In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Das Verständnis der Kalziumdynamik in Neuronen ist entscheidend, um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, die der neuronalen Signalübertragung und der Gehirnfunktion zugrunde liegen, da Kalziumionen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen Aktivität und der Steuerung der zellulären Reaktionen auf Reize spielen. Die neuronale Kalziumdynamik kann über Kalzium-Bildgebung überwacht werden, die Echtzeit-Einblicke in die Kalzium-vermittelte Signalübertragung bei einer Vielzahl von Organismen, einschließlich der Drosophila-Larve, bietet. Die Drosophila-Larve entwickelt sich zu einem leistungsfähigen Modellsystem zur Untersuchung der Schaltkreisfunktion, die dem Verhalten zugrunde liegt. Es ist einer von nur drei Organismen, für die ein vollständiges synaptisch aufgelöstes Konnektom des Gehirns erzeugt wurde¹. Die Larve ist für eine Reihe hochentwickelter Werkzeuge zugänglich, die die Bildgebung und Manipulation von Neuronen sowohl auf der Ebene des gesamten Gehirns als auch auf der Ebene einzelner Neuronen ermöglichen ^2,3.

Die Fähigkeit, die Kalziumdynamik in Neuronen von Drosophila-Larven mittels Kalziumbildgebung zu messen, war entscheidend für die Weiterentwicklung der neurowissenschaftlichen Forschung⁴. Jüngste Fortschritte in der Kalziumbildgebung haben es ermöglicht, die Kalziumdynamik auf der Ebene einzelner Synapsen in der Larve⁵ bis hin zu multineuronalen Aufzeichnungen in frei beweglichen Larven^{zu messen 6}. Die Calcium-Bildgebung kann in vivo durchgeführt werden, wobei Calcium-Ereignisse unter natürlichen physiologischen Kontexten der gesamten Larve erfasst werden 4,7,8,9, oder ex vivo, wobei Calcium-Ereignisse in präpariertem Larvengewebe aufgezeichnet werden, das unter simulierten physiologischen Bedingungen konserviert wurde ¹⁰. Insgesamt haben die Forscher verschiedene Iterationen der Kalzium-Bildgebungsmethode in Drosophila-Larven verwendet, um grundlegende Mechanismen der neuronalen Schaltkreise, Empfindungen, Lernen und Gedächtnis sowie des Verhaltens aufzudecken 8,11,12,13,14,15,16,17 . Bildgebungsstudien an Larvenkalzium sind jedoch begrenzt, da spezielle Geräte erforderlich sind und Probleme bei der Dateninterpretation aufgrund von Bewegungsartefakten auftreten.

Hier stellen wir eine kostengünstige und einfach zu implementierende Methodik für die In-vivo- und Ex-vivo-Calcium-Bildgebung bei Drosophila melanogaster-Larven im dritten Stadium vor. Wir bilden die Kalziumdynamik in Keystone-LN, einem inhibitorischen olfaktorischen Schaltkreis^{Neuron 18, 19}, in ganzen Larvenpräparaten ab, um in vivo Kalziumbildgebung zu demonstrieren, und in präparierten Larvengehirnen, um ex vivo Kalziumbildgebung zu demonstrieren. Ganze Larven und präparierte Gehirne bleiben unter unseren Bildgebungsbedingungen etwa 10-15 Minuten lang lebensfähig und reaktionsfähig, was die Erfassung mehrerer Stimulusversuche pro Probe ermöglicht. Um die Herausforderung zu bewältigen, ganze Larven oder Gewebeproben zu immobilisieren und gleichzeitig die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten und die experimentelle Variabilität zu reduzieren, haben wir die Verwendung von GLUture, einem biokompatiblen topischen Cyanacrylat-Gewebeklebstoff, optimiert.

