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Methodenartikel

Identifizierung immunbezogener molekularer Biomarker bei Autismus-Spektrum-Störungen mittels datenunabhängiger Akquisitionsproteomik und maschinellem Lernen

550 Ansichten

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DOI:

10.3791/68949

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26. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das datenunabhängige Erfassungs-Massenspektrometrie und maschinelles Lernen verwendet und acht immunverwandte Proteine als genaue Biomarker für die frühe Diagnose von Autismus-Spektrum-Störungen identifiziert hat, validiert durch einen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay.

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein reproduzierbares Protokoll zur Identifizierung von Serumprotein-Biomarkern vor, die mit einer Autismus-Spektrum-Störung (ASD) assoziiert sind, unter Verwendung von datenunabhängiger Erfassungs-Massenspektrometrie (DIA) in Kombination mit maschinellem Lernen (ML). DIA ermöglicht ein unvoreingenommenes, hochauflösendes Profiling des Serumproteoms, einschließlich Proteine mit geringer Abundanz, und stellt gleichzeitig die Reproduzierbarkeit über Proben hinweg sicher. ML-Ansätze wurden angewendet, um diagnostisch aussagekräftige Protein-Panels auszuwählen und die Robustheit des Modells zu verbessern. Die Analyse umfasste Serum von 99 Kindern mit ASD und 70 altersangepassten Kontrollen. Proteine mit hoher Abundanz wurden depletiert, Peptide wurden mit standardisierten Verdauungs- und Fraktionierungsverfahren hergestellt und DIA wurde auf einem hochauflösenden Massenspektrometer durchgeführt. Durch die Datenverarbeitung und Quantifizierung wurden differentiell exprimierte Proteine identifiziert, die einer funktionellen Anreicherungsanalyse unterzogen wurden. Acht immunverwandte Proteine erwiesen sich als starke Kandidaten für die Entwicklung von Biomarkern. Ein logistisches Regressionsmodell, das mit diesen Proteinen trainiert wurde, erreichte eine Genauigkeit von 95,27 %, einen Kappa-Wert von 0,9025 und eine AUC von 1,000 in der Kreuzvalidierung. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der DIA-basierten Proteomik in Kombination mit maschinellem Lernen als robuster Rahmen für die Entdeckung von Biomarkern bei ASD und für die Adaption in der breiteren klinischen Forschung.

Einleitung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist eine Gruppe von früh einsetzenden neurologischen Entwicklungsstörungen, die durch Heterogenität in der Ätiologie und dem klinischen Erscheinungsbild gekennzeichnet sind. Zu den Kernmerkmalen gehören anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und Interaktion sowie eingeschränkte, sich wiederholende Verhaltensweisen, Interessen oder Aktivitäten. In den Vereinigten Staaten liegt die Prävalenz bei etwa 2,3 % bei 8-jährigen Kindern und bei etwa 2,2 % bei Erwachsenen, was die Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit unterstreicht 1,2,3,4. Die Risikofaktoren sind vielfältig, einschließlich genetischer Veranlagungen, Immundysregulation und pränataler Umwelteinflüsse 5,6,7. Eine frühzeitige Diagnose und Intervention kann die Entwicklungsergebnisse erheblich verbessern, so dass die Identifizierung objektiver und zuverlässiger Biomarker zu einem Hauptschwerpunkt der ASD-Forschung wird 8,9,10. Dieses Protokoll baut auf unseren zuvor veröffentlichten Arbeiten auf, in denen wir datenunabhängige Akquisitionsproteomik (DIA) und maschinelles Lernen anwenden, um immunverwandte Proteine als potenzielle Biomarker für die frühe ASD-Diagnose zu identifizieren11.

Trotz umfangreicher Bemühungen existieren derzeit keine spezifischen und universell validierten Biomarker für die klinische ASD-Diagnose12. Vorgeschlagene Kandidaten - wie Veränderungen im Darmmikrobiom13, erhöhtes Interleukin-6 (IL-6)14, Veränderungen des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF)15 und oxidative Stressmarker wie Glutathion16 - sind nach wie vor vorläufig und für den klinischen Einsatz nicht reproduzierbar. Die Proteomik hat sich als vielversprechender Ansatz zur Identifizierung krankheitsspezifischer molekularer Signaturen erwiesen, und mehrere Studien haben verschiedene biologische Proben (Blut, Speichel, Urin, PBMCs) auf differentiell exprimierte Proteineuntersucht 8,17,18,19,20,21,22 . Zum Beispiel zeigten Bao et al., dass Entzündungsproteine, die durch Olink-Proteomik identifiziert wurden, bei der frühen ASD-Diagnose helfen können (17), während andere Studien darauf hindeuten, dass gemeinsame proteomische und metabolische Signalwege trotz der genetischen Heterogenität von ASD robuste Biomarker liefern können23.

Die DIA-Massenspektrometrie hat aufgrund ihrer umfassenden und reproduzierbaren Proteinprofilierung zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Im Gegensatz zur herkömmlichen datenabhängigen Erfassung (DDA), bei der die intensivsten Ionen selektiv fragmentiert werden, fragmentiert DIA alle Vorläuferionen über vordefinierte m/z-Fenster. Dies bietet eine tiefere Proteomabdeckung und eine verbesserte Reproduzierbarkeit über große Kohorten hinweg, ein entscheidender Vorteil für klinische Vergleiche14. Benchmarking-Studien zeigen, dass DIA mehr quantifizierbare Peptide als DDA nachweist, insbesondere für Proteine mit geringer Abundanz und geringerer Variation zwischen den Läufen14.

