Analyse von multidimensionalen Mikroskopiedaten mittels Cell-ACDC

Summary

Die genaue Analyse von mehrdimensionalen Mikroskopiedaten erfordert komplexe Arbeitsabläufe. Dieser Artikel zeigt, wie Sie die Software Cell-ACDC verwenden. Es nutzt hochmoderne KI-gesteuerte Modelle für die Segmentierung, Nachverfolgung, Analyse von Zellstammbäumen und Quantifizierung von Mikroskopiedaten. Entscheidend ist, dass es diese Modelle durch ein innovatives Framework für die halbautomatische Korrektur der Modellausgabe ergänzt.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der quantitativen Mikroskopie für die Lebenswissenschaften haben es experimentellen Biologen ermöglicht, Zellen mit beispielloser Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Gleichzeitig hat die KI-Revolution die Menge an Informationen, die aus mehrdimensionalen Mikroskopiedaten extrahiert werden können, drastisch erhöht. Die große Menge an generierten Daten und die Komplexität modernster KI-Modelle stellen jedoch einen schwerwiegenden Engpass in der Phase der Bildanalyse dar. Cell-ACDC ist eine benutzerfreundliche Open-Source-Software, die eine leistungsstarke End-to-End-Lösung für die Segmentierung, Verfolgung und quantitative Analyse einzelner Zellen in mehrdimensionalen Mikroskopiedaten bietet. Es ist auf Experimentalbiologen zugeschnitten, denen es möglicherweise an fortgeschrittenem technischem Know-how mangelt, um solche Modelle zu implementieren. Dieser Artikel zeigt, wie das Framework genutzt werden kann, um die neuesten Modelle zusammen mit vielen Tools für die intelligente und halbautomatische Datenkorrektur einfach zu nutzen, um die Menge der verfügbaren biologischen Informationen zu maximieren. Cell-ACDC unterstützt Mehrkanal-, Zeitraffer- und Z-Stapel-Mikroskopiedaten und bietet ein dediziertes Toolset, das auf jede Art von Datendimensionalität zugeschnitten ist. Aufgrund seines modularen Aufbaus, der es ermöglicht, neue Modelle nahtlos zu integrieren und für Biologen direkt zugänglich zu machen, hat Cell-ACDC das Potenzial, als Referenzwerkzeug für die Datenanalyse in der Mikroskopie zu dienen.

Introduction

Die Mikroskopie ist von grundlegender Bedeutung, um die biologische Entdeckung in jeder Phase der Forschung und Entwicklung zu beschleunigen, von der Grundlagenforschung ^1,2,3 bis zur Arzneimittelforschung und -prüfung ^4,5 und über eine bemerkenswerte Bandbreite von Größen, von Zellkulturen über Gewebe ^6,7, Organoide ^8,9 bis hin zu ganzen Organismen¹⁰. Diese fortschrittlichen Mikroskopietechniken haben jedoch zwei Hauptnachteile. Erstens sind Mikroskopiedaten von Natur aus groß¹¹, insbesondere wenn sie mehrere Dimensionen (z. B. Zeit und Volumen) erfassen. Zweitens erfordert die genaue Extraktion der reichhaltigen biologischen Informationen in den Daten den Einsatz fortschrittlicher Bildanalyse-Frameworks, die oft auf KI-Modellen aufbauen. Diese Aufgabe kann für Experimentalbiologen entmutigend sein. Daher können die Schritte der Datenverarbeitung, -verarbeitung und -analyse die wissenschaftliche Forschung stark verlangsamen und gleichzeitig das Potenzial für neue Entdeckungen verringern. Im Idealfall sollten Software-Frameworks für die Biobildanalyse den Benutzer bei jedem Schritt der Analyse unterstützen, von der Handhabung von Rohmikroskopiedateien über die Segmentierung und Nachverfolgung bis hin zur nachgelagerten Analyse zur Extraktion biologischer Erkenntnisse. In der Praxis war die schnelle Entwicklung neuer Software für die Biobildanalyse zwar ein positives Ergebnis, hatte aber den Nebeneffekt, dass eine verstreute Landschaft von Werkzeugen entstand, die für einen bestimmten Analyseschritt spezifisch waren oder fortgeschrittene Programmierkenntnisse erforderten. Dies stellt den Benutzer vor die schwierige Aufgabe, den Analyse-Workflow zusammenzustellen, was oft zu suboptimalen Pipelines führt, in denen Daten mehrmals gespeichert, bearbeitet und konvertiert werden, um sie mit dem nächsten Tool kompatibel zu machen. Darüber hinaus ist die Entwicklung der Biobildanalyse nicht auf eine einzige Programmiersprache standardisiert, da viele Tools als ImageJ¹²- oder QuPath^13-Plugins (Java), Napar-Plugins (Python)¹⁴ oder Python-Skripte entwickelt werden. In einigen Fällen führt dieses herausfordernde Umfeld dazu, dass sich Wissenschaftler für eine manuelle Analyse entscheiden, ein Prozess, der nicht nur langsam ist, sondern auch menschliche Verzerrungen hervorruft und die Reproduzierbarkeit behindert.

Um dieses Problem zu lösen, wurde Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle⁾¹⁵ entwickelt, ein in Python geschriebenes Open-Source-Software-Toolset zur Analyse mehrdimensionaler Mikroskopiedaten. Entscheidend ist, dass Cell-ACDC eine Vielzahl von vorimplementierten und (bei Bedarf) automatisch installierten Modellen auf dem neuesten Stand der Technik für die Segmentierung (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, etc.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,^27,28) und Tracking (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, etc.19,29,30,31,32,33,34). Ergänzt werden diese Modelle durch ein Framework zur Visualisierung von annotierten Daten und computergestützte manuelle Korrekturen. Darüber hinaus bietet Cell-ACDC innerhalb desselben Frameworks ein Modul für jeden Schritt der Bildanalyse-Pipeline, das sich automatisch um die Verarbeitung, Verarbeitung und Speicherung von Daten kümmert (Abbildung 1). Genauer gesagt ermöglicht es dem Benutzer, Instanzsegmentierung (z. B. einzelne Zellen), Objektverfolgung, Annotation von Zellzuständen (z. B. Zellzyklusstadium) und verschiedene Formen der Quantifizierung, einschließlich der Analyse der verfügbaren Fluoreszenzkanäle, durchzuführen.

Eine der Hauptstärken von Cell-ACDC ist die Analyse von Zeitraffer-Mikroskopiedaten von lebenden Zellen, die aufgrund der Notwendigkeit der Konsistenz über die Zeitpunkte hinweg erhebliche Herausforderungen darstellt. Während es zahlreiche Modelle für die automatisierte Segmentierung und Verfolgung einzelner Zellen gibt, sind manuelle Korrekturen für die Beantwortung komplexer biologischer Fragestellungen nach wie vor unerlässlich. Cell-ACDC bietet eine Reihe von Tools, die speziell entwickelt wurden, um den Korrekturprozess zu rationalisieren. Es integriert intelligente Algorithmen, um die Anzahl der manuellen Einstellungen zu minimieren. Insbesondere werden Korrekturen automatisch über alle relevanten zukünftigen und vergangenen Frames weitergegeben, wodurch die Datenintegrität während der gesamten Analyse gewahrt bleibt. Angesichts des modularen Aufbaus und der wachsenden Nutzerbasis hat die Weiterentwicklung dieser Software Priorität, wobei sich die kontinuierlichen Bemühungen auf die Integration neuer Modelle und die Berücksichtigung der sich entwickelnden Bedürfnisse der Community konzentrieren.

Protocol

HINWEIS: Cell-ACDC ist so konzipiert, dass es für Benutzer ohne Programmierkenntnisse so klar und intuitiv wie möglich ist. Dies wird vor allem dadurch erreicht, dass der Analyse-Workflow in kleinere, leicht verständliche Schritte unterteilt und zusätzliche Informationen über Tooltips und Info-Buttons bereitgestellt werden. Da Cell-ACDC ein breites Spektrum an Schritten abdeckt, deren Ausführungsreihenfolge oft nicht sequenziell ist, ist in Abbildung 2 ein Entscheidungsdiagramm dargestellt. In der folgenden Anleitung wird ein konkretes Beispiel vorgestellt. Die Schritte 10 und 11 können verwendet werden, um andere Daten zu importieren, anstatt die in Schritt 3 heruntergeladenen bereitgestellten Daten zu verwenden.

