs mit 3 mL zusätzlicher Kochsalzlösung und geben Sie es in dasselbe konische 15 mL Kunststoffröhrchen.
3. Waschen LC-CSH
   1. Das 15-ml-Kunststoffröhrchen mit dem lipidbeschichteten CSH (LC-CSH) wird 2 Minuten lang bei 935 × g bei 4 °C zentrifugiert, um die Donorpartikel zu pelletieren. Den Überstand vorsichtig durch Vakuumaspiration mit einer langen, sehr feinen Pipettenspitze entfernen.
   2. Beginnen Sie an der Oberseite des Überstands und schieben Sie die Pipettenspitze langsam an der Seite des Röhrchens entlang, und kippen Sie das Röhrchen, während der Überstand entfernt wird. Lassen Sie eine kleine Menge (≈ 200 μl) Kochsalzlösung, um ein versehentliches Ansaugen des LC-CSH aus dem Pellet zu verhindern. Fügen Sie so viel Kochsalzlösung hinzu, dass das Gesamtvolumen auf 5 ml kommt.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 bis 1.3.2 viermal. Fügen Sie nach der letzten Wäsche so viel Kochsalzlösung hinzu, dass das endgültige Volumen auf 2,5 ml kommt.
      HINWEIS: Bei LC-CSH-Präparaten 2 Wochen lang bei 4 °C oder bis zu 6 Monate bei -20 °C oder -80 °C lagern.
4. Vorbereitung großer Chargen für gebrauchsfertige LC-CSH-Platten
   HINWEIS: Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Messplatten mit einheitlicher Reagenzienzusammensetzung aus derselben LC-CSH-Charge, wodurch die Messvariabilität zwischen den Platten minimiert wird.
   1. Bereiten Sie 12 LC-CSH-Röhrchen (2,5 mL x 12 Röhrchen) vor, wie in den Schritten 1.1.1 bis 1.3.2 oben beschrieben. Kombinieren Sie den gesamten Inhalt aller 12 Röhrchen in einem konischen 50-ml-Kunststoffröhrchen (30 mL Gesamtvolumen). Vorsichtig vortexen, um eine homogene Verteilung der LC-CSH-Partikel zu erhalten, und 6 mL in ein konisches 15-ml-Kunststoffröhrchen geben. Wiederholen Sie dies viermal, um insgesamt 5 konische Kunststoffröhrchen zu erhalten, die jeweils 6 ml LC-CSH enthalten.
   2. Jedes Röhrchen liefert genügend LC-CSH, um 5 gebrauchsfertige LC-CSH-Platten herzustellen (mit 50 μl pro Vertiefung für alle 96 Vertiefungen in einer einzigen Platte). Siehe Schritte 2.2.1 bis 2.2.2 unten.