Aufbauend auf diesen Fortschritten wandten wir eine DIA-basierte Proteomanalyse auf Serumproben von 99 Kindern mit ASD und 70 Kontrollen an, nachdem Proteine mit hoher Abundanz erschöpft waren. Unsere Ergebnisse unterstreichen das Potenzial immunverwandter Proteine als molekulare Marker für die frühe ASD-Diagnose und zeigen den Wert der DIA-basierten Proteomik bei der Entdeckung von Biomarkern, wenn sie mit einer rigorosen Methodik kombiniert wird11.

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Protokoll

Das Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und das Protokoll wurde vom Institutionellen Überprüfungsausschuss des Changsha Maternal and Child Health Hospital genehmigt. Die Einverständniserklärung der Probanden wurde eingeholt.

1. Identifizierung von Kindern mit Autismus mit DSM-5

  1. Sammeln von Krankengeschichte und Hintergrundinformationen
    1. Entwicklungsgeschichte
      1. Sammeln Sie Informationen über die frühe Entwicklung des Patienten, einschließlich sprachlicher, sozialer und motorischer Entwicklungen.
      2. Achten Sie auf Entwicklungsverzögerungen oder Anomalien (z. B. Sprachverzögerung, Schwierigkeiten in der sozialen Interaktion).
    2. Familienanamnese
      1. Erkundigen Sie sich nach einer Familienanamnese von Autismus oder anderen neurologischen Entwicklungsstörungen.
    3. Aktueller Funktionsumfang
      1. Beurteilen Sie die Leistung des Patienten im täglichen Leben, einschließlich Lernen, Arbeit, soziale Interaktionen und Fähigkeiten zur unabhängigen Lebensweise.
  2. Verwendung der DSM-5-Diagnosekriterien
    1. Anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und sozialen Interaktion
      1. Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei der folgenden drei Kriterien erfüllt sind:
        1. Defizite in der sozial-emotionalen Reziprozität - sehen Sie sich durch einen Mangel an normalem Blickkontakt, Gesichtsausdrücken oder Körpersprache und Schwierigkeiten beim Aufbau altersgerechter Freundschaften oder Beziehungen aus.
        2. Defizite im nonverbalen kommunikativen Verhalten - suchen Sie nach Herausforderungen bei der Verwendung von Gesten, Gesichtsausdrücken oder Tonfall, um Emotionen zu vermitteln, und einem begrenzten Verständnis von nonverbalen Hinweisen von anderen.
        3. Defizite bei der Entwicklung, Aufrechterhaltung und dem Verständnis von Beziehungen - suchen Sie nach Schwierigkeiten bei der Anpassung an unterschiedliche soziale Kontexte und einem mangelnden Interesse an Gleichaltrigen oder der Unfähigkeit, sich auf fantasievolles Spiel einzulassen.
    2. Eingeschränkte, sich wiederholende Verhaltensmuster, Interessen oder Aktivitäten
      1. Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei der folgenden vier Kriterien erfüllt sind:
        1. Stereotype oder sich wiederholende motorische Bewegungen (z. B. Flattern der Hände, Schaukeln des Körpers oder wiederholter Gebrauch von Gegenständen).
        2. Beharren auf Gleichheit oder ritualisierten Verhaltensmustern - suchen Sie nach extremem Stress über geringfügige Änderungen in der Routine.
        3. Stark eingeschränkte, fixierte Interessen - suchen Sie nach ungewöhnlich intensiver Fokussierung auf bestimmte Themen oder Aktivitäten.
        4. Hyper- oder Hyporeaktivität auf sensorischen Input - suchen Sie nach atypischen Reaktionen auf sensorische Reize wie Geräusche, Lichter oder Berührungen.
  3. Beurteilung des Auftretens und der Schwere der Symptome
    1. Der Zeitpunkt der Symptome bestätigt, dass die Symptome in der frühen Kindheit (typischerweise vor dem 3. Lebensjahr) vorhanden waren, auch wenn sie später deutlicher werden.
    2. Auswirkungen der Symptome - bestätigen, dass die Symptome eine erhebliche Beeinträchtigung in sozialen, beruflichen oder anderen wichtigen Funktionsbereichen verursachen.
    3. Schweregrade
      HINWEIS: Gemäß DSM-5 wird der Schweregrad von ASD in drei Stufen eingeteilt (Ergänzende Tabelle S1).
      1. Kategorisieren Sie es als Stufe 1, wenn der Patient nur eine leichte Unterstützung benötigt.
      2. Kategorisieren Sie es als Stufe 2, wenn der Patient erhebliche Unterstützung benötigt (moderat).
      3. Kategorisieren Sie als Stufe 3, wenn der Patient eine sehr umfangreiche Unterstützung (schwer) benötigt.
  4. Ausschluss anderer möglicher Ursachen
    1. Medizinische Untersuchung Führen Sie notwendige medizinische Untersuchungen durch (z. B. genetische Tests, bildgebende Verfahren des Gehirns), um andere Erkrankungen auszuschließen, die ähnliche Symptome verursachen können (z. B. genetische Syndrome, Hörbehinderungen, geistige Behinderungen).
    2. Komorbiditätsbewertung: Bewerten Sie das Vorhandensein von komorbiden Erkrankungen (z. B. Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung, Angststörungen, Depressionen, Epilepsie usw.).