Im Vergleich zu herkömmlichen Immobilisierungsmethoden der Larven, wie z. B. Agarose-Einbettung oder Pinning, reduziert dieser klebstoffbasierte Ansatz Bewegungsartefakte bei gleichzeitiger Erhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes^20,21; Im Vergleich zu Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen senkt der Spinning-Disk-Aufbau die Instrumentierungskosten und verbessert die Zugänglichkeit für Labore mit begrenzten Ressourcen. Abschließend beschreiben wir einfache bildgebende Ansätze, gekoppelt mit eigens entwickelten R-Skripten für die Datenanalyse. Unser Ansatz kann den Zugang zu Larven-Calcium-Bildgebungsstudien verbessern und kann angepasst werden, um die Auswirkungen sowohl externer Reize, wie z.B. Gerüche, als auch interner Reize, wie Neuromodulatoren, zu untersuchen.

1. Vorbereitung von Drosophila-Larven des dritten Stadiums für die Kalziumbildgebung

1. Halten Sie die Fliegen mit Standard-Fliegenfutter (siehe Materialtabelle) bei 25 °C, mit 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
2. Um das rote fluoreszierende Protein (RFP) für die Neuronenidentifikation und GCaMP6f (Kalziumindikator) in den Neuronen von Interesse ('X') zu exprimieren, kreuzen Sie jungfräuliche Weibchen der X-Gal4-Linie mit Männchen, die UAS-GCaMP6f und UAS-tdTomato²² tragen.
   HINWEIS: Für diese Studie wurde die Keystone-Gal4-Linie verwendet, um die Expression von tdTomato und GCaMP6f in einem einzelnen Paar inhibitorischer lokaler Neuronen (Keystone-LNs) im Larvengehirn zu steuern ^18,19.
3. Nachdem sich männliche und weibliche Fliegen 48 Stunden lang paaren und Eier legen konnten, werden die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen umgefüllt.
4. Extraktion der Larven des dritten Stadiums (ca. 120 Stunden nach der Eiablage), indem sie auf einer 15%igen Saccharoselösung schwimmen. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die schwimmenden Larven in ein 1.000-ml-Glasbecherglas zu übertragen.
5. Waschen Sie die Larven 3-4x, indem Sie das Wasser im Becherglas jedes Mal durch 800 ml frisches destilliertes Wasser ersetzen. Lassen Sie die Larven 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Rest des Protokolls fortfahren.

2. Hungerprotokoll für Drosophila-Larven im dritten Stadium (wenn verhungerte vs. nicht verhungerte Bedingungen getestet werden)

1. Bereiten Sie zwei Fütterungskammern vor, indem Sie ein kleines Quadrat Labortuch in 6 cm große Petrischalen geben. Für nicht verhungernde Bedingungen 350 μl 0,2 M Saccharoselösung hinzufügen; bei Hunger 350 μl destilliertes Wasser hinzufügen.
2. Setzen Sie eine gleiche Anzahl gewaschener Larven in jede Futterkammer um. Lassen Sie die Larven 2 h lang bei Raumtemperatur mit Saccharose (nicht verhungert) oder destilliertem Wasser (ausgehungert) fressen.

3. In-vivo-Calcium-Bildgebung

HINWEIS: Alle Experimente mit dem Gewebekleber sollten unter Anwendung der üblichen Laborsicherheitspraktiken durchgeführt werden. Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille oder Gesichtsschutz, ist erforderlich. Baumwollhandschuhe sollten aufgrund exothermer Reaktionen mit Cyanacrylat vermieden werden. Vermeiden Sie den Kontakt des Klebstoffs mit Haut, Augen oder Schleimhäuten. Im Falle einer Hautverklebung den Bereich in warmem Seifenwasser einweichen und vorsichtig abtrennen; Bei Exposition der Augen ≥5 Minuten lang mit lauwarmem Wasser spülen und sofort einen Arzt aufsuchen. Der Klebstoff sollte von offenen Flammen und hoher Hitze ferngehalten werden, da ausgehärteter Klebstoff beim Verbrennen störende Dämpfe freisetzen kann. Bewahren Sie den Klebstoff bei ≤30 °C, geschützt vor Feuchtigkeit und direkter Sonneneinstrahlung, in einem dicht verschlossenen Behälter auf, wenn er nicht verwendet wird.