1. Installation von Cell-ACDC

HINWEIS: Cell-ACDC wird derzeit als Python-Paket über den Python Package Index (PyPI) vertrieben und kann mit dem Befehl pip install "cellacdc[torch]" installiert werden.

1. Miniforge einrichten
   1. Laden Sie das Installationsprogramm von der Miniforge-Website herunter (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ).
   2. Miniforge installieren: Führen Sie unter Windows das heruntergeladene Installationsprogramm aus und folgen Sie den Anweisungen. Öffnen Sie unter Mac oder Linux das Terminal und führen Sie den folgenden Befehl aus:
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Sobald die Installation abgeschlossen ist, öffnen Sie das richtige Terminal, indem Sie die folgenden Anweisungen befolgen:
      1. Drücken Sie unter Windows Win + S, geben Sie Miniforge Prompt ein und drücken Sie die Eingabetaste.
      2. Für Mac/Linux: Öffnen Sie die Terminal-App.
2. Verwalten Sie die virtuelle Umgebung.
   1. Geben Sie in der Eingabeaufforderung den folgenden Befehl ein, um eine virtuelle Umgebung zu erstellen. Drücken Sie dann die Eingabetaste , um den Befehl auszuführen.
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. Aktivieren Sie die Umgebung, indem Sie Folgendes ausführen:
      Conda ACDC aktivieren
3. Installation
   1. Wenn die Umgebung aktiv ist, installieren Sie Cell-ACDC, indem Sie den folgenden Befehl ausführen:
      pip install "cellacdc[fackel]"
   2. Führen Sie nach der Installation Cell-ACDC -y aus, damit die Software ihre Einrichtung abschließen kann.

2. Ausführen von Cell-ACDC

1. Öffnen Sie die richtige Klemme (siehe Schritt 1.1.3).
2. Aktivieren Sie die Umgebung, indem Sie den folgenden Befehl ausführen:
   Conda ACDC aktivieren
3. Starten Sie Cell-ACDC, indem Sie den folgenden Befehl ausführen:
   Zelle-ACDC

3. Herunterladen von Beispieldaten

HINWEIS: Die Beispieldaten werden unter Windows unter "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" und unter MacOS und Linux unter "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" heruntergeladen. Wenn der Willkommensleitfaden nicht angezeigt wird, wählen Sie in der Menüleiste des Hauptfensters des Cell-ACDC-Startprogramms die Option Hilfe > Begrüßungsleitfaden (Abbildung 3B) aus.

1. Wählen Sie Herunterladen und Testen mit einem Zeitrafferbeispiel aus (Abbildung 3B).
2. Warten Sie, bis der Download abgeschlossen ist.
3. Klicken Sie auf Nein, um das direkte Laden der Daten in die GUI zu stoppen.

4. Modul zur Datenvorbereitung

HINWEIS: Die Daten können vor der Segmentierung ausgerichtet werden, und es können interessante Regionen (ROIs) ausgewählt werden. Diese Schritte sind optional, aber von Vorteil, wenn das Sichtfeld im Laufe der Zeit verschoben wird bzw. wenn nur Teile der Daten von Interesse sind.

1. Klicken Sie im Hauptfenster auf Datenvorbereitungsmodul starten..., um das Datenvorbereitungsmodul zu öffnen (Abbildung 1A, Modul zur Datenvorverarbeitung).
2. Wählen Sie den Ordner aus, der die Daten enthält.
   1. Klicken Sie auf das Ordnersymbol in der Symbolleiste des neuen Fensters, um die Mikroskopiedaten zu laden (Abbildung 4A).
   2. Wählen Sie den Ordner aus, der die Daten enthält, und bestätigen Sie die Auswahl mit der Taste Ordner auswählen.
3. Wählen Sie einen Kanal für den Ausrichtungsprozess aus, indem Sie das Dropdown-Menü verwenden, um den phase_contr Kanal auszuwählen. Drücken Sie dann OK , um die Auswahl zu bestätigen (Abbildung 4B).
4. Drücken Sie OK , um die Bildeigenschaften zu bestätigen (Abbildung 4C).
   HINWEIS: Wenn Sie mit Z-Stapel-Daten arbeiten, aber nur ein Slice für die Segmentierung verwendet werden soll, wählen Sie mit dem Schieberegler den entsprechenden Z-Slice aus. Verwenden Sie die Schaltflächen in der Symbolleiste, um die Auswahl bei Bedarf auf andere Rahmen anzuwenden.
5. Führen Sie den Ausrichtungsprozess aus.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , die sich ebenfalls in der Symbolleiste befindet (Abbildung 5A).
   2. Klicken Sie auf Ja , um den Ausrichtungsprozess zu starten.
      HINWEIS: Klicken Sie auf Nein , um die Ausrichtung zu überspringen.
   3. Drücken Sie OK , um zu bestätigen, dass die Informationen zum Auffüllen bestätigt wurden.
      HINWEIS: Die Ausrichtung kann je nach Datengröße einige Zeit in Anspruch nehmen.
   4. Drücken Sie OK , um die Ausrichtung abzuschließen, sobald der Vorgang abgeschlossen ist.
6. Legen Sie ROIs und Hintergrund-ROIs fest.
   1. Wechseln Sie zum letzten Frame des Segmentierungsvideos, indem Sie den Schieberegler für die Frame-Auswahl im unteren Teil der Datenvorbereitungs-GUI verwenden.
   2. Passen Sie den automatisch hinzugefügten ROI des Hintergrunds an, indem Sie ihn über das Bild ziehen oder die Größe mit den Rauten ändern. Stellen Sie sicher, dass der ROI im Hintergrund keine Zellen enthält. Lassen Sie den ROI unverändert (Abbildung 5B).
      HINWEIS: Um zusätzliche ROIs zu definieren, klicken Sie auf die Schaltfläche "ROI für Zuschnitte hinzufügen " (in der Symbolleiste) und wählen Sie sie im Viewer aus. In der Regel sollte der ROI so gering wie möglich sein, aber dennoch alle relevanten Zellen in relevanten Frames umfassen. Um die Reproduzierbarkeit innerhalb dieses Protokolls zu gewährleisten, wird jedoch empfohlen, es nicht zu modifizieren.
7. Um die ausgewählten ROIs in neue Bilddateien zuzuschneiden, klicken Sie auf die Schaltfläche Zuschneiden ganz links.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Wenn beschnittene Bilder nicht benötigt werden, kann das Fenster geschlossen werden. Die Koordinaten aller ROIs und Hintergrund-ROIs werden automatisch gespeichert und können später für die Segmentierung verwendet werden. Wenn der ROI nicht geändert wurde, haben diese Schaltflächen keine Auswirkungen. Zu den Zuschneideoptionen gehören XY-Richtungen, Z-Schnitte oder bestimmte Zeitbereiche. Jede Schaltfläche ist mit den Abmessungen beschriftet, die abgeschnitten werden.
8. Speichern Sie die ausgerichteten Daten
   1. Schließen Sie das Fenster mit der Schaltfläche zum Schließen des Fensters (z. B. das X in der oberen rechten Ecke unter Windows oder den roten Punkt in der oberen linken Ecke unter macOS oder Linux).
   2. Drücken Sie Ja, ausgerichtete Daten speichern, um die ausgerichteten Daten zu speichern.
   3. Klicken Sie zur Bestätigung auf Ja, ausgerichtete Daten erneut speichern .
9. Speichern Sie zugeschnittene Daten, wenn Schritt 4.7 nicht übersprungen und der ROI nicht geändert wurde.
   1. Wählen Sie Ja, zugeschnittene Daten speichern aus, um die zugeschnittenen Daten zu speichern.
   2. Drücken Sie Ja, zuschneiden bitte, um das Speichern des Zuschnitts zu bestätigen.
   3. Klicken Sie auf OK , um den Standardordnerpfad zu bestätigen.
      HINWEIS: Wählen Sie einen anderen Ordner aus, um die nicht zugeschnittenen Daten zu behalten.
   4. Wählen Sie Ja, überschreiben aus, um zu bestätigen, ob zuvor der Standardpfad verwendet wurde.
   5. Drücken Sie OK , um zu bestätigen, nachdem der Vorgang abgeschlossen ist.