2. Probenvorbereitung für die DIA-Massenspektrometrie-Analyse

  1. Ethische Compliance und Probenentnahme
    1. Holen Sie die Einverständniserklärung der Eltern oder Erziehungsberechtigten von Kindern im Alter von 3 bis 7 Jahren ein, bei denen eine Autismus-Spektrum-Störung (ASD) diagnostiziert wurde.
    2. Klassifizieren Sie Patienten in die Schweregrade 1 bis 3 gemäß den diagnostischen Kriterien, die im amerikanischen DSM-5 für Autismus (Schritt 1.3.3) beschrieben sind.
    3. Sammeln Sie Serumproben von den Teilnehmern. Stellen Sie sicher, dass alle Proben innerhalb von vier Stunden nach der Blutentnahme verarbeitet werden, um einen Proteinabbau zu verhindern. Bewahren Sie die Proben während der Verarbeitung auf Eis auf.
  2. Entfernung von Proteinen mit hoher Abundanz
    1. Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um Proteine mit hoher Abundanz aus 60 μl Serum pro Probe zu depletieren, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Kurz gesagt, äquilibrieren Sie die Depletionssäule mit Bindungspuffer, laden Sie die Serumprobe und lassen Sie sie unter Schwerkraft durch die Säule passieren. Sammeln Sie den Durchfluss, der die Proteinfraktion mit geringer Abundanz enthält.
    2. Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit einem BCA-Assay. Normalisieren Sie alle Proben auf eine Endkonzentration von 0,5-1,0 μg/μl vor dem Aufschluss in Lösung. Stellen Sie sicher, dass jede Probe mindestens 100 μg Protein für die anschließende Analyse enthält.
  3. Proteinverdauung
    HINWEIS: Der Proteinverdau wurde unter Verwendung der von Wisniewski et al. beschriebenen FASP-Methode durchgeführt24.
    1. Fügen Sie das Detergens, Dithiothreitol (DTT) und Iodacetamid (IAA) in UA (Harnstoffpuffer) Puffer hinzu, um reduziertes Cystein zu blockieren.
    2. Verdauen Sie die Proteinsuspension mit Trypsin im Verhältnis 50:1 über Nacht bei 37 °C.
  4. Peptid-Entsalzung, -Reinigung und Umkehrphasenfraktionierung mit hohem pH-Wert
    1. Zentrifugieren Sie die Peptidmischungen bei 16.000 × g für 15 min bei °C, um unlösliche Rückstände zu entfernen.
    2. Übertragen Sie den Überstand (der verdaute Peptide enthält) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung, um Adsorptionsverluste zu minimieren.
    3. . Bereiten Sie C18-Mikrosäulen (hausintern mit C18-Harz verpackt) vor, indem Sie sie mit 100 % Methanol (20 μl) vorkonditionieren und mit 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser äquilibrieren (Puffer A; 20 μl).
    4. Laden Sie die Peptidprobe auf die Mikrosäule. Waschen Sie die Säule mit 20 μl Puffer A, um Salze, Reinigungsmittel und nicht-peptidische Verunreinigungen zu entfernen.
    5. Eluierte gereinigte Peptide mit 20 μl 80 % Acetonitril mit 0,1 % TFA.
    6. Trocknen Sie die eluierten Peptide unter Vakuum mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator. Lagern Sie getrocknete Peptide bis zur weiteren Verwendung bei -8 °C.
    7. Rekonstituieren Sie getrocknete Peptide in 0,1 % Ameisensäure vor der LC-MS/MS-Analyse.
    8. 2.4.8.Quantifizierung der Peptidkonzentration durch Messung der Extinktion bei 280 nm (OD280) mit einem Spektralphotometer unter Berücksichtigung der Beiträge von Tryptophan- und Tyrosinrückständen für eine genaue Quantifizierung.
      Zur Fraktionierung von Peptidmischungen mittels Umkehrphasen-HPLC mit hohem pH-Wert verwenden Sie eine C18-Säule (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) auf einem HPLC-System mit einer Flussrate von 0,3 mL/min, mobile Phase A: 10 mM Ammoniumformiat in Wasser, pH 10 (eingestellt mit Ammoniumhydroxid), mobile Phase B: 10 mM Ammoniumformiat in 90 % Acetonitril, pH 10. Führen Sie eine Gradientenelution durch, um 60 Fraktionen pro Probe über ~60 Minuten zu sammeln.
    9. Kombinieren Sie jede dritte Fraktion, um Redundanzen zu reduzieren, was zu 20 gepoolten Fraktionen pro Probe führt. Trocknen Sie jede gepoolte Fraktion unter Vakuum für die nachgelagerte Analyse.
      HINWEIS: Die resultierenden Peptidfraktionen sind nun bereit für die Nano-LC-MS/MS-Analyse.