1. Bereiten Sie den Calcium-Imaging-Puffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl₂ 1,2 mM, MgCl₂ 0,8 mM, D-Glucose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Die modifizierte Kochsalzlösung mit 110 mM NaCl ist eine weithin akzeptierte Formulierung für die ZNS-Dissektion und -Bildgebung von Larven und fällt in den typischen Bereich, der in elektrophysiologischen und bildgebenden Studien verwendet wird (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
2. Erstellen Sie auf einem 24 x 50 mm (1,5 mm dicken) Mikroskop-Deckglas eine Vertiefung mit Vaseline, die aus einer Spritze abgegeben wird.
3. Geben Sie einen kleinen Tropfen topischen Gewebekleber (60 % 2-Octyl- und 40 % n-Butylcyanacrylat) in die Mitte des Deckglases. Verteilen Sie den Kleber mit einem Glasstab gleichmäßig zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht.
4. Übertragen Sie vorsichtig eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht auf den Kleber. Drücken Sie die Bauchseite der Larve vorsichtig auf den Kleber. Lassen Sie den Klebstoff trocknen und stellen Sie sicher, dass die Larve vollständig immobilisiert ist.
5. Sobald die Larve immobilisiert ist, legen Sie das Deckglas auf den inversen Mikroskoptisch (Abbildung 1A).

4. Ex-vivo-Calcium-Bildgebung

1. Bereiten Sie den Larvendissektionspuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl₂ 0,3 mM, MgCl₂ 0,8 mM, D-Glukose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
2. Präparieren Sie die Hirnsektionen, wie sie von Ishimoto und Sano¹⁰ beschrieben werden. Übertragen Sie eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht kurz in eine 3,5 cm große Petrischale, auf deren Boden Silikonelastomer geschichtet ist.
3. Positionieren Sie die Larve unter einem Präpariermikroskop mit der Bauchseite nach oben und lokalisieren Sie das Gehirn. Mache mit einer Präparierschere einen Schnitt etwa ein Drittel des Weges am vorderen Ende der Larve. Mache einen weiteren Schnitt an den Maulhaken. Schonen Sie das Gehirn, während Sie die Körper- und Mundhaken entfernen (adaptiert von Janelia Flylight Protocol²⁷).
4. Identifizieren Sie die Ansammlung von Motoneuronen-haltigen Nerven aus dem Bauchmark. Ziehen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig vom Rest der sezierten Larve weg. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe aus dem Gehirn ab.
   HINWEIS: Sanfter Umgang mit übermäßiger Kraft kann zu Gewebeschäden führen, da das Gehirn zerbrechlich ist.
5. Bereiten Sie ein Mikroskop-Deckglas mit dem Gewebekleber für die Kalziumbildgebung vor, wie in den Schritten 3.2 bis 3.3 beschrieben.
6. Aspirieren Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit einer P10-Mikropipette mit 5 μl Dissektionslösung aus der Petrischale. Stoße das Gehirn langsam auf den Klebstoff aus. Bevor der Kleber trocknet, richten Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben aus (mit den beiden Hirnlappen nach unten und dem dorsalen Bauchmark nach oben).
7. Mit einer P200-Mikropipette 100 μl des Calcium-Imaging-Puffers über das immobilisierte Larvengehirn auf das Deckglas übertragen.
8. Platzieren Sie das Deckglas mit dem Gehirn auf dem inversen Mikroskop, das mit einem konfokalen Spinning-Disk-Scannermodul und einer CCD-Kamera für die Kalziumbildgebung verbunden ist (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Achten Sie bei Ex-vivo-Präparaten darauf, das Gehirn richtig auszurichten, während der Kleber noch feucht ist. Für eine optimale Bildqualität positionieren Sie das Gehirn so, dass der ROI dem Mikroskopobjektiv am nächsten ist, und vermeiden Sie es, überschüssigen Klebstoff in der Nähe des ROI aufzutragen.