5. Finden des besten Modells und der besten Parameter für die Segmentierung

HINWEIS: Cell-ACDC bietet eine grafische Benutzeroberfläche mit Echtzeit-Feedback, um die besten Segmentierungsparameter zu finden (Abbildung 6). In der Regel werden diese Modelle von Dritten zur Verfügung gestellt, die jeweils über eine eigene Dokumentation verfügen. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, das beste Segmentierungsmodell und seine optimalen Parameter zu bestimmen, und die Benutzer sollten die Dokumentation des jeweiligen Modells, das sie versuchen, auf weitere Informationen überprüfen.

1. Klicken Sie im Hauptfenster auf GUI starten... (Abbildung 1A, Modul Visualisieren und korrigieren).
2. Laden Sie die Beispieldaten.
   1. Klicken Sie auf das Ordnersymbol in der Symbolleiste des neuen Fensters, um das Ordnerauswahlmenü zu öffnen.
   2. Wählen Sie den Ordner mit den Daten aus und drücken Sie dann auf Ordner auswählen , um die Auswahl zu bestätigen.
3. Wählen Sie einen Kanal für die Visualisierung aus. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um den Kanal auszuwählen, der für die Segmentierung phase_contr , und wählen Sie dann zur Bestätigung OK aus.
4. Schließen Sie das Laden der Daten ab.
   1. Drücken Sie OK , um den Namen der Standardsegmentierungsmaske zu bestätigen.
   2. Klicken Sie auf OK für geladene Positionen , um die Bildeigenschaften zu bestätigen.
   3. Wählen Sie Nein , um das Laden zusätzlicher Fluoreszenzdaten zu verhindern.
5. Wählen Sie in der Modusauswahl (Abbildung 6, "Modusauswahl") den Modus Segmentierung und Verfolgung aus.
6. Finden Sie die besten Vorverarbeitungseinstellungen.
   1. Navigieren Sie zu Image > Vorverarbeitung... in der oberen Menüleiste, um das benutzerdefinierte Vorverarbeitungsfenster zu öffnen (Abbildung 7A).
   2. Wählen Sie im Dropdown-Menü Hotpixel entfernen oder einen anderen gewünschten Vorverarbeitungsschritt aus.
   3. Verwenden Sie das Zahnradsymbol , um die Einstellungen für einen Schritt zu initialisieren und zu ändern. Verwenden Sie die Info-Schaltfläche , um Informationen über den Schritt und die verfügbaren Parameter anzuzeigen. Lassen Sie die Einstellungen unverändert.
   4. Verwenden Sie das Plus-Symbol , um einen weiteren Schritt hinzuzufügen.
   5. Wählen Sie Intensitäten neu skalieren und bestätigen Sie die Einstellungen, indem Sie die Schritte 5.6.1 und 5.6.2 wiederholen.
   6. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Vorschau , um die Auswirkungen der Schritte in Echtzeit zu sehen.
   7. Klicken Sie auf Auf alle Frames anwenden (Abbildung 7B).
   8. Drücken Sie auf Vorverarbeitete Daten speichern , um den Speichervorgang zu starten.
   9. Drücken Sie OK , um den Standardnamen zu bestätigen.
   10. Schließen Sie das Fenster Rezeptvorverarbeitung .
7. Finden Sie die besten Segmentierungseinstellungen.
   1. Wählen Sie im oberen Menüband Segment > Angezeigten Rahmen segmentieren und dann YeaZ_v2 aus (Abbildung 8A).
   2. Drücken Sie OK , um YeaZ_v2 herunterzuladen, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
      HINWEIS: Der Download kann einige Minuten dauern. Der Fortschritt wird im Konsolenfenster angezeigt. Schließen Sie die GUI während des Downloads nicht, auch wenn sie nicht reagiert.
   3. Lassen Sie die Standardparameter unverändert.
      HINWEIS: Die meisten Parameter verfügen über Info-Schaltflächen, die eine detaillierte Anleitung bieten.
   4. Aktivieren Sie die Nachbearbeitung, indem Sie die Segmentierungsparameter für die Nachbearbeitung aktivieren (Abbildung 8B).
   5. Übernehmen Sie die Parameter, indem Sie auf OK klicken.
      HINWEIS: Die Segmentierung kann je nach Komplexität des Modells, Bildgröße und Computerspezifikationen einen Moment dauern. Insbesondere Cellpose Version 4 kann sehr langsam sein.
   6. Wenn Sie gefragt werden, ob Sie die automatische Segmentierung aktivieren möchten, wählen Sie Nein.
   7. Stellen Sie sicher, dass die Segmentierung gut funktioniert.
   8. Wiederholen Sie Schritt 5.7.1, um die Segmentierungsparameter erneut zu öffnen.
   9. Wenn die Segmentierungsergebnisse wie erwartet sind, klicken Sie auf Alle Parameter in Rezeptdatei speichern. Andernfalls ändern Sie die Segmentierungsparameter, und wiederholen Sie die Schritte 5.7.4 bis 5.7.8.
   10. Verwenden Sie die Texteingabe , um dem Segmentierungsrezept den Namen test zu geben.
   11. Klicken Sie auf OK , um den Namen zu übernehmen.
   12. Drücken Sie OK , um das Speichern des Workflows abzuschließen.
   13. Schließen Sie das Parameterauswahlbild.
8. Schließen des GUI-Fensters
   1. Schließen Sie das GUI-Fenster.
   2. Drücken Sie Nein , um vor dem Schließen nicht zu speichern.

6. Segmentierung und Nachverfolgung (Stapelverarbeitung)

1. Klicken Sie im Hauptfenster auf Segmentierungsmodul starten (Abbildung 1A, Modul "Segmentieren und verfolgen").
   1. Wählen Sie die Beispieldaten aus. Verwenden Sie die Ordnerauswahl von Cell-ACDC, um den Ordner mit den Daten auszuwählen, und drücken Sie dann auf Ordner auswählen , um die Auswahl zu bestätigen.
2. Wählen Sie die Parameter für die Stapelverarbeitung aus.
   1. Wählen Sie den Kanal phase_contr_preprocessed als Kanal für die Segmentierung aus. Drücken Sie OK , um die Auswahl zu bestätigen.
      HINWEIS: Einige Modelle verwenden einen zusätzlichen Kanal als Eingang. Dieser Kanal kann später beim Festlegen anderer Segmentierungsparameter ausgewählt werden.
   2. Bestätigen Sie die Bildeigenschaften mit einem Klick auf OK.
3. Legen Sie die Einstellungen für das Segmentierungsmodell fest.
   1. Wählen Sie YeaZ_v2 als Modell aus, das für die Segmentierung verwendet werden soll, und bestätigen Sie die Auswahl mit OK.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Gespeichertes Rezept laden..., um das zuvor gespeicherte Rezept zu laden.
   3. Wählen Sie segmentation_recipe_test.ini aus der Liste aus und bestätigen Sie die Auswahl mit OK.
   4. Schließen Sie die Meldung über den erfolgreichen Ladevorgang, indem Sie OK drücken.
   5. Bestätigen Sie die Parameter, indem Sie OK auswählen.
4. Bestätigen Sie andere Segmentierungseinstellungen.
   1. Drücken Sie OK , um den Standardnamen für die Segmentierungsdatei zu übernehmen.
   2. Wählen Sie Nein aus, um zu bestätigen, dass das gesamte Bild segmentiert werden soll.
   3. Wählen Sie OK , um das Stoppbild als letztes Bild des Zeitraffers festzulegen.
5. Legen Sie die Tracking-Einstellungen fest. Wählen Sie YeaZ als zu verwendende Tracking-Methode aus und bestätigen Sie die Auswahl mit OK.
6. Führen Sie die Segmentierungs- und Tracking-Routine aus.
   1. Klicken Sie auf Jetzt ausführen , um die Segmentierungs- und Nachverfolgungspipeline auszuführen.
      HINWEIS: Dies kann je nach Bildgröße, Modellkomplexität und Computerspezifikationen mehrere Stunden dauern. In Testläufen dauerte die Segmentierung der Testdaten mit YeaZ_v2 auf einem Gerät ohne GPU etwa 2 Minuten.
   2. Klicken Sie auf OK , um die Segmentierung abzuschließen.