3. Einreichung für die DIA-Massenspektrometrie-Analyse

  1. DIA-Massenspektrometrie-Analyse
    1. Spiken Sie das datenabhängige Akquisitionspeptid (DDA) aus der HPRP-Fraktion mit iRT-Standardpeptiden und trennen Sie sie mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf einem Nano-HPLC-System mit einer Säule (75 μm x 150 mm; 2 μm C18-Kügelchen, 120 Å) bei einer Flussrate von 300 nL/min mit mobiler Phase A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser, mobile Phase B: 0,1 % Ameisensäure in 95 % Acetonitril.
    2. Eluieren Sie die Peptide über 60 min mit einem linearen Gradienten von Puffer B, der wie folgt eingestellt ist: 0 - 2 min, linearer Gradient von 2 % bis 5 % Puffer B; 2 - 42 min, linearer Gradient von 5% bis 20% Puffer B; 42 - 50 min, linearer Gradient von 20% bis 35% Puffer B; 50 - 52 min, linearer Gradient von 35% bis 90% Puffer B; 52 - 60 min, Puffer B wird bei 90% gehalten.
    3. Analysieren Sie die eluierten Peptide auf dem referenzierten Massenspektrometer. Erfassen Sie MS-Daten mit einer datenabhängigen top20-Methode, bei der dynamisch die am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen aus dem Survey-Scan (350 - 1500 m/z) für die HCD-Fragmentierung ausgewählt werden.
    4. Führen Sie das Gerät mit aktiviertem Peptiderkennungsmodus aus. Verwenden Sie eine Sperrmasse von 445,120025 Da als internen Standard für die Massenkalibrierung. Erfassen Sie die vollständigen MS-Scans mit einer Auflösung von 70.000 bei m/z 200 und 17.500 bei m/z 200 für MS/MS-Scans. Legen Sie die maximale Injektionszeit auf 50 ms für MS und 30 ms für MS/MS, die normierte Kollisionsenergie auf 28, das Isolationsfenster auf 1,6 Th und die dynamische Ausschlussdauer auf 30 s fest.
  2. LC-MS/MS-Analyse zur datenunabhängigen Erfassung (DIA)
    1. Spiken Sie die Peptide aus jeder Probe gleichmäßig und separat mit iRT.
    2. Führen Sie LC-MS/MS an einem Quadrupol-Massenspektrometer durch, das mit einem Nano-HPLC-System gekoppelt ist. Legen Sie die LC-Bedingung auf die gleiche Weise wie für die DDA-Methode oben fest. Führen Sie einen Vermessungsscan von 400 bis 1.200 m/z bei einer Auflösung von 60.000 mit einem AGC-Ziel von 3E6 und einer Injektionszeit von 30 ms durch. Erfassen Sie die DIA MS/MS-Scans mit einer Auflösung von 15.000 mit einem Isolationsfenster von 20 m/z und einem AGC-Ziel von 1E6 und einer Injektionszeit von 50 ms. Legen Sie die normierte Kollisionsenergie auf 30 fest.
    3. Zeichnen Sie die Spektren vollständiger MS- und DIA-Scans in Profil- bzw. Schwerpunkttypen auf.
  3. Suche in Sequenzdatenbanken
    1. Analysieren Sie die DDA MS-Daten mit der DIA-Software2.
    2. Durchsuchen Sie die MS-Daten mit der Humandatenbank UniProtKB (insgesamt 186.532 Einträge, heruntergeladen am 10/2019), die mit Proteinen gespickt ist, die aus 11 iRT-Peptidsequenzen bestehen.
    3. Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym. Definieren Sie die maximal zwei übersehenen Spaltstellen und die Massentoleranz von 4,5 ppm für Vorläuferionen und 20 ppm für Fragmentionen für die Datenbanksuche. Definition der Carbamidomethylierung von Cysteinen als feste Modifikation und die Acetylierung des N-terminalen Proteins und die Oxidation von Methionin als variable Modifikationen für die Datenbanksuche.
    4. Filtern Sie die Suchergebnisse der Datenbank und exportieren Sie sie mit einer False-Discovery-Rate (FDR) von <1 % auf Peptidspektrum-übereinstimmender bzw. Proteinebene.
  4. Durchführung der Rohdatenverarbeitung
    1. Analyse der DIA MS-Daten wurden mit der DIA-Software [34, 35] analysiert, um aus den Suchergebnissen eine spektrale Bibliothek zu generieren. Verwenden Sie die Standardeinstellungen für die Suche und die dynamische iRT für die Vorhersage der Aufbewahrungszeit. Stellen Sie sicher, dass die Kollisionskorrektur für MS/MS-Scan aktiviert ist.
    2. Exportieren Sie die Ergebnisse mit <1% FDR auf Peptidebene.

4. Differentielle Proteinanalyse

  1. Führen Sie Hypothesentests mit dem Student's t-Test in Kombination mit der Faltungsänderung (FC) bei http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70 durch.
    1. Melden Sie sich bei der Cloud-Plattform an, und navigieren Sie zum Analysetool für Hypothesentests . Laden Sie die vorverarbeitete Datendatei zur Proteinquantifizierung hoch (z. B. im CSV- oder TXT-Format).
    2. Wählen Sie in den Parametereinstellungen als statistische Methode den Student-t-Test und die Signifikanzschwelle beim p-Wert < 0,05 aus. Definieren Sie den Schwellenwert für die Fold-Änderung als FC > 1,5 oder FC < 1/1,5. Klicken Sie auf Analyse ausführen , und warten Sie, bis die Ergebnisse generiert wurden.
    3. Laden Sie die Ausgabedatei herunter, die die p-Werte, log2(FC) und den Signifikanzstatus für jedes Protein enthält.
      HINWEIS: Dieser Ansatz mit zwei Kriterien schafft ein Gleichgewicht zwischen statistischer Signifikanz und biologischer Relevanz und gewährleistet eine robuste Identifizierung von differentiell exprimierten Proteinen (DEPs).