5. Bildgebungsprotokoll

1. Öffnen Sie die Software für die Kalziumbildgebung mit dem konfokalen Mikroskop. Aufnahme von Bildern mit einem 10x/1,4 NA-Objektiv mit Filterumschaltung zwischen GFP-Laser (Anregung 488 nm, Intensität 70 %, Emission 525 nm/50 m, OD8) und RFP-Laser (Anregung 561 nm, Intensität 50 %, Emission 610 nm/75 m, OD8). Stellen Sie die Belichtung zwischen 100 ms und 1.000 ms ein, die Verstärkung auf 50 % des entsprechenden Belichtungswerts und einen Binning-Faktor von 2 während der Bildaufnahme.
2. Stellen Sie das Mikroskop auf 10-fache Vergrößerung ein und positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung.
3. Identifizieren Sie das interessierende Neuron, indem Sie mit dem RFP-Laser (Anregung auf 561 nm eingestellt) nach dem tdTomato-Signal suchen.
   HINWEIS: Wählen Sie Sättigung und Gamma reduzieren, um den richtigen Belichtungswert einzustellen.
4. Sobald die Region of Interest (ROI) identifiziert ist, wechseln Sie zum GFP-Laser (Anregung auf 488 nm), um GCaMP6f-Signale zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass sowohl tdTomato- als auch GCaMP-Signale kolokalisiert sind, bevor Sie Stack-Images beider Kanäle aufnehmen.
   HINWEIS: Passen Sie die Bildeinstellungen für tdTomato- und GCaMP6f-Stack-Aufnahmen an, um die Fluoreszenz zu maximieren.
5. Erfassen Sie zwei separate Zeitreihenaufzeichnungen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten).
   HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale.
6. Sobald die Probe für die Abbildung bereit ist, nehmen Sie zwei separate Zeitreihenaufnahmen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten) auf.
   HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale.
   HINWEIS: Bei der Durchführung quantitativer Analysen empfehlen wir, die Laserleistung zu erhöhen und die Belichtungsverstärkung des Detektors nach Bedarf anzupassen, während die lineare Intensitätsskalierung beibehalten wird.

