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Methodenartikel

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

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DOI:

10.3791/68956

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31. Oktober 2025

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1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

Zusammenfassung

Die Kalzium-Bildgebung ist entscheidend für die Untersuchung der neuronalen Dynamik und der Gehirnfunktion. Die derzeitigen Methoden zur Bildgebung von Kalzium in Drosophila-Larven sind jedoch aufgrund von Bewegungsartefakten und dem Bedarf an spezieller Ausrüstung schwierig. Hier stellen wir eine praktische, kostengünstige Methode zur Durchführung von In-vivo - und Ex-vivo-Calcium-Bildgebung bei Drosophila-Larven im dritten Stadium vor, bei der ein topischer Gewebeklebstoff zur Immobilisierung von Proben verwendet wird. Wir bieten auch benutzerdefinierte R-Skripte und ein Framework für die Datenanalyse an, das die Messung von Kalziumveränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erleichtert. Mit diesem Ansatz haben wir erfolgreich Kalziumtransienten in einem Paar larvaler ZNS-Neuronen mit minimalen Bewegungsartefakten aufgezeichnet, was die Reproduzierbarkeit über Präparate hinweg zeigt. Die Methode ist kompatibel mit konfokalen Standard-Spinning-Disk-Systemen und kann für DIY- oder kommerzielle Zwei-Photonen-Setups angepasst werden, wodurch sie für Labore mit unterschiedlichen Ressourcen zugänglich ist. Dieser Ansatz kann den Zugang zu bildgebenden Larven-Calcium-Studien verbessern und kann angepasst werden, um die Auswirkungen sowohl externer Reize, wie z. B. Gerüche, als auch interner Reize, wie Neuromodulatoren, zu untersuchen.

Einleitung

Das Verständnis der Kalziumdynamik in Neuronen ist entscheidend, um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, die der neuronalen Signalübertragung und der Gehirnfunktion zugrunde liegen, da Kalziumionen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen Aktivität und der Steuerung der zellulären Reaktionen auf Reize spielen. Die neuronale Kalziumdynamik kann über Kalzium-Bildgebung überwacht werden, die Echtzeit-Einblicke in die Kalzium-vermittelte Signalübertragung bei einer Vielzahl von Organismen, einschließlich der Drosophila-Larve, bietet. Die Drosophila-Larve entwickelt sich zu einem leistungsfähigen Modellsystem zur Untersuchung der Schaltkreisfunktion, die dem Verhalten zugrunde liegt. Es ist einer von nur drei Organismen, für die ein vollständiges synaptisch aufgelöstes Konnektom des Gehirns erzeugt wurde1. Die Larve ist für eine Reihe hochentwickelter Werkzeuge zugänglich, die die Bildgebung und Manipulation von Neuronen sowohl auf der Ebene des gesamten Gehirns als auch auf der Ebene einzelner Neuronen ermöglichen 2,3.

Die Fähigkeit, die Kalziumdynamik in Neuronen von Drosophila-Larven mittels Kalziumbildgebung zu messen, war entscheidend für die Weiterentwicklung der neurowissenschaftlichen Forschung4. Jüngste Fortschritte in der Kalziumbildgebung haben es ermöglicht, die Kalziumdynamik auf der Ebene einzelner Synapsen in der Larve5 bis hin zu multineuronalen Aufzeichnungen in frei beweglichen Larvenzu messen 6. Die Calcium-Bildgebung kann in vivo durchgeführt werden, wobei Calcium-Ereignisse unter natürlichen physiologischen Kontexten der gesamten Larve erfasst werden 4,7,8,9, oder ex vivo, wobei Calcium-Ereignisse in präpariertem Larvengewebe aufgezeichnet werden, das unter simulierten physiologischen Bedingungen konserviert wurde 10. Insgesamt haben die Forscher verschiedene Iterationen der Kalzium-Bildgebungsmethode in Drosophila-Larven verwendet, um grundlegende Mechanismen der neuronalen Schaltkreise, Empfindungen, Lernen und Gedächtnis sowie des Verhaltens aufzudecken 8,11,12,13,14,15,16,17 . Bildgebungsstudien an Larvenkalzium sind jedoch begrenzt, da spezielle Geräte erforderlich sind und Probleme bei der Dateninterpretation aufgrund von Bewegungsartefakten auftreten.