5. Analyse des Signalwegs

  1. Visualisierung des Vulkandiagramms
    1. Navigieren Sie unter http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 zum Werkzeug und dann zur Werkzeugseite für das Vulkandiagramm .
      1. Laden Sie die Ergebnisdatei der DEP-Analyse aus Abschnitt 4 hoch.
      2. Visualisierungsparameter konfigurieren: X-Achse: log2(Fold Change) - zeigt die Richtung der Änderung an; Y-Achse: -log10(p-Wert) - spiegelt die statistische Signifikanz wider; Farbkodierung: Rot : signifikant hochregulierte Proteine (p < 0,05 und FC > 1,5); Blau : signifikant herunterregulierte Proteine (p < 0,05 und FC < 0,667); Grau : nicht signifikante Proteine (p ≥ 0,05 oder 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
      3. Klicken Sie auf Bild generieren und laden Sie das hochauflösende Bild (PDF/SVG-Format) zur Veröffentlichung herunter.
  2. Hierarchische Clustering-Heatmap
    1. Navigieren Sie zum Tool bei http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. Greifen Sie auf das Clustering-Heatmap-Tool zu.
      2. Laden Sie die gefilterte DEP-Ausdrucksmatrix hoch.
      3. Legen Sie die folgenden Parameter fest: Normalisierungsmethode: zeilenweiser Z-Score zur Beseitigung von Skalenunterschieden; Entfernungsmetrik: Euklidische Entfernung; Clustering-Methode: vollständige Verknüpfung hierarchisches Clustering; Optional: Aktivieren Sie das Spalten- und/oder Zeilen-Clustering je nach Stichprobengruppierung.
      4. Klicken Sie auf Ausführen , um die Heatmap zu generieren.
      5. Laden Sie die Heatmap herunter und speichern Sie sie als publikationsfertiges Bild.
        HINWEIS: Die Heatmap stellt die Ähnlichkeit und Divergenz der Proteinexpressionsmuster zwischen den Proben visuell dar.
  3. GO Funktionale Annotation und Anreicherungsanalyse
    1. Installieren und laden Sie die erforderlichen R-Pakete:
      Bibliothek(clusterProfiler)
      Bibliothek(org. Hs.eg.db)
      Bibliothek(ggplot2)
    2. Konvertieren Sie Protein-IDs (z. B. Uniprot- oder Gensymbole) in Entrez-IDs:
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. Führen Sie eine GO-Anreicherungsanalyse durch:
      go_enrich <- enrichGO(gen = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
    4. Visualisieren Sie die Ergebnisse mit Hilfe von Punktdiagrammen:
      1. dotplot(go_enrich, showCategory = 20)
        Formel:
        Reicher Faktor = (a/b) / (c/d)
        Wo:
        a = Anzahl der DEPs, die mit dem Begriff annotiert sind;
        b = Gesamtzahl der DEP;
        c = Anzahl der Hintergrundproteine, die mit dem Term annotiert sind;
        d = Gesamtzahl der Hintergrundproteine.
  4. KEGG-Signalweg-Annotation und Anreicherungsanalyse
    1. Durchführung einer KEGG-Anreicherungsanalyse:
      kegg_enrich <- anreichernKEGG(Gen = entrez_ids$ENTREZID, Organismus = "hat")
    2. Visualisieren Sie die Ergebnisse des KEGG-Signalwegs:
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. Anpassen von Diagrammen mit ggplot2 für die Formatierung von Publikationen.

6. Erstes Screening von Proteinen mittels ROC-Kurvenanalyse

  1. Datenaufbereitung : Laden Sie den Proteomik-Datensatz mit allen differentiell exprimierten Proteinen (DEPs), die aus der Autismus-Spektrum-Störung (ASD) und der Kontrollgruppe identifiziert wurden. Stellen Sie sicher, dass der Datensatz Proteinexpressionswerte für beide Gruppen enthält, mit eindeutigen Beschriftungen, die ASD und Kontrollproben anzeigen.
  2. Führen Sie eine ROC-Kurvenanalyse durch.
    1. Verwenden Sie das pROC-Paket in R, um eine ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) für jedes Protein durchzuführen.
    2. Bewerten Sie die Fähigkeit jedes Proteins, zwischen der ASD- und der Kontrollgruppe zu unterscheiden, indem Sie die Fläche unter der Kurve (AUC) berechnen.
      AUC = 0,5: Keine Diskriminierung (entspricht dem Zufall).
      0,7 ≤ AUC < 0,8: Akzeptable Diskriminierung.
      0,8 ≤ AUC < 0,9: Ausgezeichnete Unterscheidung.
      AUC ≥ 0,9: Herausragende Unterscheidung.
      HINWEIS: Die AUC stellt die Wahrscheinlichkeit dar, dass eine zufällig ausgewählte Person aus der ASD-Gruppe einen höheren Proteinspiegel aufweist als eine zufällig ausgewählte Person aus der Kontrollgruppe. Eine höhere AUC deutet auf eine bessere diagnostische Leistung hin, wobei Werte über 0,8 in Biomarker-Studien im Allgemeinen als klinisch bedeutsam angesehen werden.
    3. Notieren Sie die AUC-Werte für alle Proteine.
  3. Wählen Sie mögliche Biomarker aus.
    1. Identifizieren Sie Proteine mit einer AUC von mehr als 0,7 als Kandidaten-Biomarker.
    2. Exportieren Sie die Liste der Kandidaten-Biomarker für die weitere Analyse.
  4. Visualisieren Sie die Ergebnisse.
    1. Verwenden Sie das ggplot2-Paket in R, um Visualisierungen der ROC-Kurven für die leistungsstärksten Proteine zu erstellen.
    2. Fügen Sie die AUC-Werte aus Gründen der Übersichtlichkeit in die Diagrammlegenden ein.