6. Datenverarbeitung und -analyse

1. Öffnen und importieren Sie die Signalstacks tdTomato und GCaMP6f in ImageJ (NIH)²⁸.
2. Um den korrekten Region of Interest (ROI) zu identifizieren, führen Sie die Signale tdTomato und GCaMP6f zusammen, um die Kolokalisierung zu bestätigen. Teilen Sie nach der Überprüfung die Kanäle tdTomato und GCaMP6f auf.
3. Wählen Sie im oberen Menü Plugins | Neu, und klicken Sie auf Makros , um ein neues Makro zu starten. Importieren Sie als Nächstes die benutzerdefinierten ROI-basierten Makros in ImageJ. Wählen Sie den GCaMP6f-Stack aus und klicken Sie auf Ausführen für die Kalziumanalyse.
4. Verarbeiten Sie die Fluoreszenzsignale mit einem benutzerdefinierten ImageJ-Makro (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). Das Makro generiert zunächst Projektionen mit maximaler Intensität, führt eine Bewegungskorrektur mit dem StackReg-Plug-in (Rigid-Registrierungsmodus )²⁹ durch und wendet die Bleichkorrektur an.
5. Es erscheint ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, den ROI manuell auszuwählen, sodass Benutzer manuell einen umfassenden ROI erstellen können. Klicken Sie auf OK , um die Analyse fortzusetzen. Um eine Bewegungskorrektur durchzuführen, stellen Sie sicher, dass das rechteckige Feld den gesamten ROI in allen Frames abdeckt, um eine genaue Bewegungskorrektur zu gewährleisten, während die lokale räumliche und ROI-Form über Frames hinweg beibehalten wird.
   HINWEIS: Die Aufzeichnungen wurden in ImageJ mit StackReg registriert. Wenn die Bewegung in der Ebene groß war (kumulative XY-Verschiebung > 1 μM) oder die axiale Z-Drift zu einem Fokusverlust führte, wurde die Registrierung unzuverlässig oder die Probe ging vollständig aus dem Bildgebungsfenster verloren. So wurden Proben, die extreme Drift oder abnehmende Kalziumsignale (>30%) aufwiesen, automatisch markiert und von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen, um genaue Messungen der neuronalen Aktivität zu gewährleisten. Diese Schwellenwerte stimmen mit den allgemein angewandten Qualitätskontrollpraktiken in Calcium-Bildgebungsstudien überein 30,31,32,33. Der Ausschluss stellte auch sicher, dass nur stabile Aufzeichnungen mit zuverlässigen stimulusgebundenen Kalziumtransienten für die Analysen verwendet wurden.
6. Extrahieren Sie für die Analyse Fluoreszenzspuren aus manuell definierten zirkulären ROIs, die durch Pixel-Autokorrelation geleitet werden. Diese ROIs werden das gesamte Schlüsselneuronenfeld umfassen.
   1. Extrahieren Sie die rohen Fluoreszenzintensitätsdaten für zwei Fluorophore: GCaMP6f/GFP und tdTomato/RFP, mit benutzerdefinierten Makros in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, siehe Materialtabelle).
   2. Wenden Sie ein Schiebefenster mit einem ROI von 20 x 20 Pixeln und einer Schrittweite von 10 Pixeln über das gesamte Sichtfeld an. Für jeden ROI berechnet das Makro: (1) die Intensität über alle Frames, (2) die Baseline-Fluktuationsdifferenz (d. h. die Differenz zwischen den maximalen und minimalen Intensitätswerten während der ersten 10 Frames) und (3) die maximale Intensitätsänderung von Frame zu Frame (ΔF). ROIs, die Intensitätsschwankungen von weniger als 10 Einheiten aufweisen, werden eliminiert, und nur die schärfsten ΔF-Werte werden für die weitere Analyse ausgewählt.
   3. Normalisieren Sie die Fluoreszenzspuren mit den folgenden Methoden:
      1. Fmax- und Fmin-Normalisierung: Berechnen Sie das normalisierte Δ mit der Formel:
         
         Dabei ist F die Rohfluoreszenz zu jedem Zeitpunkt, Fmin die minimale Fluoreszenz (Basislinie) und Fmax die maximale Fluoreszenz während der Aufnahme.
      2. ΔF/F _{0-Normalisierung}: Führen Sie zusätzlich eine ΔF/F_{o-Normalisierung} durch, wobei F_o (Grundlinie) durch die ersten 10 Bilder jeder Aufnahme bestimmt wird, indem Sie die Formel verwenden:
         
         Dabei ist F_t die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F₀ der Ausgangswert, der aus den ersten 10 Bildern berechnet wird.
7. Nachdem Sie GCaMP6f-Signale extrahiert haben, klicken Sie mit der linken Maustaste und wählen Sie Alle, Ausschneiden und Einfügen , um alle Werte in eine neue Excel-Tabelle zu übertragen. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Daten | Text in Spalten. Ein Popup-Fenster des Assistenten "Text-to-Column" wird angezeigt. Wählen Sie in Schritt 1 Trennzeichen aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 2 unter Trennzeichen die Option Tabulator und Komma aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 3 Fertig stellen aus.
   OPTIONAL: Um die normalisierten Kalziumsignale darzustellen, markieren Sie Fnorm_FminFmax und wählen Sie Streudiagramm aus.
8. Suchen Sie nach einer generierten .csv Datei, die Folgendes enthält: (1) die Rohfluoreszenzwerte F, (2) ΔF/F_o und (3) Fnorm (normalisierte Fluoreszenzintensität). Organisieren Sie den endgültigen Datensatz in vier Spalten: (1) Zeit (Frames), (2) Stichprobenbedingung (ausgehungert oder gefüttert), (3) Replikat-ID (einzelne Stichprobe) und (4) normalisierte Intensität (Fnorm-Werte skaliert von 0 bis 1).
9. Führen Sie abschließend eine Datenanalyse und -visualisierung in R mit benutzerdefinierten R-Skripts durch (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. siehe Materialtabelle).
   1. Importieren Sie das benutzerdefinierte R-Skript in ein neues R-Projekt. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen R-Pakete, einschließlich ggplot2, dplyr und readr, installiert und aktualisiert werden, bevor Sie die Analyse ausführen.
   2. Beginnend mit Zeile 1 des benutzerdefinierten R-Skripts klicken Sie auf Kontinuierlich ausführen , um die Kalziumanalyse durchzuführen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Ausgabe Heatmaps enthält, die die normalisierte Kalziumintensität für die ersten 30 Frames, 60 Frames und alle Frames der Zeitreihenaufzeichnung veranschaulichen, sowie Boxplots, um den Median der normalisierten Intensitäten anzuzeigen.
   3. Beurteilen Sie die Signifikanz der normalisierten Kalziumintensität mit dem Mann-Whitney U-Test .