Hier stellen wir eine kostengünstige und einfach zu implementierende Methodik für die In-vivo- und Ex-vivo-Calcium-Bildgebung bei Drosophila melanogaster-Larven im dritten Stadium vor. Wir bilden die Kalziumdynamik in Keystone-LN, einem inhibitorischen olfaktorischen SchaltkreisNeuron 18, 19, in ganzen Larvenpräparaten ab, um in vivo Kalziumbildgebung zu demonstrieren, und in präparierten Larvengehirnen, um ex vivo Kalziumbildgebung zu demonstrieren. Ganze Larven und präparierte Gehirne bleiben unter unseren Bildgebungsbedingungen etwa 10-15 Minuten lang lebensfähig und reaktionsfähig, was die Erfassung mehrerer Stimulusversuche pro Probe ermöglicht. Um die Herausforderung zu bewältigen, ganze Larven oder Gewebeproben zu immobilisieren und gleichzeitig die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten und die experimentelle Variabilität zu reduzieren, haben wir die Verwendung von GLUture, einem biokompatiblen topischen Cyanacrylat-Gewebeklebstoff, optimiert.

Im Vergleich zu herkömmlichen Immobilisierungsmethoden der Larven, wie z. B. Agarose-Einbettung oder Pinning, reduziert dieser klebstoffbasierte Ansatz Bewegungsartefakte bei gleichzeitiger Erhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes20,21; Im Vergleich zu Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen senkt der Spinning-Disk-Aufbau die Instrumentierungskosten und verbessert die Zugänglichkeit für Labore mit begrenzten Ressourcen. Abschließend beschreiben wir einfache bildgebende Ansätze, gekoppelt mit eigens entwickelten R-Skripten für die Datenanalyse. Unser Ansatz kann den Zugang zu Larven-Calcium-Bildgebungsstudien verbessern und kann angepasst werden, um die Auswirkungen sowohl externer Reize, wie z.B. Gerüche, als auch interner Reize, wie Neuromodulatoren, zu untersuchen.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Drosophila-Larven des dritten Stadiums für die Kalziumbildgebung

  1. Halten Sie die Fliegen mit Standard-Fliegenfutter (siehe Materialtabelle) bei 25 °C, mit 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
  2. Um das rote fluoreszierende Protein (RFP) für die Neuronenidentifikation und GCaMP6f (Kalziumindikator) in den Neuronen von Interesse ('X') zu exprimieren, kreuzen Sie jungfräuliche Weibchen der X-Gal4-Linie mit Männchen, die UAS-GCaMP6f und UAS-tdTomato22 tragen.
    HINWEIS: Für diese Studie wurde die Keystone-Gal4-Linie verwendet, um die Expression von tdTomato und GCaMP6f in einem einzelnen Paar inhibitorischer lokaler Neuronen (Keystone-LNs) im Larvengehirn zu steuern 18,19.
  3. Nachdem sich männliche und weibliche Fliegen 48 Stunden lang paaren und Eier legen konnten, werden die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen umgefüllt.
  4. Extraktion der Larven des dritten Stadiums (ca. 120 Stunden nach der Eiablage), indem sie auf einer 15%igen Saccharoselösung schwimmen. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die schwimmenden Larven in ein 1.000-ml-Glasbecherglas zu übertragen.
  5. Waschen Sie die Larven 3-4x, indem Sie das Wasser im Becherglas jedes Mal durch 800 ml frisches destilliertes Wasser ersetzen. Lassen Sie die Larven 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Rest des Protokolls fortfahren.