7. Sekundäres Screening mit Random Forest

  1. Bereiten Sie die Eingabedaten vor.
    1. Verwenden Sie die Liste der Kandidaten-Biomarker, die aus der ROC-Analyse erhalten wurden, als Eingabe für die Random-Forest-Analyse.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Datensatz ordnungsgemäß formatiert ist, wobei Zeilen Proben und Spalten Proteinexpressionswerte darstellen.
  2. Trainieren Sie das Random Forest-Modell.
    1. Wenden Sie den Random Forest-Algorithmus mithilfe des randomForest-Pakets in R an.
    2. Legen Sie die Anzahl der Bäume (ntree) auf 500 und die Anzahl der Variablen, die bei jeder Teilung zufällig ausgewählt wurden (mtry), auf die Quadratwurzel der Gesamtzahl der Features fest.
    3. Bewerten Sie die Wichtigkeit von Features mithilfe der Metrik MeanDecreaseAccuracy, die die Verringerung der Modellgenauigkeit misst, wenn ein bestimmtes Feature entfernt wird.
    4. Trainieren Sie ein Random Forest-Modell mit dem randomForest-Paket in R:
      R. library(randomForest)
      # Beispiel: Vorhersage der Gruppe (z. B. ASD vs. Kontrolle) anhand der Proteinspiegel
      rf_model <- randomForest(x = protein_data,
      y = as.factor(Gruppe),
      importance = TRUE, # Erforderlich zum Berechnen der Feature-Wichtigkeit
      ntree = 500) # Anzahl der Bäume
    5. Extrahieren Sie Metriken zur Wichtigkeit von Funktionen mit der Funktion importance():
      R. importance_scores <- Wichtigkeit(rf_model)
    6. Rufen Sie die MeanDecreaseAccuracy-Werte ab, und sortieren Sie sie in absteigender Reihenfolge:
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "MeanDecreaseAccuracy"]
      importance_rank <- sortieren(mean_dec_acc, abnehmend = WAHR)
    7. Visualisieren Sie die Wichtigkeit von Funktionen mit der integrierten Funktion varImpPlot():
      R. varImpPlot(rf_model, main = "Wichtigkeit von Merkmalen (mittlere Abnahme der Genauigkeit)")
      HINWEIS: Die Metrik MeanDecreaseAccuracy gibt an, wie wichtig jedes Feature für die Vorhersageleistung des Modells ist. Eine starke Abnahme der Genauigkeit beim Entfernen weist auf eine hohe Bedeutung hin. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Entdeckung von Biomarkern, da er hilft, Proteine oder Gene mit der stärksten Unterscheidungskraft zwischen Gruppen zu priorisieren.
    8. Exportieren Sie die Wichtigkeitsbewertungen für die Berichterstellung oder nachgelagerte Analyse:
      R. importance_table <- data.frame(
      Merkmal = Namen(importance_rank),
      MittelwertVerringernGenauigkeit = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", row.names = FALSCH)
    9. Ordnen Sie die Proteine basierend auf ihren MeanDecreaseAccuracy-Werten.
    10. Wählen Sie die 15 Proteine mit den höchsten MeanDecreaseAccuracy-Werten als signifikanteste Merkmale für die nachfolgende Modellierung aus.
    11. Exportieren Sie die Liste dieser Proteine zur weiteren Validierung.
      HINWEIS: Proteine mit niedrigen MeanDecreaseAccuracy-Werten haben möglicherweise nur minimale Auswirkungen auf die Modellleistung, wenn sie entfernt werden.
    12. Heben Sie die biologische Relevanz der ausgewählten Proteine hervor, insbesondere derjenigen, die mit Immunfunktionen oder Signalwegen zusammenhängen, die an ASD beteiligt sind.

8. Kombinieren Sie die Ergebnisse für die endgültige Auswahl der Biomarker.

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass R mit den folgenden Paketen installiert wird: pROC, randomForest und ggplot2. Stellen Sie sicher, dass der Proteomik-Datensatz vor der Analyse vorverarbeitet und normalisiert wird. Speichern Sie die Listen der Kandidaten-Biomarker und Visualisierungsdiagramme als separate Dateien als Referenz.

  1. Integrieren Sie Erkenntnisse.
    1. Vergleichen Sie die Ergebnisse der ROC-Analyse und des Random-Forest-Screenings, um überlappende Proteine zu identifizieren.
    2. Priorisieren Sie Proteine, die in beiden Analysen als äußerst zuverlässige Biomarkerkandidaten erscheinen.
    3. Führen Sie zusätzliche Validierungsschritte durch, wie z. B. die Leave-One-Out-Kreuzvalidierung (LOOCV), um die Robustheit der ausgewählten Biomarker zu bestätigen.
    4. Verwenden Sie logistische Regressionsmodelle, um die Vorhersagegenauigkeit des kombinierten Biomarker-Sets zu bewerten.
    5. Erstellen Sie ROC-Kurven und Precision-Recall-Diagramme für den endgültigen Satz von Biomarkern mit dem ggplot2-Paket.
    6. Fügen Sie Metriken wie AUC und Precision-Recall-Werte hinzu, um das diagnostische Potenzial der ausgewählten Biomarker zu demonstrieren.