7. Korrektur von Segmentierungs- und Tracking-Fehlern

HINWEIS: Im Allgemeinen werden Zellen, die im aktuellen Rahmen im Vergleich zum vorherigen Rahmen fehlen, durch eine gelbe Kontur und eine gelbe ID gekennzeichnet. Neu erkannte Zellen werden mit einer roten ID und einer dicken Kontur angezeigt. Zellen, die als verloren akzeptiert wurden, werden mit einer grünen Kontur und ID angezeigt.

1. Klicken Sie im Hauptfenster auf GUI starten... (Abbildung 1A, Modul "Visualisieren und korrigieren").
2. Laden Sie die Beispieldaten.
   1. Klicken Sie auf das Ordnersymbol in der Symbolleiste des neuen Fensters.
   2. Wählen Sie den Ordner mit den Daten aus und drücken Sie dann auf Ordner auswählen , um die Auswahl zu bestätigen.
3. Wählen Sie einen Kanal für die Visualisierung aus. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um den Kanal phase_contr_preprocessed auszuwählen, und wählen Sie dann zur Bestätigung OK aus.
4. Wählen Sie den Namen der Segmentierungsmaske aus. Wählen Sie Ausgewählte laden aus, um die im vorherigen Schritt erstellte Segmentierungsdatei zu laden.
5. Schließen Sie den Datenladevorgang ab.
   1. Bestätigen Sie die Bildeigenschaften, indem Sie bei geladenen Positionen auf OK klicken.
   2. Wählen Sie Nein , um das Laden zusätzlicher Fluoreszenzdaten zu verhindern.
6. Verwenden Sie den Modus-Selektor (Abbildung 6, "Modus-Selektor"), um den Segmentierungs- und Tracking-Modus auszuwählen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Kontrollkästchen am unteren Rand der GUI, um die angezeigten Anmerkungen zu ändern. Das linke und das rechte Bild können unterschiedliche Anmerkungen anzeigen.
7. Wählen Sie einen Echtzeit-Tracker aus. Navigieren Sie in der Menüleiste (Abbildung 6, "Menüleiste") zu Tracking > Wählen Sie den Echtzeit-Tracking-Algorithmus aus, und wählen Sie den gewünschten Echtzeit-Tracker aus. Verwenden Sie Cell-ACDC oder Cell-ACDC 2 Schritte für knospende Hefe oder Cell-ACDC symmetrische Teilung für andere Organismen .
8. Korrigieren Sie die Segmentierung und das Tracking.
   1. Verwenden Sie die Pfeiltasten nach links und rechts , um zwischen den Frames zu navigieren.
   2. Navigieren Sie zu Bild 10.
   3. Drücken Sie die Taste S , um das Werkzeug zur manuellen Knospentrennung zu aktivieren.
   4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Segmentierungsmaske von Zelle 1 automatisch zu teilen.
   5. Navigieren Sie zu Bild 14.
   6. Drücken Sie die Taste B , um den Pinsel zu aktivieren.
   7. Zeichnen Sie mit der linken Maustaste die fehlende Segmentierungsmaske für die Knospe.
   8. Durchlaufen Sie die nachfolgenden Frames, während Sie Segmentierungs- und Tracking-Fehler korrigieren. Verwenden Sie die verfügbaren Werkzeuge (Abbildung 6, "Symbolleiste bearbeiten"). Korrigieren Sie mindestens bis Bild 42.
      HINWEIS: Die meisten Werkzeuge verfügen über einen Tooltip, der ihre Funktionalität erklärt. Bewegen Sie den Mauszeiger über ein Werkzeug, um die QuickInfo anzuzeigen.

8. Anmerkungen zum Zellzyklus

HINWEIS: Fahren Sie erst mit diesem Schritt fort, nachdem Sie die Segmentierungs- und Tracking-Korrekturen für alle relevanten Frames abgeschlossen haben. Verwenden Sie den richtigen Annotationsmodus je nach Zellteilungstyp (symmetrisch, z. B. Säugetierzellen, oder asymmetrisch, z. B. knospende Hefe). Die Beispieldaten finden Sie unter "Asymmetrisch teilende Zellen", Schritt 8.1. Schritt 8.2 beschreibt den allgemeinen Arbeitsablauf für symmetrisch teilende Zellen.

1. Asymmetrisch teilende Zellen
   HINWEIS: Bei Organismen wie knospenden Hefen können Knospen den Müttern zugeordnet werden. Beide Objekte müssen im selben Rahmen vorhanden sein. Standardmäßig wird das erwartete Zellzyklusstadium basierend auf den Annotationen für knospende Hefe angezeigt. Das Zellzyklusstadium der Knospen wird in Rot angezeigt, während das aller anderen Objekte in Weiß angezeigt wird. Mütter sind mit ihren Knospen durch eine gestrichelte, gelbe Linie verbunden.
   1. Aktivieren Sie die Zellzyklusanalyse mit dem Moduswähler (Abbildung 6, "Moduswähler").
   2. Wählen Sie Ja, zu Bild 1 wechseln aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   3. Verwenden Sie die Pfeiltasten nach links und rechts , um zwischen den Frames zu navigieren.
   4. Navigieren Sie zu Bild 41. Klicken Sie auf OK , um die Initialisierung der Tabelle Cell Cycle Annotation zu übernehmen, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Zelle 1 oder ihre Knospe, um die Verbindung zu trennen und das Zellteilungsereignis zu kommentieren.
   6. Fahren Sie fort, bis alle relevanten Frames angezeigt wurden. Korrigieren Sie Fehler in der automatischen Zuweisung von Mutterknospen mit den verfügbaren Werkzeugen (Abbildung 6, "Symbolleiste bearbeiten").
   7. Verfügbare Werkzeuge
      HINWEIS: Diese Werkzeuge, mit Ausnahme des Werkzeugs " Mutter-Knospen-Assoziation aufheben/neu binden ", können mit einem anpassbaren Tastaturbefehl oder durch Drücken der zugehörigen Schaltflächen in der Symbolleiste aktiviert werden.
      1. Knospe der Mutter zuweisen (A): Aktivieren Sie das Werkzeug "Knospe der Mutter zuweisen ". Halten Sie die rechte Maustaste an der Knospe gedrückt. Ziehen Sie auf die entsprechende Mutterzelle und lassen Sie die Maustaste los.
         HINWEIS: Verwenden Sie dieses Tool, wenn die automatische Zuweisung von Knospen zu Müttern falsch ist.
      2. Unbekannte Historie mit Anmerkungen versehen (U): Aktivieren Sie das Werkzeug Unbekannte Historie kommentieren . Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle, die mit einer unbekannten Historie versehen werden soll.
         HINWEIS: Verwenden Sie dieses Werkzeug, um Zellen mit einem unbekannten Verlauf manuell mit Anmerkungen zu versehen und so Mehrdeutigkeiten bei Abstammungsdaten zu korrigieren, bei denen die automatische Inferenz nicht ausreicht.
      3. Neuinitialisieren der Zellzyklus-Anmerkung
         HINWEIS: Verwenden Sie diese Option, um den Zellenzyklus-Anmerkungsalgorithmus ab dem aktuellen Frame erneut auszuführen. Dies gewährleistet die Konsistenz mit den letzten Korrekturen oder Aktualisierungen von Segmentierungs-/Tracking-Daten.
      4. Mutter-Knospen-Assoziation aufheben/neu binden: Stellen Sie sicher, dass kein anderes Werkzeug ausgewählt ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein vorhandenes Mutter-Knospen-Paar, um die Verbindung zu unterbrechen, oder klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste, um die Verbindung wiederherzustellen.
2. Symmetrische Teilungszellen
   HINWEIS: Diese Funktion befindet sich im Beta-Test und wird in Kürze offiziell veröffentlicht. Es ist möglich, zwei oder mehr Tochterzellen einer einzigen Mutterzelle zuzuordnen. Potenzielle Mutterzellen sind diejenigen, die im vorherigen Frame vorhanden sind, aber im aktuellen nicht vorhanden sind, während potenzielle Tochterzellen neu erscheinende Zellen im aktuellen Frame sind.
   1. Aktivieren Sie Normalteilung: Abstammungsbaum mit dem Moduswähler (Abbildung 6, "Moduswähler").
   2. Wählen Sie Ja, zu Bild 1 wechseln aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   3. Verwenden Sie die Pfeiltasten nach links und rechts , um zwischen den Frames zu navigieren.
   4. Korrigieren Sie Fehler in den automatischen Mutter-Tochter-Zuweisungen mit den verfügbaren Werkzeugen (Abbildung 6, "Symbolleiste bearbeiten").
   5. Geben Sie Änderungen weiter, wenn Sie dazu aufgefordert werden, indem Sie auf "Übertragen" klicken.
   6. Verfügbare Werkzeuge
      HINWEIS: Diese Werkzeuge können über die Tastenkombination oder die entsprechenden Schaltflächen in der Symbolleiste aktiviert werden.
      1. Mutter für neue Zellen-ID suchen (F): Aktivieren Sie das Werkzeug Mutter für neue Zellen-ID suchen . Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die neue Zelle, um die Kandidaten-Mutterzellen zu durchlaufen. Umschalt + Rechtsklick , um rückwärts durch die Kandidaten zu blättern.
         HINWEIS: Verwenden Sie dieses Werkzeug, um die Mutter einer Tochterzelle zuzuweisen oder zu ändern.
      2. Unbekannte Mutter festlegen (U): Aktivieren Sie das Werkzeug Unbekannte Mutter festlegen . Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle, deren Mutter unbekannt ist.
         HINWEIS: Verwenden Sie dieses Werkzeug, um die Mutter einer Zelle manuell als unbekannt zu kennzeichnen.