2. Inkubation von Plasma-/Serumproben mit fluoreszierenden Phospholipid-markierten Donorlipidpartikeln (LC-CSH)

1. Individuelle Platten für den sofortigen Einsatz.
   1. Pipettieren Sie 75 μl Kochsalzlösung in jede Vertiefung einer 0,3-ml-96-Well-Platte, wobei so viele Vertiefungen verwendet werden, wie für das zu testende Probenset erforderlich sind. Pipettieren Sie 100 μl Kochsalzlösung in dreifache Negativkontrollvertiefungen (NC) und 75 μl Kochsalzlösung in doppelte Positivkontrollvertiefungen (PC) (Abbildung 2). Verwenden Sie zum Dispensieren eine Multiwell-Pipette.
   2. Vor der Abgabe von LC-CSH ist das 15-ml-Kunststoff-Stammröhrchen 3 Mal zu je 10 s vortexen. Geben Sie mit einer Einzelpipette 50 μl LC-CSH entlang der rechten Seite der versalzenen Vertiefungen ab. Dosieren Sie schnell jeweils 50 μl in nur 3 Vertiefungen. Wiederholen Sie das Vortex-Protokoll, bevor Sie LC-CSH in die nächsten 3 Wells abgeben.
      HINWEIS: Dieses Verfahren ist entscheidend, um sicherzustellen, dass das schwere LC-CSH, das spontan sedimentiert, homogen suspendiert wird, so dass in jeder Vertiefung gleiche Mengen abgegeben werden können.
   3. Drehen Sie die 96-Well-Platte um 180°, sodass sich die linke Seite der Wells nun nach rechts zeigt. Pipettieren Sie 25 μl Plasma-/Serumproben entlang der rechten Seite der Vertiefung (Abbildung 2). Für die PC-Vertiefungen fügen Sie 25 μl Normolipidämisches Plasma/Serum des Referenzstandards für den menschlichen Menschen hinzu. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung für den Assay beträgt 150 μl.
      HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert eine Kreuzkontamination von Plasma/Serum mit LC-CSH, da diese entlang gegenüberliegender Seiten der Vertiefungen abgegeben werden.
   4. Verschließen Sie die Platte fest mit Klebefolie. Inkubieren Sie die versiegelte 96-Well-Platte 1 h lang im Dunkeln bei 37 °C bei 1200 U/min in einem Thermomixer. Nehmen Sie nach Abschluss der Inkubation die Platte aus dem Thermomixer und legen Sie sie auf Eis. Die Platte wird 2 min lang bei 4 °C (um die Transferreaktion zu stoppen) bei 935 g zentrifugiert, um die Donorpartikel zu pelletieren.
2. Gebrauchsfertige LC-CSH-Platten
   1. Tauen Sie gefrorene gebrauchsfertige Platten (siehe Schritte 1.4.1-1.4.2 für die Plattenvorbereitung) 2 h lang (4 °C bis 10 °C) in der Kälte (4 °C bis 10 °C) auf. 2 min bei 4 °C bei 935 × g zentrifugieren, um das gesamte Material (125 μl) zusammen zu sammeln. Entfernen Sie vorsichtig die Klebefolie, um den Inhalt der Vertiefungen nicht zu bespritzen.
   2. 25 μl Plasma-/Serumproben, Kochsalzlösung und humanes Referenzplasma in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1) der gebrauchsfertigen Platte auf Eis geben und mit Klebefolie verschließen. Inkubieren Sie die versiegelte 96-Well-Well-Phase im Dunkeln für 1 h bei 37 °C bei 1200 U/min in einem Thermomixer. Nehmen Sie die Platte aus dem Thermomixer und legen Sie sie auf Eis. Die Platte wird 2 min lang bei 4 °C (zum Stoppen der Transferreaktion) bei 935 × g (zum Pelletieren der Donorpartikel) zentrifugiert.

Abbildung 2: Dispensieren von Reagenzien in Vertiefungen ohne Kreuzkontamination. Geben Sie Plasma/Serum und LC-CSH auf gegenüberliegende Wände der Vertiefungen. Kreuzkontaminationen werden minimiert, wenn die Platte nach der ersten Abgabe von LC-CSH um 180° gedreht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Messung des fluoreszierenden Phospholipid-Efflux zum Plasma-/Serum-HDL

1. Überführung auf eine schwarze Platte und Fluoreszenzmessung
   1. Entfernen Sie vorsichtig die Klebefolie, um das LC-CSH-Pellet nicht zu stören.
      HINWEIS: Wenn es zu einer Störung der Pellets kommt, zentrifugieren Sie erneut.
   2. Übertragen Sie 50 μl Überstand von der 96-Well-Reaktionsplatte in die Wells einer schwarzen 96-Well-Polystyrolplatte mit flachem Boden für Fluoreszenzmessungen. Verwenden Sie eine Multiwell-Pipette.
      HINWEIS: Saugen Sie kein LC-CSH an. In diesem Fall wieder in die Vertiefung injizieren und erneut zentrifugieren.
   3. Füllen Sie ein Reservoir mit normaler Kochsalzlösung. Geben Sie 50 μl Kochsalzlösung mit einer Multiwell-Pipette in jede Vertiefung.
   4. Bereiten Sie 1 % TX-100 zu, indem Sie 90 ml destilliertes Wasser zu 10 ml 10 % Triton X-100 Stammlösung in einem 125 ml Erlenmeyerkolben aus Kunststoff hinzufügen. Füllen Sie einen Behälter mit 1 % Triton-X 100.
   5. Geben Sie 100 μl 1 % Triton X-100 bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und mischen Sie, indem Sie 2-3 Mal mit einer Multiwell-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Lassen Sie alle Blasen mit Luft aus einer 3-ml-Transferpipette platzen.
   6. Messen Sie die Lissaminrhodamin-Fluoreszenz mit einem Fluorimeter (540 nm Anregung/ 600 nm Emission).
2. Berechnung des %PE-Abflusses
   1. Berechnung des PE-Ausflusses
      1. %PE-Efflux = ([Gesamtüberstand Plasma- oder Serumgrippe - Überstand NC FLU]/Gesamtgrippe)) × 100
         FLU = Fluoreszenzeinheiten; NC = Negativkontrolle. Da nur 50 μL der 150 μL des Überstandsreaktionsgemisches zur Messung der Fluoreszenz pro Vertiefung verwendet werden, ist eine folgende Korrektur erforderlich:
      2. Gesamtüberstehende FLU/Vertiefung = Gemessene FLU von 50 μL (schwarze Platte) × 3
      3. Gesamt-FLU pro 150 μl Reaktionsgemisch/Vertiefung = Gesamt-FLU, die von 50 μl LC-CSH emittiert wird.
         HINWEIS: DIE LC-CSH-Fluoreszenz wird wie unten beschrieben (Schritt 4.2.5) berechnet.
   2. Normalisierte Berechnung des %PE-Ausflusses
      1. Verwenden Sie den normalisierten %PE-Efflux, um Schwankungen zwischen Assays zu korrigieren, die unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt wurden (d. h. Experimente, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, Chargenunterschiede).
      2. Verwenden Sie diese Formel, um den normalisierten %PE-Efflux zu berechnen:
         Normalisierter %PE-Efflux = Probenüberstand %PE-Effluxwert (FLU)/positiver Referenzkontrollüberstand %PE-Efflux-FLU-Wert.
      3. Verwenden Sie identisches gepooltes humanes Plasma von gesunden Spendern mit einem normalen Lipidprofil als Referenzkontrolle. Es ist nicht erforderlich, den Gesamtüberstand FLU/Well zu berechnen, da dieser Wert sowohl für die Probe als auch für die Referenz gleich ist.
      4. Für dreifache Stichproben fügen Sie die in Schritt 3.1.6 erhaltenen Rohdaten in die Tabelle ein (Ergänzende Tabelle 1). Für doppelte Proben fügen Sie die in Schritt 3.1.6 erhaltenen Rohdaten in die Tabelle ein (Ergänzende Tabelle 2).