2. Hungerprotokoll für Drosophila-Larven im dritten Stadium (wenn verhungerte vs. nicht verhungerte Bedingungen getestet werden)

  1. Bereiten Sie zwei Fütterungskammern vor, indem Sie ein kleines Quadrat Labortuch in 6 cm große Petrischalen geben. Für nicht verhungernde Bedingungen 350 μl 0,2 M Saccharoselösung hinzufügen; bei Hunger 350 μl destilliertes Wasser hinzufügen.
  2. Setzen Sie eine gleiche Anzahl gewaschener Larven in jede Futterkammer um. Lassen Sie die Larven 2 h lang bei Raumtemperatur mit Saccharose (nicht verhungert) oder destilliertem Wasser (ausgehungert) fressen.

3. In-vivo-Calcium-Bildgebung

HINWEIS: Alle Experimente mit dem Gewebekleber sollten unter Anwendung der üblichen Laborsicherheitspraktiken durchgeführt werden. Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille oder Gesichtsschutz, ist erforderlich. Baumwollhandschuhe sollten aufgrund exothermer Reaktionen mit Cyanacrylat vermieden werden. Vermeiden Sie den Kontakt des Klebstoffs mit Haut, Augen oder Schleimhäuten. Im Falle einer Hautverklebung den Bereich in warmem Seifenwasser einweichen und vorsichtig abtrennen; Bei Exposition der Augen ≥5 Minuten lang mit lauwarmem Wasser spülen und sofort einen Arzt aufsuchen. Der Klebstoff sollte von offenen Flammen und hoher Hitze ferngehalten werden, da ausgehärteter Klebstoff beim Verbrennen störende Dämpfe freisetzen kann. Bewahren Sie den Klebstoff bei ≤30 °C, geschützt vor Feuchtigkeit und direkter Sonneneinstrahlung, in einem dicht verschlossenen Behälter auf, wenn er nicht verwendet wird.

  1. Bereiten Sie den Calcium-Imaging-Puffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-Glucose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Die modifizierte Kochsalzlösung mit 110 mM NaCl ist eine weithin akzeptierte Formulierung für die ZNS-Dissektion und -Bildgebung von Larven und fällt in den typischen Bereich, der in elektrophysiologischen und bildgebenden Studien verwendet wird (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
  2. Erstellen Sie auf einem 24 x 50 mm (1,5 mm dicken) Mikroskop-Deckglas eine Vertiefung mit Vaseline, die aus einer Spritze abgegeben wird.
  3. Geben Sie einen kleinen Tropfen topischen Gewebekleber (60 % 2-Octyl- und 40 % n-Butylcyanacrylat) in die Mitte des Deckglases. Verteilen Sie den Kleber mit einem Glasstab gleichmäßig zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht.
  4. Übertragen Sie vorsichtig eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht auf den Kleber. Drücken Sie die Bauchseite der Larve vorsichtig auf den Kleber. Lassen Sie den Klebstoff trocknen und stellen Sie sicher, dass die Larve vollständig immobilisiert ist.
  5. Sobald die Larve immobilisiert ist, legen Sie das Deckglas auf den inversen Mikroskoptisch (Abbildung 1A).