9. Bidirektionale Merkmalsauswahl

  1. Bereiten Sie die Daten vor und definieren Sie das Modell.
    1. Laden Sie den Datensatz mit den Proteinexpressionswerten und den entsprechenden Beschriftungen (z. B. ASD vs. Kontrolle). Stellen Sie sicher, dass das Dataset vorverarbeitet und normalisiert ist.
    2. Definieren des Anfangsmodells: Verwenden Sie für die Klassifizierung ein generalisiertes lineares Modell (GLM) mit einer Binomialfamilie.
    3. Verwenden Sie AIC als Auswertungsmetrik, um Modelle während der Feature-Auswahl zu vergleichen.
  2. Durchführen der Vorwärts-Feature-Auswahl.
    1. Beginnen Sie mit einem leeren Modell, das nur den Achsenabschnittsterm enthält.
    2. Fügen Sie jeweils eine Funktion hinzu, die auf der größten Reduzierung des AIC basiert.
    3. Notieren Sie den AIC-Wert nach jeder Addition. Stoppen Sie, wenn keine weitere Verringerung der AIC beobachtet wird.
  3. Durchführen der Rückwärtsauswahl von Merkmalen.
    1. Trainieren Sie ein Modell mit allen verfügbaren Funktionen.
    2. Entfernen Sie jeweils ein Feature basierend auf der geringsten Erhöhung des AIC.
    3. Notieren Sie den AIC-Wert nach jeder Entnahme. Stoppen Sie, wenn keine weitere Verringerung der AIC beobachtet wird.
    4. Kombinieren Sie Vorwärts- und Rückwärtsschritte.
  4. Wechseln Sie zwischen Vorwärts- und Rückwärtsauswahl.
    1. Führen Sie eine Runde der Vorwärts-Feature-Auswahl durch, gefolgt von einer Runde der Rückwärts-Feature-Auswahl. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine weiteren Verbesserungen der AIC mehr zu beobachten sind.
    2. Alternativer Ansatz: Beginnen Sie mit der Rückwärts-Feature-Auswahl, und führen Sie dann die Vorwärts-Feature-Auswahl durch. Bewerten Sie die Auswirkungen des Hinzufügens zuvor entfernter Features zum Modell.
  5. Finalisieren Sie die ausgewählten Funktionen.
    1. Exportieren Sie die endgültige Liste der ausgewählten Features und der entsprechenden Koeffizienten (Ergänzende Abbildung S1).

10. Kreuzvalidierung der bidirektionalen Merkmalsauswahl mittels logistischer Regression mit Leave-One-Out-Methode

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass R mit den folgenden Paketen installiert ist: caret, pROC und ggplot2. Der Proteomik-Datensatz sollte vor der Analyse vorverarbeitet und normalisiert werden. Speichern Sie die Konfusionsmatrix, die ROC-Kurve und die Modellzusammenfassung als separate Dateien als Referenz.

  1. Bereiten Sie die Daten vor und definieren Sie das Modell.
    1. Laden Sie den Datensatz mit den Proteinexpressionswerten und den entsprechenden Beschriftungen (z. B. ASD vs. Kontrolle) aus der GLMSTEP/bothFitModel.txt-Datei. Stellen Sie sicher, dass das Dataset vorverarbeitet und normalisiert ist.
    2. Definieren Sie das Anfangsmodell mithilfe eines verallgemeinerten linearen Modells (GLM) mit einer Binomialfamilie für die Klassifizierung.
    3. Verwenden Sie die Genauigkeit und den Kappa-Koeffizienten als Auswertungsmetriken, um die Modellleistung während der Kreuzvalidierung zu bewerten.
  2. Führen Sie eine Kreuzvalidierung durch.
    1. Initialisieren Sie die Kreuzvalidierung mithilfe des Caret-Pakets in R, um die Leave-One-Out-Kreuzvalidierung (Leave-One-Out-Kreuzvalidierung, LOOCV) zu implementieren.
    2. Passen Sie das logistische Regressionsmodell mit den acht ausgewählten Features an.
    3. Notieren Sie die Genauigkeit und den Kappa-Koeffizienten für jede Iteration der Kreuzvalidierung.
  3. Analysieren Sie die Ergebnisse der Kreuzvalidierung.
    1. Fassen Sie die Ergebnisse zusammen.
      HINWEIS: Die Ergebnisse des LOOCV-Prozesses sehen (wie in dieser Studie) wie folgt aus: Verallgemeinertes lineares Modell, 169 Stichproben, 8 Prädiktoren, 2 Klassen: 'A', 'B', Resampling: Leave-One-Out Cross-Validation , Zusammenfassung der Stichprobengrößen: 168, 168, 168, 168, 168, ... , Resampling-Ergebnisse: Genauigkeit Kappa 0,9526627 0,9024531.
    2. Interpretieren Sie die Metriken.
      HINWEIS: Hier erreichte das Modell eine Genauigkeit von 0,9527 und einen Kappa-Koeffizienten von 0,9025, was auf eine hervorragende Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten und den beobachteten Ergebnissen hinweist.
      1. Schauen Sie sich den Kappa-Koeffizienten an, um die Vorhersagekraft des Modells zu messen. Der Kappa-Koeffizient reicht von -1 bis 1, wobei 0 für eine zufällige Vorhersage und 1 für eine perfekte Übereinstimmung steht.
        HINWEIS: In dieser Studie spiegelt der Kappa-Wert von 0,9025 die starke Vorhersagekraft des Modells wider.
  4. Werten Sie die Modellkoeffizienten aus.
    1. Untersuchen Sie die Koeffizienten des logistischen Regressionsmodells, um den Beitrag der einzelnen Features zu verstehen. Werten Sie die Nullabweichung, die Restabweichung und den AIC aus, um die Anpassung des Modells zu bestätigen.
      HINWEIS: In dieser Studie erhielten wir beispielsweise die Nullabweichung: 2,2928e+02 bei 168 Freiheitsgraden, die Restabweichung: 2,2378e-07 bei 160 Freiheitsgraden, AIC: 18, die Anzahl der Fisher-Scoring-Iterationen: 25.
  5. Visualisieren Sie die Ergebnisse.
    1. Erstellen Sie eine Konfusionsmatrix, um die Vorhersageleistung des Modells zu visualisieren.
    2. Plotten Sie die ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic), um die Klassifizierungsleistung des Modells zu bewerten.
    3. Interpretieren Sie das Ergebnis s. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC), um den Klassifikationsleistungsindex des Modells zu erhalten.
      HINWEIS: Die ROC-Kurve zeigt den Kompromiss zwischen der Richtig-Positiv-Rate und der Falsch-Positiv-Rate. Die Fläche unter der Kurve (AUC) sollte nahe bei 1 liegen, was auf eine hervorragende Klassifizierungsleistung hinweist. Die ROC-Kurve spiegelt die Änderungen der Richtig-Positiv-Rate und der Falsch-Positiv-Rate des Modells bei unterschiedlichen Schwellenwerten wider. Je größer der AUC-Wert, desto besser ist die Leistung des Modells.