7. Abfallentsorgung und Dekontamination

1. Entfernen Sie nach den Experimenten grobe Ablagerungen von Werkzeugen und Oberflächen unter fließendem Wasser und desinfizieren Sie sie dann mit 70 % Ethanol oder 10 % Bleichmittel, gefolgt von sterilem Wasser. Arbeiten Sie auf einer desinfizierten Oberfläche und waschen Sie sich die Hände, nachdem Sie die Handschuhe ausgezogen haben. Essen und trinken Sie nicht im Labor.
2. Legen Sie Larvengewebe und kontaminierte Einwegartikel vor der Entsorgung in Biohazard-Beutel und autoklavieren Sie sie.
3. Entsorgen Sie vollständig ausgehärtete Klebstoffabfälle im allgemeinen Müll; Nicht ausgehärteter Klebstoff und kontaminierte Einwegartikel müssen in einem verschlossenen, gekennzeichneten Behälter für gefährliche chemische Abfälle gesammelt werden.
4. Legen Sie alle scharfen Gegenstände (Klingen, Nadeln, Glasscherben) in einen durchstichsicheren Behälter für scharfe Gegenstände.
5. Sammeln Sie brennbare Lösungsmittel (Ethanol, Aceton) in gekennzeichneten, brennbaren Abfallbehältern.

Um unseren Ansatz zur Bildgebung von Larvenkalzium zu demonstrieren, haben wir ihn erfolgreich sowohl auf in-vivo- als auch auf ex-vivo-Präparate der Drosophila-Larven angewendet (Abbildung 2 und Abbildung 3, Video 1, Video 2, Video 3 und Video 4). Wir haben die Calciumdynamik in Drosophila-Larven im dritten Stadium gemessen, die GCaMP6f und Td-Tomate exprimieren, in einem einzigen Paar Keystone-LNs im Larvengehirn18,19. Um vergleichende Messungen zu demonstrieren, verglichen wir die Kalziumdynamik bei ausgehungerten und nicht verhungerten Larven.

Für unsere in-vivo-Präparate haben wir die Kalziumdynamik von Keystone-LNs in ganzen intakten Larven gemessen (Abbildung 2C und Abbildung 3A, Video 1 und Video 2). Für unsere ex-vivo-Präparate maßen wir die Kalziumdynamik von Keystone-LNs in Larvengehirnen, die von nicht verhungerten oder verhungerten Larven präpariert und im Bildgebungspuffer konserviert wurden (Abbildungen 2C und Abbildung 3B, Video 3 und Video 4). In beiden Präparaten beobachteten wir eine höhere Keystone-LN-Aktivität in Proben mit Hunger im Vergleich zu Proben ohne Hunger. Diese höhere Keystone-LN-Aktivität wurde deutlich in Heatmaps beobachtet, die zeitliche Darstellungen der Reaktionen über 60 s zeigten (Abbildung 3; Felder oben links und unten links) und in Boxplots, die durchschnittliche Signalintensitätswerte darstellten (Abbildung 3; Felder oben rechts und unten rechts, Mann-Whitney U-Test; **p < 0,001). Die analysierten Sammeldaten stammen aus mindestens fünf Studien, die unter jeder Bedingung durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse stimmen mit neueren Studien überein, die eine höhere olfaktorische Neuronenaktivität bei ausgehungerten Tieren zeigen34,35.