4. Ex-vivo-Calcium-Bildgebung

  1. Bereiten Sie den Larvendissektionspuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-Glukose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
  2. Präparieren Sie die Hirnsektionen, wie sie von Ishimoto und Sano10 beschrieben werden. Übertragen Sie eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht kurz in eine 3,5 cm große Petrischale, auf deren Boden Silikonelastomer geschichtet ist.
  3. Positionieren Sie die Larve unter einem Präpariermikroskop mit der Bauchseite nach oben und lokalisieren Sie das Gehirn. Mache mit einer Präparierschere einen Schnitt etwa ein Drittel des Weges am vorderen Ende der Larve. Mache einen weiteren Schnitt an den Maulhaken. Schonen Sie das Gehirn, während Sie die Körper- und Mundhaken entfernen (adaptiert von Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identifizieren Sie die Ansammlung von Motoneuronen-haltigen Nerven aus dem Bauchmark. Ziehen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig vom Rest der sezierten Larve weg. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe aus dem Gehirn ab.
    HINWEIS: Sanfter Umgang mit übermäßiger Kraft kann zu Gewebeschäden führen, da das Gehirn zerbrechlich ist.
  5. Bereiten Sie ein Mikroskop-Deckglas mit dem Gewebekleber für die Kalziumbildgebung vor, wie in den Schritten 3.2 bis 3.3 beschrieben.
  6. Aspirieren Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit einer P10-Mikropipette mit 5 μl Dissektionslösung aus der Petrischale. Stoße das Gehirn langsam auf den Klebstoff aus. Bevor der Kleber trocknet, richten Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben aus (mit den beiden Hirnlappen nach unten und dem dorsalen Bauchmark nach oben).
  7. Mit einer P200-Mikropipette 100 μl des Calcium-Imaging-Puffers über das immobilisierte Larvengehirn auf das Deckglas übertragen.
  8. Platzieren Sie das Deckglas mit dem Gehirn auf dem inversen Mikroskop, das mit einem konfokalen Spinning-Disk-Scannermodul und einer CCD-Kamera für die Kalziumbildgebung verbunden ist (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Achten Sie bei Ex-vivo-Präparaten darauf, das Gehirn richtig auszurichten, während der Kleber noch feucht ist. Für eine optimale Bildqualität positionieren Sie das Gehirn so, dass der ROI dem Mikroskopobjektiv am nächsten ist, und vermeiden Sie es, überschüssigen Klebstoff in der Nähe des ROI aufzutragen.

5. Bildgebungsprotokoll

  1. Öffnen Sie die Software für die Kalziumbildgebung mit dem konfokalen Mikroskop. Aufnahme von Bildern mit einem 10x/1,4 NA-Objektiv mit Filterumschaltung zwischen GFP-Laser (Anregung 488 nm, Intensität 70 %, Emission 525 nm/50 m, OD8) und RFP-Laser (Anregung 561 nm, Intensität 50 %, Emission 610 nm/75 m, OD8). Stellen Sie die Belichtung zwischen 100 ms und 1.000 ms ein, die Verstärkung auf 50 % des entsprechenden Belichtungswerts und einen Binning-Faktor von 2 während der Bildaufnahme.
  2. Stellen Sie das Mikroskop auf 10-fache Vergrößerung ein und positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung.
  3. Identifizieren Sie das interessierende Neuron, indem Sie mit dem RFP-Laser (Anregung auf 561 nm eingestellt) nach dem tdTomato-Signal suchen.
    HINWEIS: Wählen Sie Sättigung und Gamma reduzieren, um den richtigen Belichtungswert einzustellen.
  4. Sobald die Region of Interest (ROI) identifiziert ist, wechseln Sie zum GFP-Laser (Anregung auf 488 nm), um GCaMP6f-Signale zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass sowohl tdTomato- als auch GCaMP-Signale kolokalisiert sind, bevor Sie Stack-Images beider Kanäle aufnehmen.
    HINWEIS: Passen Sie die Bildeinstellungen für tdTomato- und GCaMP6f-Stack-Aufnahmen an, um die Fluoreszenz zu maximieren.
  5. Erfassen Sie zwei separate Zeitreihenaufzeichnungen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten).
    HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale.
  6. Sobald die Probe für die Abbildung bereit ist, nehmen Sie zwei separate Zeitreihenaufnahmen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten) auf.
    HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale.
    HINWEIS: Bei der Durchführung quantitativer Analysen empfehlen wir, die Laserleistung zu erhöhen und die Belichtungsverstärkung des Detektors nach Bedarf anzupassen, während die lineare Intensitätsskalierung beibehalten wird.