4. LC-CSH-Standardkurve

HINWEIS: Die LC-CSH-Standardkurve wird verwendet, um die Menge des PE-Fluoreszenzsignals zu berechnen, die im Aliquot von LC-CSH pro Vertiefung vorhanden ist. In der Regel werden 50 μl LC-CSH/Well verwendet. Dieser Wert kann zur Berechnung des %PE-Efflux zu HDL in einer Probe verwendet werden, die auf die im Reaktionsgemisch vorhandene Gesamt-FLU normiert ist (siehe Schritt 3.2.1).

%PE-Efflux = ((Fluoreszenzeinheiten der überstehenden Probe [FLU] - überstehende Kochsalzlösung FLU)/(Gesamt-LC-CSH FLU)) x 100.

1. Serielle Verdünnung von LC-CSH
   1. Bereiten Sie 10-fache und 100-fache Verdünnungen von LC-CSH vor (wie in den Schritten 1.1.1-1.3.3 hergestellt):
      10-fache Verdünnung: 100 μl LC-CSH + 900 μl 1% Triton X-100
      100-fache Verdünnung: 100 μL 10-fach verdünntes LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100
   2. Dispensieren Sie dreifach verdünnte Proben von 10- und 100-fach verdünntem LC-CSH in eine 96-Well-Inkubationsplatte für die Standardkurve (siehe Abbildung 3).
   3. Geben Sie ein ausreichendes Volumen von 1 % Triton X-100 in die Vertiefungen, die LC-CSH enthalten, um ein Endvolumen von 200 μl zu erreichen (siehe Tabelle 1).
2. Solubilisierung von LC-CSH für die Fluoreszenzmessung
   1. Die Platte mit Klebefolie verschließen und 1 h bei 24 °C unter Schütteln bei 1200 U/min inkubieren. Die Platte 2 min bei 4 °C bei 935 × g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig die Klebefolie.
   2. Mischen Sie die Proben mit einer Multiwell-Pipette, indem Sie sie 2-3x auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 100 μl LC-CSH pro Well mit einer Multiwell-Pipette auf eine schwarze 96-Well-Polystyrolplatte mit flachem Boden für Fluoreszenzmessungen.
   3. Geben Sie 100 μl 1 % Triton-X pro Vertiefung bei Raumtemperatur mit einer Multiwell-Pipette in jede Vertiefung. Mischen Sie, indem Sie 2-3x auf und ab pipettieren.
   4. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluorimeter (540 nm Anregung/600 nm Emission).
   5. Fügen Sie die mit dem Fluorimeter gemessenen Fluoreszenzwerte in die Vorlage für die lineare Regressionsanalyse in der ergänzenden Tabelle 1 ein, wie in der ergänzenden Datei 3 beschrieben. Die Endkonzentrationen von LC-CSH in der Standardkurvenmessplatte sind in Tabelle 2 dargestellt.