Abbildung 1: Schematische Darstellung von in-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebungsaufbauten. Die ganze Larvenprobe (A) oder die Larvenhirnprobe (B) wurde auf einer dünnen Schicht Gewebekleber (durchgehend blau) fixiert, die in einer Vertiefung aus Vaseline (braun) auf einem Mikroskop-Deckglas verteilt war. Die Proben wurden in Calcium-Imaging-Puffer (hellblau) getaucht und für die Bildgebung auf ein konfokales Mikroskop mit invertierter Spinning-Disc gelegt. Es wurden Zeitreihen-Kalziumfluoreszenzbilder der Proben aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: GCaMP6f-Fluoreszenzbildgebung. (A) Split-Bilder, die die Fluoreszenz im 488-nm-Kanal (GCaMP6f, grün) und im 525-nm-Kanal (tdTomato, rot) zeigen. Das zusammengeführte Bild wird im rechten Bereich angezeigt. (B) Beispiel für rohe Fluoreszenzspuren im Zeitverlauf für GCaMP6f (grün) und tdTomato (rot) in Keystone-LN. Schwankungen in der GCaMP6f-Fluoreszenz deuten auf die Kalziumaktivität hin, während das stabile tdTomato-Signal als Kontrolle zur Identifizierung von Keystone-LNs verwendet wird. (C) Repräsentative GCaMP6f-Signalbilder für in-vivo (obere Panels) und ex-vivo (untere Panels) Präparationen. Nicht verhungerte Proben sind auf der linken Seite und ausgehungerte Proben auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsleiste = 20 μm (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: GCaMP6f-Fluoreszenzmessungen. (A) Das obere linke Feld zeigt eine Heatmap, die die durchschnittliche zeitliche Dynamik der Kalziumsignale von Keystone-LNs von nicht verhungerten (n = 5) und ausgehungerten Larven (n = 5) im in-vivo-Präparat (ganze Larve) zeigt. Das Boxplot oben rechts vergleicht die normierte Ca-Signalintensität zwischen nicht ausgehungerten (grau) und ausgehungerten (weiß) Proben in der In-vivo-Präparation (Mann-Whitney U-Test ; **p < 0,001). (B) Das untere linke Feld zeigt eine Heatmap, die die durchschnittliche zeitliche Dynamik der Kalziumsignale von Keystone-LNs von nicht verhungerten (n = 5) und ausgehungerten Larven (n = 5) im ex-vivo-Präparat (präpariertes Gehirn) zeigt. Der Boxplot im unteren rechten Feld vergleicht die normierte Ca-Signalintensität zwischen nicht verhungerten (grau) und ausgehungerten (weiß) Proben in der Ex-vivo-Präparation (Mann-Whitney U-Test ; **p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: GCaMP6f-Fluoreszenzaufzeichnungen von Kalziumreaktionen in lokalen Keystone-Neuronen für in-vivo, nicht verhungerte Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: GCaMP6f-Fluoreszenzaufzeichnungen von Kalziumreaktionen in lokalen Keystone-Neuronen für in-vivo-Bedingungen, die unter Hungerzuständen leiden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: GCaMP6f-Fluoreszenzaufzeichnungen von Kalziumreaktionen in lokalen Keystone-Neuronen für ex-vivo, nicht verhungerte Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 4: GCaMP6f-Fluoreszenzaufzeichnungen von Kalziumreaktionen in lokalen Keystone-Neuronen für ex-vivo, hungernde Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.