9. Speichern von Daten

1. Navigieren Sie im oberen Menüband zu Datei > Speichern .
2. Klicken Sie auf Maße festlegen..., um die gewünschten Maße auszuwählen.
3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben mCitrin-Metriken oder anderen gewünschten Messungen.
4. Klicken Sie zur Bestätigung auf OK .
5. Klicken Sie auf Ja , um die Messungen zu speichern.
6. Klicken Sie auf OK , um den Rahmen zu bestätigen, bis zu dem die Messungen gespeichert werden sollen.
7. Klicken Sie auf Nein , wenn Sie zur Datenverkettung aufgefordert werden.

10. Erstellen der Datenstruktur

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Vorbereitung der Mikroskopiedaten für die Segmentierung und Nachverfolgung erläutert. Dies kann übersprungen werden, wenn Demonstrationsdaten verwendet werden, die unter "Herunterladen von Beispieldaten" heruntergeladen werden. Die Datenstruktur, die generiert wird, ist in Abbildung 9 dargestellt.

1. Legen Sie die Mikroskopiedatei(en) in einen leeren Ordner.
   HINWEIS: Mikroskopieformate wie .czi (Zeiss), .lif (Leica) und .nd2 (Nikon) sowie einzelne .tif- und .png Dateien werden unterstützt.
2. Klicken Sie auf das Modul 0. Erstellen einer Datenstruktur... im Hauptfenster (Abbildung 1A, Modul "Datenstruktur erstellen").
3. Wählen Sie BioIO oder Fiji Macro aus.
   1. Wenn Windows verwendet wird, klicken Sie auf BioIO verwenden, während für MacOS- und Linux-Benutzer die Option Fiji-Makro verwenden auswählen.
      HINWEIS: Im Folgenden wird davon ausgegangen, dass Windows verwendet wird.
   2. Wenn Sie aufgefordert werden, BioIO zu installieren, drücken Sie OK , um es zu installieren.
   3. Wählen Sie die Anordnung der Mikroskopiedatei aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option aus, die der Anordnung der Mikroskopiedateien entspricht, und drücken Sie dann zur Bestätigung die Taste OK .
4. Wählen Sie Quell- und Zielordner und Datenladestrategie aus
   1. Drücken Sie auf Fertig , um zu bestätigen, dass sich die Dateien in einem ansonsten leeren Ordner befinden.
   2. Verwenden Sie die Ordnerauswahl von Cell-ACDC, um den Ordner auszuwählen, der die Datei(en) enthält.
   3. Drücken Sie Ordner auswählen , um einen Ordner auszuwählen.
   4. Drücken Sie erneut auf Ordner auswählen , um denselben Ordner wie den Zielordner auszuwählen.
      HINWEIS: Die Rohmikroskopiedatei wird nicht gelöscht.
   5. Wählen Sie Ja, gesamte Position auf einmal laden.
5. Wenn Sie aufgefordert werden, ein BioIO-Unterpaket zu installieren, drücken Sie OK , um es zu installieren.
6. Legen Sie die Metadaten für die Eingabedatei fest.
   1. Korrigieren Sie die Metadaten.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die "Reihenfolge der Dimensionen", indem Sie auf das kleine Augensymbol neben den Feldern für den Kanalnamen klicken. Andere Metadaten, die nicht aus der Rohdatei geladen werden konnten, werden hervorgehoben.
   2. Drücken Sie OK , um die Metadaten zu bestätigen.
   3. Drücken Sie Ja , um die Reihenfolge der Bemaßungen zu bestätigen.
7. Warten Sie, bis der Vorgang abgeschlossen ist.
8. Drücken Sie Ja , um das Fenster zu schließen, wenn der Vorgang abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Das Erstellen der Datenstruktur kann je nach Datengröße Stunden dauern.

11. Dienstprogramme zur Datenvorverarbeitung

HINWEIS: Im Hauptfenster stehen mehrere Optionen zum Verarbeiten von Bildern zur Verfügung, bevor Sie mit der Analyse fortfahren. Um auf diese Tools zuzugreifen, gehen Sie in der Menüleiste des Hauptfensters zum Dropdown-Menü "Dienstprogramme " (Abbildung 1B, "Dienstprogramme"), bewegen Sie den Mauszeiger über die Bildvorverarbeitung und wählen Sie dann die Option aus, die verwendet werden soll. Zwei Beispiele sind:

1. Kanäle kombinieren: Verwenden Sie diese Option, um zwei oder mehr Bildkanäle zusammenzuführen.
   HINWEIS: So können z.B. zwei Fluoreszenzkanäle gemittelt werden.
2. Bildgröße ändern: Verwenden Sie diese Option, um die Größe sehr großer Bilddatasets zu reduzieren.
   HINWEIS: Dies kann die Verarbeitungszeit erheblich beschleunigen und hat in vielen Fällen nur geringe oder gar keine Auswirkungen auf die Segmentierungsqualität.

12. Fehlerbehebung

1. Wenn Cell-ACDC abstürzt, erstellen Sie einen Fehlerbericht auf der GitHub-Seite von Cell-ACDC, indem Sie zur Registerkarte "Issues " navigieren und auf die grüne Schaltfläche "Neues Problem" klicken. Befolgen Sie die bereitgestellte Vorlage, um alle relevanten Details anzugeben, die zur Diagnose und Behebung des Problems erforderlich sind. Alternativ können Sie sich auch im image.sc-Forum unter dem Tag #cell-acdc Hilfe suchen oder sich an einen der entsprechenden Autoren wenden. In vielen Fällen, insbesondere nach der Installation eines Pakets, kann ein einfacher Neustart der Software das Problem beheben.
2. Wenn Cell-ACDC einfriert oder nicht mehr reagiert, überprüfen Sie die Konsole auf Fortschrittsaktualisierungen. Lange Segmentierungszeiten, insbesondere bei der Verwendung rechenintensiver Modelle wie Cellpose Version 4 oder bei der Verarbeitung großer Datensätze, sind normal. Wenn Cell-ACDC weiterhin nicht reagiert, finden Sie weitere Anweisungen in Schritt 12.1.
3. Wenn die automatische Segmentierung fälschlicherweise den Hintergrund enthält, prüfen Sie, ob ein Vorverarbeitungsschritt den Hintergrund möglicherweise zu stark geglättet hat. Viele Segmentierungsmodelle werden mit rohen (nicht vorverarbeiteten) Bildern trainiert und können eine schlechte Leistung erbringen, wenn der Hintergrund nicht über eine ausreichende Textur verfügt.