Abbildung 3: Platte für LC-CSH-Standardkurve. Seriell verdünntes LRh-PE-markiertes LC-CSH wird in eine 96-Well-Platte abgegeben, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Endkonzentration	10-fach verdünnt	100-fach verdünnt	1% Triton X-100	Gesamt
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Reinigungsmittelmittel	Volumen
(μL/Vertiefung)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabelle 1: Volumina der Reagenzien, die den Vertiefungen der Inkubationsplatte für die LC-CSH-Standardkurve zugesetzt wurden.

Solubilisiert	Salzhaltig	Gesamt	Zugefügt	Gemessen
LC-CSH	Volumen	Volumen	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/Vertiefung)	(μL/Vertiefung)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabelle 2: Volumina der Reagenzien, die in die Vertiefungen der Messplatte für die LC-CSH-Standardkurve gegeben wurden.

Ergebnisse

Analysemethoden

Wie oben erwähnt, können HDL-SPE-Probenanalysen für verschiedene Anwendungen modifiziert werden, wie unten gezeigt. Vor der Durchführung von Studien mit Forschungsproben werden zunächst LC-CSH-Standardkurvenvalidierungen, Reproduzierbarkeit und Plasmakonzentrationsassays durchgeführt, um die erforderlichen Techniken zu beherrschen. Führen Sie zunächst die LC-CSH-Standardkurvenanalyse durch, um die Qualität der LC-CSH-Präparate ...

Diskussion

HDL-C ist eine Schlüsseldeterminante, die zur klinischen Beurteilung des Risikos von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und damit des Bedarfs an lipidsenkenden oder anderen potenziellen präventiven Behandlungen herangezogen wird¹. Es hat sich gezeigt, dass die Funktion von HDL beim zellulären Cholesterinausfluss in vitro ein noch besserer Prädiktor für das Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist als HDL-C⁷. Leider ist dieser z...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,2-Dimyristoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholin	Avanti-Forschung	850345	14:0 PC (DMPC) Chloroform-Soluiton
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(Lissamin-Rhodamin B-Sulfonyl) (Ammoniumsalz)	Avanti-Forschung	810150-C	Chloroformlösung LRh-PE
Klebefilm	Angewandte Biosysteme	4306311	MicroAmp Clear Klebefilm
Bay Corporation Hochdichte-Teflonband 1/2 Zoll x 520	Lösungen für medizinische Tests	86732
Borosilikatglasröhren 20 mm & spitz; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Zentrifuge	Thermowissenschaftlich	Sorvall X Pro Serie
Chloroform	Sigma-Aldrich	366927	geeignet für HPLC, ≥ 99.8%
Cholesterinpulver	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Hydroxy-5-Cholesten-3β-ol
Glassin-Wiegepapier	Cole-Palmer	UX-01338-02	Zur Handhabung von LC-CSH
Inkubationsplatte	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 Well Semi Skirt 0,2 mL PCR-Platten
Lipidentfernungsmittel (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Messtafel	Greiner bio-one	655076	Mikroplatten, PS, 96-Bohrloch, F-BODEN (SCHORNSTEIN), SCHWARZ; FLUOTRAC, MED-BINDUNG
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Version 2507
MultiFlex-Pipetspitzen	Fisher Scientific	50-550-206	Für Aspiraiting Supernatant während LC-CSH-Waschungen
Multilabel-Plattenleser	Perkin Elmer	1420-050	Victor3 Wallac1420 Multilabel-Zähler
Kochsalzlösung	Qualität Biologisch	114-055-101	Für verschiedene Verwendungen
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Zur Abdeckung der Glasröhrenoberseite während des Vortexings
Polycabonat-Erlenmeyer-Flaschen	Fisher Scientific	10-041-8	Für eine 10%-Triton-X-Lösung
Gesammeltes menschliches Plasma (blutbasiert) Li Heparin)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Referenzplasma, positive Kontrolle (PC)
Surfact-Amps X 100	Thermowissenschaftlich	28314	10% Triton X-100, 10x mit destilliertem Wasser verdünnen
Thermomixer	Eppendorf	5382000023	Thermomixer C mit 96-Brunnen-Thermoblock
Thermomixer Smartblock	Eppendorf	5306000006	96-Well-SmartBlock
Transferpipetten (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Zum Entfernen von Blasen von der Oberseite des Brunnens
Vortex-Mixer	Daigger	3030A	Affixhalter für Glasröhrchen oben