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Ergebnisse

Die Studie umfasste 99 Kinder mit ASD und 70 altersangepasste Kontrollen (3-7 Jahre) mit ausgewogener Geschlechterverteilung (Ergänzende Tabelle S2). Das Serum wurde nach dem nächtlichen Fasten nach standardisierten Protokollen entnommen: Das Blut wurde in Serum-Separatorröhrchen entnommen, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und dann 10 Minuten lang bei 4 °C bei 1.500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert und bis zur weiteren Verar...

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Diskussion

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll skizziert einen umfassenden Ansatz zur Identifizierung immunbezogener molekularer Biomarker bei Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) unter Verwendung von datenunabhängiger Erfassung (DIA), Massenspektrometrie und maschinellen Lerntechniken. Die wichtigen Schritte innerhalb des Protokolls sorgen für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse und zeigen gleichzeitig Bereiche auf, in denen möglicherweise Änderungen oder Fehlerbehebungen erforder...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Vielen Dank an alle Mitglieder des Zentrallabors und an alle, die bei diesem Projekt geholfen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien und ChemikalienAcetonitril (HPLC-Qualität)Fisher ScientificNr. A18-50
Reagenzien und ChemikalienAmmoniumbikarbonat (NH? HCO?)Sigma-Aldrich38939
Reagenzien und ChemikalienAmmoniumformiatSigma-Aldrich90265
Reagenzien und ChemikalienRinderserumalbumin (BSA)Thermo Fisher Scientific23212
Reagenzien und ChemikalienDithiothreitol (DVB-T)Sigma-Aldrich43815
Reagenzien und ChemikalienAmeisensäure (0,1 %)Thermo Fisher Scientific28905
Reagenzien und ChemikalienJodacetamid (IAA)Sigma-AldrichNr. I1149
Reagenzien und ChemikalienMethanol (HPLC-Qualität)Fisher ScientificNr. A452-4
Reagenzien und ChemikalienTrifluoressigsäure (TFA)Sigma-AldrichNr. T6508
Reagenzien und ChemikalienHarnstoffSigma-AldrichNr. U5378
Kits und SpezialreagenzienBCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23227
Kits und SpezialreagenzienC18 Sep-Pak PatronenGewässerWAT023590
Kits und SpezialreagenzienC18 StageTips (hausgemacht)3M Empore&Handel;
Kits und SpezialreagenzienKit für Proteinverarmung mit hoher HäufigkeitMillipore Sigma122642
Kits und SpezialreagenzieniRT Standard PeptideBiognosys AG
Kits und SpezialreagenzienLysozym-ELISA-KitWuhan Fine Biotech Co. Ltd.
Kits und SpezialreagenzienTrypsin/LysC-EnzymmischungPromegaNr. V5071
AusrüstungZentrifugeEppendorf5430R
AusrüstungEasy-nLC 1200 SystemThermo Fisher Scientific
AusrüstungNanodrop One SpektralphotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-W
AusrüstungQ Exactive HF-X MassenspektrometerThermo Fisher Scientific
AusrüstungSpeedVac KonzentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA
AusrüstungRotorzentrifuge mit SchaufelVerschieden
AusrüstungWaters XBridge BEH130 SäuleGewässerC18, 3,5 μ m, 2,1&fach; ca. 150 mm
AusrüstungAgilent 1260 HPLC-SystemAgilent1260 Infinity II
Software und Online-ToolsBioleiter (R-Pakete)bioconductor.org
Software und Online-ToolsEinfügezeichen (R-Paket)CRANcaret_6.0-93
Software und Online-ToolsclusterProfiler (R-Paket)Bioleiter4.0.5
Software und Online-ToolsDIA-NNDIA-NN-Softwarev1.8
Software und Online-Toolsggplot2 (R-Paket)CRAN3.4.0
Software und Online-ToolsMaxQuantMax-Planck-Institut1.6.17
Software und Online-Toolsomickits.comOmiKits Cloud-Plattformhttp://www.omickits.com
Software und Online-ToolspROC (R-Paket)CRAN1.18.0
Software und Online-ToolsrandomForest (R-Paket)CRAN4.7-1.1
Software und Online-ToolsSpektronaut Pulsar XBiognosys AG17
Software und Online-ToolsUniProtKB Human-Datenbankuniprot.orgVeröffentlichung 2019_10
Andere MaterialienMikrozentrifugenröhrchen mit geringer BindungEppendorf30120094
Andere MaterialienSerum-Separator-Röhrchen (SST)BD Biowissenschaften367988
Andere Materialien3M Empore&Handel; C18-Festplatten3M

Referenzen

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