Results

Quantifizierung des Kernvolumens in Tumorsphäroiden in 3D

Die automatisierte 3D-Mikroskopie (z-Stacks) ermöglicht es Wissenschaftlern, komplexe mehrzellige Systeme wie Organoide sichtbar zu machen. Um morphologische und Fluoreszenzsignaleigenschaften auf Einzelzellebene zu quantifizieren, ist häufig eine Zellsegmentierung in 3D erforderlich. Das folgende Beispiel zeigt, wie Cell-ACDC die Zellkerne in Organoiden, die Tausende von Zellen aus dem Kernfärbekanal enthalten, segmentieren und ihr Volumen quantifizieren kann (Daten aus ^Ref.9). Die Segmentierung wurde mit einem benutzerdefinierten Cellpose-Modell durchgeführt, das trainiert und in ^Ref.9 veröffentlicht wurde. Das trainierte Cellpose-Modell kann direkt in Cell-ACDC verwendet werden, indem der Pfad der Gewichtungsdatei in der GUI angegeben wird, wenn die Modellparameter für Cellpose v2 ausgewählt werden. Die Segmentierung wurde mit dem zweiten Modul von Cell-ACDC durchgeführt, um alle Bilder im Stapelverfahren zu verarbeiten (Abbildung 1A, Modul "Segmentieren und verfolgen"). Als nächstes wurde das Ergebnis in der GUI des dritten Moduls visualisiert (Abbildung 1A, Modul "Visualisieren und korrigieren"). Dieses Modul wurde optimiert, um Tausende von Einzelobjekten mit mehreren Anmerkungsoptionen (z. B. Konturen, überlagerte Segmentierungsmasken oder Text-IDs) zu visualisieren. Nachdem die Messungen aus den 3D-Masken berechnet wurden, wurden alle verfügbaren Messungen direkt in der GUI dokumentiert. Sie sind zugänglich, indem Sie in der oberen Menüleiste (Abbildung 6, "Menüleiste") das Menü Messungen und dann Messungen einstellen auswählen. Im Popup-Dialogfeld können Benutzer über die Info-Schaltflächen messspezifische Informationen abrufen und auswählen, welche Messungen gespeichert werden sollen. Für die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 10 wurde "cell_vol_fl_3D" verwendet, d. h. das Volumen jedes Objekts, das durch Multiplikation der Gesamtvoxel im Objekt mit der Pixelgröße zum Quadrat und der Voxeltiefe berechnet wird. Diese Eigenschaften werden entweder automatisch aus der Mikroskopie-Rohdatei extrahiert oder vom Benutzer bereitgestellt. Die Berechnung der Messungen über diese GUI erfordert das Laden der Rohbilder. Um den Prozess zu rationalisieren und die Stapelverarbeitung zu ermöglichen, können die Messungen auch über das Menü "Dienstprogramme " (Abbildung 1B, "Dienstprogramme") berechnet werden, indem Sie zum Untermenü "Messungen " und dann zu "Messungen berechnen" für ein oder mehrere Experimente gehen. Schließlich wurde die nukleare Volumenverteilung als repräsentatives Ergebnis aufgetragen (Abbildung 10). Diese Analyse zeigt einen signifikanten Anteil kleiner Zellkerne, wahrscheinlich aufgrund von Segmentierungsartefakten. Sie können leicht entfernt werden, indem kleine Objekte aus der Segmentierungsmaske herausgefiltert werden. Gleichzeitig könnten die sehr großen Kerne auf verschmolzene Kerne während der Segmentierung zurückzuführen sein. Es wird immer empfohlen, die Volumenverteilung von Objekten (z. B. einzelnen Zellen) zu zeichnen, um Artefakte zu identifizieren und zusätzliche biologische Informationen über die Zellgröße zu extrahieren.

Quantifizierung von Zeitraffer-Mikroskopie-Daten

Mit der Zeitraffermikroskopie kann die zelluläre Dynamik direkt auf Einzelzellebene beobachtet werden. Neben der Zellsegmentierung erfordert die Extraktion der zeitlichen Dynamik zusätzliche Analysen, einschließlich Zellverfolgung und Annotation von Zellstammbäumen. Aufgrund der gegenseitigen Abhängigkeit dieser Analysephasen können Fehler, die früh in der Pipeline auftreten, auf spätere Schritte übertragen werden. Infolgedessen ist eine kontinuierliche Visualisierung und Korrektur von Segmentierungs-, Tracking- und Annotationsfehlern erforderlich. Im Folgenden wird gezeigt, dass Cell-ACDC für diese Aufgaben geeignet ist. Es wurden zwei Datensätze von zwei verschiedenen Modellorganismen ausgewählt: 1) knospende Hefe (Stamm DCY001-1 aus ^Ref.35, wo die beiden Histon-H2B-Proteine Htb1 und Htb2 mit mCitrin markiert sind) und 2) embryonale Stammzellen der Maus (mESCs, Daten aus ^Ref.22).

Diese beiden Datensätze zeigen zwei Annotationsmodi, die in Cell-ACDC verfügbar sind: asymmetrische und symmetrische (d. h. symmetrische Zytokinese oder "normale") Zellteilung. Da sich die Art der Teilung unterscheidet, benötigen die beiden Organismen einen unterschiedlichen Tracking- und Annotationsrahmen.

Bei der asymmetrischen Teilung bildet die Mutterzelle eine Knospe, die wächst und sich schließlich trennt, um zur Tochterzelle zu werden. Nach der Teilung behält die Mutterzelle ihre ursprüngliche Zell-ID bei, und ihre Generationsnummer erhöht sich um eins, während der Tochterzelle eine neue Zell-ID zugewiesen wird und ihre Generationsnummer auf eins gesetzt wird. Die Knospenphase entspricht den S/G2/M-Phasen des Zellzyklus und wird als solche in Cell-ACDC annotiert. Diese Annotationsoptionen helfen dabei, typische biologische Fragen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus in knospenden Hefen zu beantworten.

Bei der "symmetrischen" Teilung (z.B. Säugetierzellen) teilt sich die Mutterzelle in zwei Tochterzellen. Die Mutterzelle, also ihre ID, verschwindet bei der Teilung, und die beiden Tochterzellen erhalten neue IDs. Zusätzlich wird die Generationszahl der Tochterzellen um eins relativ zur Mutterzelle erhöht. Cell-ACDC verfolgt auch die übergeordnete ID, die Root-ID (die ursprüngliche Vorfahrzelle am Anfang einer Abstammungslinie) und die Schwester-ID.

Für beide Annotationsmodi wurde ein innovatives Framework zur Korrektur von Annotationsfehlern entwickelt, bei dem die Korrektur automatisch auf alle vergangenen und zukünftigen relevanten Zeitpunkte übertragen wird. Die Visualisierung, Annotation und Korrektur erfolgte in der GUI des dritten Moduls (Abbildung 1A, Modul "Visualisieren und korrigieren" und Abbildung 6). Um die Zellen in Datensatz 1 zu segmentieren und zu verfolgen, wurde das Modell YeaZ_v2²⁶ auf den Phasenkontrastkanal angewendet, während für den Kernkanal (Histon) das StarDist^25-Modell verwendet wurde. Anschließend wies Cell-ACDC mit dem Dienstprogramm Tracking and lineage > Tracking and/or count sub-cellular objects (Abbildung 1B, Menüleiste "Dienstprogramme ") jedem Zellkern die Zell-ID der entsprechenden Zelle zu, um die Konsistenz zwischen den aus Zell- und Zellkernmasken generierten Tabellen sicherzustellen.

Für Datensatz 2 wurde das Segmentierungsmodell DeepSea²² verwendet. Alle drei Modelle sind bereits in Cell-ACDC verfügbar, was den Vorteil der Integration mehrerer Segmentierungsmodelle in die Software zeigt.

