Entwicklung von arzneimittelresistenten Zelllinien für experimentelle Verfahren

Zusammenfassung

Arzneimittelresistente Zelllinien ermöglichen das Verständnis von Behandlungsresistenzmechanismen und die nichtklinische Bewertung neuer Wirkstoffe, umfunktionierter Medikamente und Kombinationstherapien. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Erzeugung resistenter Zelllinien vorgestellt, indem Elternzelllinien schrittweisen Erhöhungen der Konzentration des Zielarzneimittels ausgesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Entwicklung arzneimittelresistenter Zelllinien ist essentiell, um die Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu verstehen und Strategien zur Überwindung des Behandlungsversagens in der Krebstherapie zu identifizieren. Resistenzmodelle ermöglichen die präklinische Bewertung neuartiger Wirkstoffe, umfunktionierter Medikamente und Kombinationstherapien. Um resistente Zellen zu erzeugen, werden elterliche Krebszelllinien über mehrere Wochen hinweg wiederholt schrittweise steigenden Konzentrationen des Zielmedikaments ausgesetzt. Zellen, die in jedem Stadium überleben und sich vermehren, werden selektiert, expandiert und höheren Medikamentendosen ausgesetzt. Die Entwicklung der Resistenz wird durch die Quantifizierung und den Vergleich der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC₅₀) zwischen elterlichen und resistenten Zellen unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und nichtlinearer Regressionsanalyse bestätigt. Signifikant erhöhte IC_50-Werte deuten auf eine erfolgreiche Anpassung an den Arzneimitteldruck und die Entwicklung von Resistenzen hin. Diese arzneimittelresistenten Zelllinien stehen für umfassende Analysen, wie z. B. Microarray- und Einzelzellsequenzierung, sowie für verschiedene in vitro oder in vivo Experimente zur Verfügung. Diese Modelle bieten wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung potenzieller therapeutischer Strategien zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen.

Einleitung

Die Chemotherapie ist die am häufigsten eingesetzte Behandlungsoption für lokale Krebserkrankungen, die für eine Operation oder Strahlentherapie nicht geeignet sind, oder bei metastasierenden Krebserkrankungen. Molekular zielgerichtete Medikamente und Chemotherapien werden als Erstlinienbehandlungen für viele bösartige Erkrankungen eingesetzt, und ihre Wirksamkeit ist weithin anerkannt. Einige Krebsarten zeigen von Beginn der Behandlung an Resistenzen gegen bestimmte Medikamente, so dass die Behandlung unwirksam ist. In häufigeren Fällen wird jedoch eine Behandlung, die ursprünglich wirksam war, aufgrund der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen unwirksam, was zum Fortschreiten der Krebserkrankung führt.

Arzneimittelresistenz wird sowohl durch genetische Mutationen als auch durch epigenetische Reaktionen in Krebszellen verursacht, die die Expression von Genprodukten induzieren, die sich Medikamenten entziehen oder das Zellwachstum unterstützen ^1,2. Darüber hinaus entwickelt sich diese Resistenz in vielen Fällen zu einer Multiresistenz, bei der die Krebszelle gegen mehrere Medikamente resistent wird ^3,4. Daher ist die Identifizierung der Mechanismen der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung von Strategien zu deren Überwindung für die Weiterentwicklung der Krebsbehandlung äußerst wichtig.

Arzneimittelresistente Zelllinien sind häufig verwendete Modelle zur Untersuchung der Mechanismen therapeutischer Resistenz und spielen sowohl in vitro als auch in vivo Experimenten eine wichtige Rolle⁵. Diese Modelle sind wesentliche Werkzeuge, um ein tieferes Verständnis der Wirkwege von Arzneimitteln zu erlangen, Biomarker zu identifizieren, die die therapeutische Wirksamkeit beeinflussen, und therapeutische Strategien zur Hemmung der Arzneimittelresistenzbildung zu finden. Der grundlegende Prozess zur Schaffung einer arzneimittelresistenten Zelllinie besteht darin, eine Resistenz zu induzieren, indem eine Zelllinie steigenden Konzentrationen des Zielarzneimittels ausgesetzt^{wird 3,6}.