6. Datenverarbeitung und -analyse

  1. Öffnen und importieren Sie die Signalstacks tdTomato und GCaMP6f in ImageJ (NIH)28.
  2. Um den korrekten Region of Interest (ROI) zu identifizieren, führen Sie die Signale tdTomato und GCaMP6f zusammen, um die Kolokalisierung zu bestätigen. Teilen Sie nach der Überprüfung die Kanäle tdTomato und GCaMP6f auf.
  3. Wählen Sie im oberen Menü Plugins | Neu, und klicken Sie auf Makros , um ein neues Makro zu starten. Importieren Sie als Nächstes die benutzerdefinierten ROI-basierten Makros in ImageJ. Wählen Sie den GCaMP6f-Stack aus und klicken Sie auf Ausführen für die Kalziumanalyse.
  4. Verarbeiten Sie die Fluoreszenzsignale mit einem benutzerdefinierten ImageJ-Makro (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). Das Makro generiert zunächst Projektionen mit maximaler Intensität, führt eine Bewegungskorrektur mit dem StackReg-Plug-in (Rigid-Registrierungsmodus )29 durch und wendet die Bleichkorrektur an.
  5. Es erscheint ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, den ROI manuell auszuwählen, sodass Benutzer manuell einen umfassenden ROI erstellen können. Klicken Sie auf OK , um die Analyse fortzusetzen. Um eine Bewegungskorrektur durchzuführen, stellen Sie sicher, dass das rechteckige Feld den gesamten ROI in allen Frames abdeckt, um eine genaue Bewegungskorrektur zu gewährleisten, während die lokale räumliche und ROI-Form über Frames hinweg beibehalten wird.
    HINWEIS: Die Aufzeichnungen wurden in ImageJ mit StackReg registriert. Wenn die Bewegung in der Ebene groß war (kumulative XY-Verschiebung > 1 μM) oder die axiale Z-Drift zu einem Fokusverlust führte, wurde die Registrierung unzuverlässig oder die Probe ging vollständig aus dem Bildgebungsfenster verloren. So wurden Proben, die extreme Drift oder abnehmende Kalziumsignale (>30%) aufwiesen, automatisch markiert und von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen, um genaue Messungen der neuronalen Aktivität zu gewährleisten. Diese Schwellenwerte stimmen mit den allgemein angewandten Qualitätskontrollpraktiken in Calcium-Bildgebungsstudien überein 30,31,32,33. Der Ausschluss stellte auch sicher, dass nur stabile Aufzeichnungen mit zuverlässigen stimulusgebundenen Kalziumtransienten für die Analysen verwendet wurden.
  6. Extrahieren Sie für die Analyse Fluoreszenzspuren aus manuell definierten zirkulären ROIs, die durch Pixel-Autokorrelation geleitet werden. Diese ROIs werden das gesamte Schlüsselneuronenfeld umfassen.
    1. Extrahieren Sie die rohen Fluoreszenzintensitätsdaten für zwei Fluorophore: GCaMP6f/GFP und tdTomato/RFP, mit benutzerdefinierten Makros in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, siehe Materialtabelle).
    2. Wenden Sie ein Schiebefenster mit einem ROI von 20 x 20 Pixeln und einer Schrittweite von 10 Pixeln über das gesamte Sichtfeld an. Für jeden ROI berechnet das Makro: (1) die Intensität über alle Frames, (2) die Baseline-Fluktuationsdifferenz (d. h. die Differenz zwischen den maximalen und minimalen Intensitätswerten während der ersten 10 Frames) und (3) die maximale Intensitätsänderung von Frame zu Frame (ΔF). ROIs, die Intensitätsschwankungen von weniger als 10 Einheiten aufweisen, werden eliminiert, und nur die schärfsten ΔF-Werte werden für die weitere Analyse ausgewählt.
    3. Normalisieren Sie die Fluoreszenzspuren mit den folgenden Methoden:
      1. Fmax- und Fmin-Normalisierung: Berechnen Sie das normalisierte Δ mit der Formel:
        figure-protocol-1
        Dabei ist F die Rohfluoreszenz zu jedem Zeitpunkt, Fmin die minimale Fluoreszenz (Basislinie) und Fmax die maximale Fluoreszenz während der Aufnahme.
      2. ΔF/F 0-Normalisierung: Führen Sie zusätzlich eine ΔF/Fo-Normalisierung durch, wobei Fo (Grundlinie) durch die ersten 10 Bilder jeder Aufnahme bestimmt wird, indem Sie die Formel verwenden:
        figure-protocol-2
        Dabei ist Ft die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F0 der Ausgangswert, der aus den ersten 10 Bildern berechnet wird.
  7. Nachdem Sie GCaMP6f-Signale extrahiert haben, klicken Sie mit der linken Maustaste und wählen Sie Alle, Ausschneiden und Einfügen , um alle Werte in eine neue Excel-Tabelle zu übertragen. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Daten | Text in Spalten. Ein Popup-Fenster des Assistenten "Text-to-Column" wird angezeigt. Wählen Sie in Schritt 1 Trennzeichen aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 2 unter Trennzeichen die Option Tabulator und Komma aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 3 Fertig stellen aus.
    OPTIONAL: Um die normalisierten Kalziumsignale darzustellen, markieren Sie Fnorm_FminFmax und wählen Sie Streudiagramm aus.
  8. Suchen Sie nach einer generierten .csv Datei, die Folgendes enthält: (1) die Rohfluoreszenzwerte F, (2) ΔF/Fo und (3) Fnorm (normalisierte Fluoreszenzintensität). Organisieren Sie den endgültigen Datensatz in vier Spalten: (1) Zeit (Frames), (2) Stichprobenbedingung (ausgehungert oder gefüttert), (3) Replikat-ID (einzelne Stichprobe) und (4) normalisierte Intensität (Fnorm-Werte skaliert von 0 bis 1).
  9. Führen Sie abschließend eine Datenanalyse und -visualisierung in R mit benutzerdefinierten R-Skripts durch (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. siehe Materialtabelle).
    1. Importieren Sie das benutzerdefinierte R-Skript in ein neues R-Projekt. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen R-Pakete, einschließlich ggplot2, dplyr und readr, installiert und aktualisiert werden, bevor Sie die Analyse ausführen.
    2. Beginnend mit Zeile 1 des benutzerdefinierten R-Skripts klicken Sie auf Kontinuierlich ausführen , um die Kalziumanalyse durchzuführen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Ausgabe Heatmaps enthält, die die normalisierte Kalziumintensität für die ersten 30 Frames, 60 Frames und alle Frames der Zeitreihenaufzeichnung veranschaulichen, sowie Boxplots, um den Median der normalisierten Intensitäten anzuzeigen.
    3. Beurteilen Sie die Signifikanz der normalisierten Kalziumintensität mit dem Mann-Whitney U-Test .