Nach der Korrektur von Segmentierungs- und Tracking-Fehlern wurden Zellstammbäume annotiert, numerische Merkmale berechnet und eine nachgelagerte Analyse durchgeführt. Für Datensatz 1 wurden die Spalte TaYFP_amount_autoBkgr und die Anzahl der segmentierten Kerne (Abbildung 11A) gegen die Zeit aufgetragen. "TaYFP" ist der Name des nuklearen Kanals. "amount_autoBkgr" ist ein Proxy für die gesamte zelluläre Proteinmenge, die aus Epifluoreszenzbildern extrahiert wird³⁶. Sie wird berechnet als die Differenz zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität in jeder Zellmaske und dem Hintergrundmedian, multipliziert mit der Zellfläche (in Pixel). Hier wird der Hintergrundmedian aus allen Pixeln berechnet, die nicht als Zellen segmentiert sind. Wie erwartet, beginnt die H2B-Menge mit dem Austreiben der Knospen zu steigen (Abbildung 11A-ii) und erreicht vor der Kernteilung einen konstanten Wert (Abbildung 11A-iii). Dies ist eine wichtige Qualitätskontrolle bei der Homöostase von Histonproteinen, da davon ausgegangen wird, dass die Menge der Histonproteine vom Zellzyklus abhängt. Darüber hinaus bestätigt die Darstellung der Anzahl der Kerne im Laufe der Zeit, dass die Mengen an Histonproteinen das Maximum ungefähr um die Kernteilung herum erreichen.

Für Datensatz 2 wurde die Zellfläche im Zeitverlauf für eine ausgewählte Zelle, die sich in der Zellteilung befindet, dargestellt. Erwartungsgemäß nimmt die Zellfläche bis zum Erreichen eines Maximalwertes zu (Abbildung 11B-i). Dann nimmt sie bis zur Zellteilung (Abbildung 11B-ii) ab, wenn sich die Zelle zusammenzieht. Schließlich beginnt der Zyklus für die beiden Tochterzellen neu. Dies ist eine weitere empfohlene Analyse, da die Überprüfung der Zellgrößenänderungen im Laufe des Zellzyklus unerlässlich ist, um zu bestätigen, dass die Zellen wie erwartet wachsen und sich teilen (oder nicht im Falle bestimmter Mutanten).

Abbildung 1: Cell-ACDC-Module. (A) Überblick über die 4 Hauptmodule, die von der Haupt-Cell-ACDC-Trägerrakete gestartet werden können. Nach dem Segmentieren, Verfolgen und Annotieren von Mikroskopiedaten können numerische Merkmale entweder aus dem dritten Modul ("Visualisieren und korrigieren") oder aus (B) dem Menü "Dienstprogramme " in der oberen Menüleiste berechnet werden. Die "Dienstprogramme" sind die Routinen, die automatisch auf mehreren Datensätzen ohne Benutzereingabe ausgeführt werden können. Neben der Berechnung der Messungen gehören zu den weiteren Dienstprogrammen die Verkettung mehrerer Ausgabetabellen in einer einzigen Tabelle, die Verfolgung subzellulärer Objekte und die Bildvorverarbeitung. Cell-ACDC unterstützt 2D-, 3D- (Z-Stack oder Zeitraffer) und 4D-Daten (Z-Stacks im Zeitverlauf) mit beliebig vielen zusätzlichen Kanälen. Die Ausgabetabelle mit den numerischen Merkmalen kann dann für nachgelagerte Analysen und biologische Entdeckungen verwendet werden (Abbildung 10 und Abbildung 11). Zu diesem Zweck stehen Jupyter-Notebooks auf der GitHub-Seite Cell-ACDC zur Verfügung, die Beispiele für Diagramme enthalten, die aus der Ausgabetabelle abgerufen werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Flussdiagramm der Cell-ACDC-Entscheidung. Ein Flussdiagramm, in dem das Modul beschrieben wird, das je nach Datensatztyp und Analyseanforderungen verwendet werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Laden Sie Beispieldaten herunter. (A) Offener Willkommensleitfaden. (B) Laden Sie Beispieldaten herunter, die zum Replizieren des Protokolls erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Laden von Daten für die Datenvorbereitung. (A) Laden Sie Daten in die GUI der Datenvorbereitung. (B) Wählen Sie den zu ladenden Kanal aus. (C) Bearbeiten und bestätigen Sie die Bildmetadaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ausführen des Datenvorbereitungsprozesses. (A) Starten Sie den Vorgang. (B) Positions-ROIs (für das Zuschneiden) und Hintergrund-ROIs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: GUI des dritten Moduls zur Visualisierung und Korrektur der Ergebnisse. Screenshot der GUI des dritten Moduls ("Visualisieren und korrigieren" in Abbildung 1A) mit hervorgehobenen Elementen. Beachten Sie, dass die meisten Schaltflächen in den Symbolleisten über einen Tooltip verfügen (auf den Sie zugreifen können, indem Sie den Mauszeiger über die Schaltfläche bewegen), der erklärt, wie diese spezielle Funktion verwendet wird. Mit dem Moduswähler kann zwischen 5 Modi umgeschaltet werden: "Viewer", "Segmentierung und Tracking", "Zellzyklusanalyse" (für asymmetrisch teilende Zellen), "Normalteilung: Abstammungsbaum" (für symmetrisch teilende Zellen, z. B. Säugetierzellen) und "Benutzerdefinierte Anmerkungen". Beachten Sie, dass in den anderen GUIs häufig eine Symbolleiste oder Menüleiste vorhanden ist (z. B. im Modul "Datenvorverarbeitung", Abbildung 1). Die Bearbeiten-Symbolleiste enthält alle Funktionen, mit denen Segmentierungs- und Tracking-Fehler bearbeitet und korrigiert werden können (z. B. Pinsel, Radiergummi, Editier-ID usw.). Das geladene Bild wird in einer zweiteiligen Ansicht angezeigt, was hilfreich ist, wenn verschiedene Anmerkungsoptionen benötigt werden (z. B. Zellzyklusinformationen auf dem linken Bild und IDs auf dem rechten Bild). Das rechte Bild kann auch ausgeschaltet werden (klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und deaktivieren Sie die Option Gespiegeltes Bild anzeigen). Jedes Bildfenster verfügt über einen LUT-Schieberegler an der Seite, mit dem Sie die Intensitätsstufen schnell anpassen können. Mit einem Rechtsklick auf den LUT-Regler kann der Benutzer verschiedene Farbkarten für die Intensitätsbilder auswählen. Zusätzlich gibt es auf der rechten Seite einen LUT-Selektor für die Farbe der Segmentierungsbeschriftungen, die über die Intensitätsbilder gelegt werden sollen ( Anmerkungsoption namens Segm.-Masken). Auf der linken Seite der Anmerkungsoptionen für das linke Bild gibt es zusätzliche Umschalter, mit denen Sie einige Einstellungen steuern können, wie z. B. automatisches Speichern, Schriftgröße usw. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Visualisieren Sie die Vorverarbeitung in der Haupt-GUI. (A) Öffnen Sie das Dialogfeld für die Vorverarbeitung. (B) Vorverarbeitungsdialog mit Parametern, die im initialisierten Protokoll verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Visualisieren Sie die Segmentierungsausgabe in der Haupt-GUI. (A) Wählen Sie ein Segmentierungsmodell aus. (B) Richten Sie Segmentierungsparameter ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Von Cell-ACDC benötigte Ordnerstruktur. Um mit Cell-ACDC arbeiten zu können, müssen die Daten in einer bestimmten Ordnerstruktur angeordnet werden. Obwohl Cell-ACDC ein Modul zur automatischen Generierung dieser Struktur bereitstellt, ist es wichtig zu verstehen, wie diese Struktur aussehen soll. Zunächst müssen sich alle Dateien in einem Ordner mit dem Namen "Bilder" befinden. Als nächstes müssen sie alle mit dem gleichen Namen beginnen, dem sogenannten "basename_". Der Mindestsatz der erforderlichen Dateien besteht aus einer Einkanal-TIFF-Datei (2D, 3D-Z-Stapel oder 3D+Zeit) und einer CSV-Datei, die mit "_metadata.csv" endet. Bei dieser Datei muss es sich um eine Tabelle mit zwei Spalten handeln, wobei die erste Spalte "Beschreibung " und die zweite Spalte "Werte" lauten muss, und sie sollte mindestens Einträge für SizeT und SizeZ für die Anzahl der Frames bzw. Z-Slices enthalten. Wenn eine Bilddatei keine Z-Slices enthält, muss SizeZ auf 1 festgelegt werden. Das Gleiche gilt für Bilder ohne Zeitraffer, bei denen SizeT 1 sein muss. Da es sich um eine CSV-Datei handelt, besteht ein Eintrag aus einer einzelnen Zeile von Description,value, die durch ein Komma getrennt ist, z. B. SizeZ,1. Für mehrere Kanäle muss eine TIFF-Datei pro Kanal generiert werden. Der Ordner Bilder muss dann in einem Ordner mit dem Namen "Position_1" abgelegt werden. Es sind mehrere Positionen zulässig, die mit einer fortlaufenden Nummer benannt werden müssen. Beim Laden von Daten in eines der Cell-ACDC-Module kann der Benutzer entweder einen bestimmten Positionsordner oder den gesamten Experimentordner auswählen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: 3D-Quantifizierung von Tumor-Organoiden. Screenshot eines repräsentativen Tumor-Organoids (Daten von⁹), das in die GUI des dritten Moduls von Cell-ACDC geladen wurde (links), Beispiel-Z-Schichten mit roten Konturen, die die Segmentierungsmasken hervorheben (Mitte), und Histogramm der Zellvolumenverteilung, berechnet aus den 3D-Segmentierungsmasken (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Quantifizierung von Zeitraffer-Mikroskopie-Daten. (A) Screenshot von Zeitraffer-Mikroskopiedaten von knospenden Hefezellen, die in die GUI des dritten Moduls von Cell-ACDC geladen wurden (links), und Quantifizierung der Histon-H2B-Proteinmenge über die Zeit in einem repräsentativen Zellzyklus (rechts). Die vergrößerten Bilder zeigen die Beispielzelle und ihre Knospe (weiße Pfeile) zu Beginn des Zellzyklus (i), beim Knospenaufgang (ii) und bei der Kernteilung (iii). Die Daten stammen von Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Screenshot von Zeitraffermikroskopiedaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die in das dritte Modul geladen wurden, GUI von Cell-ACDC (links) und Zellfläche (μm²), aufgetragen als Funktion der Zeit einer repräsentativen Zelle, die sich in der Zellteilung befindet. Die vergrößerten Bilder zeigen die Beispielzelle und ihre Tochterzellen bei maximaler Zellfläche vor der Teilung (i), der Teilung in zwei Tochterzellen (ii) und dem letzten analysierten Frame nach der Teilung (iii). Die Daten stammen von Zargari et ^al.22,33. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Analyse von mehrdimensionalen Mikroskopiedaten erfordert oft den Einsatz modernster KI-gesteuerter Modelle. Diese Tools werden jedoch schnell entwickelt und stellen eine erhebliche Einstiegshürde für die Einführung dar. Darüber hinaus benötigen Biologen oft eine Visualisierung des Ergebnisses, um eine effektive Fehlerkorrektur zu ermöglichen. Hier wird gezeigt, wie Wissenschaftler Cell-ACDC nutzen können, um diese Herausforderungen zu bewältigen.