7. Abfallentsorgung und Dekontamination

  1. Entfernen Sie nach den Experimenten grobe Ablagerungen von Werkzeugen und Oberflächen unter fließendem Wasser und desinfizieren Sie sie dann mit 70 % Ethanol oder 10 % Bleichmittel, gefolgt von sterilem Wasser. Arbeiten Sie auf einer desinfizierten Oberfläche und waschen Sie sich die Hände, nachdem Sie die Handschuhe ausgezogen haben. Essen und trinken Sie nicht im Labor.
  2. Legen Sie Larvengewebe und kontaminierte Einwegartikel vor der Entsorgung in Biohazard-Beutel und autoklavieren Sie sie.
  3. Entsorgen Sie vollständig ausgehärtete Klebstoffabfälle im allgemeinen Müll; Nicht ausgehärteter Klebstoff und kontaminierte Einwegartikel müssen in einem verschlossenen, gekennzeichneten Behälter für gefährliche chemische Abfälle gesammelt werden.
  4. Legen Sie alle scharfen Gegenstände (Klingen, Nadeln, Glasscherben) in einen durchstichsicheren Behälter für scharfe Gegenstände.
  5. Sammeln Sie brennbare Lösungsmittel (Ethanol, Aceton) in gekennzeichneten, brennbaren Abfallbehältern.