Ein kritischer Schritt des vorgestellten Protokolls ist die Auswahl des optimalen Segmentierungsmodells. Cell-ACDC enthält eine grafische Benutzeroberfläche, die eine visuelle Auswahl ermöglicht (Abbildung 1A, Modul "Visualisieren und korrigieren"). Tools zum Vorbereiten von Daten und zur Stapelverarbeitung mehrerer Datensätze werden ebenfalls bereitgestellt (Abbildung 1A, Erstellen einer Datenstruktur, Datenvorverarbeitung, Segment- und Track-Module sowie Dienstprogramme). Benutzer werden ermutigt, Probleme zu melden und Feedback im image.sc-Forum zu geben (unter Verwendung des Tags #cell-acdc) oder indem sie ein Problem auf der GitHub-Seite von Cell-ACDC öffnen.

Während Cell-ACDC bereits für relativ große Daten verwendet wurde, wie z. B. für Sphäroide in Bildern mit Tausenden von Kernen⁹ oder Zeitrafferdaten von knospenden Hefen mit Hunderten von Zellen pro Frame, muss das Programm die gesamten Einkanaldaten in den RAM laden, um korrekt zu funktionieren. Es wird empfohlen, etwa die dreifache Größe der Bilddatei im verfügbaren Speicher zu verwenden, um eine stabile Leistung zu gewährleisten. Derzeit können Datensätze, die den verfügbaren Systemspeicher übersteigen, nicht verarbeitet werden, aber die Unterstützung von Out-of-Core-Laden (Lazy) ist durch die Integration von OME-Zarr³⁷ geplant.

Derzeit ist eine der Haupteinschränkungen von Cell-ACDC die teilweise Unterstützung von 3D+Zeit-Datensätzen, da die meisten Werkzeuge entweder für 3D-Z-Stack- oder 2D+Zeit-Daten entwickelt wurden. Daher werden zukünftige Versionen von Cell-ACDC seine Fähigkeiten um volle Unterstützung für 3D+Zeitdaten erweitern. Darüber hinaus arbeiten wir an der Erweiterung des Annotationsrahmens für Zellstammbäume für "symmetrisch" teilende Zellen (z.B. Säugetierzellen), d.h. Zellen, bei denen sich die Mutterzelle in zwei Tochterzellen teilt (im Gegensatz zur knospenden Hefe, bei der die Mutterzelle, einmal pro Zellzyklus, durch Knospung eine einzige Tochterzelle hervorbringt). Schließlich ist Cell-ACDC ab sofort auf Daten beschränkt, deren Einkanaldaten vollständig in den RAM passen. Daher planen wir, Lazy Loading wie oben erwähnt zu implementieren.

Seit seiner Veröffentlichung wurde Cell-ACDC ständig verbessert, z. B. durch das Hinzufügen neuer Segmentierungs- und Tracking-Modelle, neuer Annotations-Frameworks (z. B. für Säugetierzellen, die sich derzeit in der Beta-Testphase befinden) und verschiedener Leistungsverbesserungen. Dank dieser Entwicklungen konnten Wissenschaftler Cell-ACDC einsetzen, um die Forschung zu beschleunigen und wissenschaftliche Entdeckungen zu ermöglichen 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. Was dieses Software-Framework im Vergleich zu bestehenden Methoden^{einzigartig macht} 14,27,50,51 ist seine Fähigkeit, bestehende Modelle zu nutzen und zu ergänzen und somit von den Entwicklungen der Community zu profitieren. Die kontinuierliche Weiterentwicklung von Cell-ACDC wird aktiv vorangetrieben, um es als Referenzrahmen für die Analyse mehrdimensionaler Mikroskopiedaten zu etablieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BABY	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	Segmentierungs- und Tracking-Software, optional erhältlich, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Bayesscher Tracker	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	Tracking-Software, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Zell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Software
Cellpose-Keimbahnkerne	Cristina Piñ eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGY.001062	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Cellpose Version 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Cellpose Version 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Cellpose Version 4 (Cellpose-SAM)	Marius  Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Computer	-	-	Siehe unten empfohlene Spezifikationen
Computer – CPU	Jegliche	-	Empfohlene Mindestzahl von 4 Kernen, 2,5 GHz & Nbsp;
Computer – GPU	Nvidia (bevorzugt)	-	(Optional) Empfohlenes Minimum von 8 GB VRAM
Computer – Festplattenspeicher	Jegliche	-	4GB + 3 x Mikroskopie-Dateigröße
Computer – Betriebssystem	Microsoft, Apple, andere	-	Windows, MacOS und Linux werden unterstützt
Computer – RAM	Jegliche	-	3x Dateigröße einer einzelnen Position, mindestens 16 GB
DeepSea	Abolfazl  Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Segmentierungs- und Tracking-Software, optional erhältlich, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
DeLTA	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Segmentierungs- und Tracking-Software, optional erhältlich, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Miniforge	Conda-Forge	-	Link zum Download des Installationsprogramms von der Miniforge-Website: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
SAM (Segment Anything Model)	Alexander Kirillov	10.48550/arXiv.2304.02643	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
TAPIR	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	Tracking-Software, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Tracking-Software, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	Tracking-Software, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
YeastMate	David Bunk	10.1093/Bioinformatik/btac107	Segmentierungssoftware, optional, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden
YeaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	Segmentierungs- und Tracking-Software, optional erhältlich, kann automatisch mit Cell-ACDC installiert werden