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Ergebnisse

Um unseren Ansatz zur Bildgebung von Larvenkalzium zu demonstrieren, haben wir ihn erfolgreich sowohl auf in-vivo- als auch auf ex-vivo-Präparate der Drosophila-Larven angewendet (Abbildung 2 und Abbildung 3, Video 1, Video 2, Video 3 und Video 4). Wir haben die Calciumdynamik in Drosophila-Larven im dritten Stadium gemessen, die GCaMP6f und Td-Tomate exprimieren, in einem ein...

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Diskussion

Hier beschreiben wir einen Ansatz für die in-vivo - und ex-vivo-Calciumbildgebung bei Drosophila melanogaster-Larven im dritten Stadium. Wir bildeten die Kalziumdynamik in Keystone-LN, einem inhibitorischen lokalen Neuron in der Drosophila-Larve , ab. Wir maßen die Keystone-LN-Calciumdynamik in ganzen Larvenpräparaten (in vivo) und in präparierten Präparaten des Larvengehirns (ex vivo) (Abbildung 1).

...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Jeffrey Harper, der uns das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop seines Labors für diese Experimente zur Verfügung gestellt hat. Wir sind dankbar für das Geschenk der Fliegenschnur: w; UAS-GCaMP6f/CyO, weinen; UAS-tdTomate von Dr. Jung Hwan Kim. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Science Foundation unter den Fördernummern 2341202 und 2129234 unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fliegenbestände & Instandhaltung
Nutrifly-FliegenfutterGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoGeschenk von Dr. JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Reagenzien für Hunger-Protokoll
6 cm PetrischaleGenesee Scientific32-106G
SaccharoseMillipore SigmaS0389-500G
Reagenzien für Bildgebungs- und Dissektionspuffer
CalciumchloridJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-GlukoseThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-EthanesulfonsäureJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
MagnesiumchloridVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
KaliumchloridThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
NatriumchloridEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Werkzeuge und Reagenzien für die Sektion
DissektionspufferIm Text bereitgestellte Komposition
Olympus Petrischalen, 60 x 15 mm belüftetGenesee Scientific32-105
Sylgard 184 ElastomerbasisElektronenmikroskopiewissenschaften24236-10A
Sylgard 184 Elastomer-BasenhärtemittelElektronenmikroskopiewissenschaften24236-10B
Pinzette Stil 5, EMSElektronenmikroskopiewissenschaften78320-5
Vannas Spring Scissors – 3mm SchneidkanteFeine wissenschaftliche Werkzeuge15000-00
Bildgebende und Montagegeräte/Reagenzien
Konfokal-Scanner-ModulYokogawaCSU-W1Verbindung zum Mikroskop
BildgebungspufferIm Text bereitgestellte Komposition
Invertiertes MikroskopLeica MicrosystemsDMi8 Angeschlossen an ein rotierendes Scheiben-Konfokalscanner-Modul und eine CCD-Kamera
Mikroskopabdeckungsglas, 24 mm x 50 mm, # 1,5 DickeGlobe Scientific Inc.1415-15
MWI Veterinär-GLUTURE-Topischer KlebstoffFisher ScientificNC0632797
Reine VaselineWalgreens912556
Links zu öffentlich zugänglichen Ressourcen
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Janelia Flylight Protokoll-Videohttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Referenzen

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

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