Die verwendete Konzentration und die Dauer der Arzneimittelexposition sind kritische Bestandteile dieses Prozesses. Bei jedem Konzentrationsniveau wird die Untergruppe der überlebenden Zellen amplifiziert und dann wiederholt der nächsten Konzentration des Arzneimittels ausgesetzt. Letztendlich wird eine arzneimittelresistente Zelllinie abgeleitet, die im Vergleich zur Elternzelllinie eine erhöhte halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀) für das Arzneimittel aufweist. In diesem Bericht wird das Verfahren zur Generierung einer Paclitaxel-resistenten Zelllinie (DU145-TxR) aus der humanen Prostatakrebszelllinie DU145 beschrieben, wobei eine schrittweise Methode mit intermittierender Arzneimittelexposition angewendet wird.

Protokoll

1. Zellkultur- und Zellviabilitätsassays

HINWEIS: Paclitaxel ist ein Krebsmedikament und zytotoxisch. Tragen Sie beim Umgang damit einen Kittel, eine Schutzbrille und Handschuhe und arbeiten Sie in einem Sicherheitsschrank, um ein Einatmen in den Körper zu verhindern. DMSO ist nicht hoch zytotoxisch, aber wenn es mit Haut oder Schleimhäuten in Berührung kommt, erhöht sich die Durchlässigkeit von gelösten Arzneimitteln, tragen Sie also einen Kittel, eine Schutzbrille und Handschuhe, wenn Sie damit umgehen.

1. Kultivieren Sie DU-145-Zellen in einer 10-cm-Zellkulturschale mit vollständigem Medium (RPMI-1640 + 1 % Penicillin-Streptomycin [pen-strep] + 10 % fötales Rinderserum [FBS]) in einem 37 °C-Inkubator bei 5 % CO₂ bis 80 % konfluent.
2. Den Nährboden aspirieren, mit DPBS waschen, 0,05 % Trypsin hinzufügen und 5 Minuten im Inkubator ruhen lassen.
3. Nachdem Sie geklopft und mikroskopisch bestätigt haben, dass sich die Zellen von der Platte gelöst haben und schwimmen, fügen Sie 1 ml vollständiges Medium hinzu, um die Wirkung von Trypsin zu stoppen.
4. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und säen Sie sie mit einer Dichte von 1,0 × 10⁴/99 μl pro Vertiefung in vollständigem Medium in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. 2 Stunden inkubieren, damit die Zellen am Boden der Platte haften können. Die Zellen sollten für jede Testgruppe in dreifacher oder vierfacher Ausfertigung plattiert werden.
5. Passen Sie das Paclitaxel und das DMSO an, die zu jeder Vertiefung hinzugefügt werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die Menge an DMSO, die jeder Vertiefung zugesetzt wird, gleich ist und dass die Endkonzentration von DMSO nicht mehr als 1 % beträgt.
   1. Um dies durchzuführen und unserem Protokoll zu folgen, beginnen Sie mit 10 mM Paclitaxel in DMSO und fügen Sie 87,2 μl DMSO zu 12,8 μl dieses Arzneimittels in einem Röhrchen hinzu, um 100 μl Paclitaxel bei 1.280 μM zu erhalten.
   2. 50 μl dieser Lösung werden in ein anderes Röhrchen umgefüllt und mit 50 μl DMSO (640 μM) auf die Hälfte verdünnt.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine serielle Verdünnung durchzuführen und Lösungen von Paclitaxel in Konzentrationen von 0 (nur DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 und 1.280 μM herzustellen.
      HINWEIS: Mit DMSO verdünntes Paclitaxel sollte zur Wiederverwendung in nachfolgenden Experimenten eingefroren gelagert werden (um Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren, in Aliquoten lagern).
6. Verdünnen Sie 1 μl der zuvor hergestellten Paclitaxel-Lösung mit 9 μl vollständigem Medium in einem separaten Röhrchen und geben Sie 2 h nach der Aussaat der Zellen 1 μl davon in jede Vertiefung. Die Paclitaxel-Konzentrationen in jeder Vertiefung betragen 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 und 1.280 nM, wobei jede Vertiefung 100 μl Medium enthält.
   HINWEIS: Wenn Sie die Konzentration von Arzneimitteln einstellen, die in Zellviabilitätsassays verwendet werden, überprüfen Sie die in früheren Arbeiten veröffentlichten IC_50-Werte und stellen Sie sicher, dass die Konzentration im Bereich³ liegt. Die DMSO-Konzentration in jeder Vertiefung betrug durchgehend 0,1 % (weniger als 1 % ist wünschenswert).
7. 48 Stunden inkubieren. Geben Sie 10 μl Zellproliferationsreagenz WST-1 in jede Vertiefung (100 μl Kulturmedium) und inkubieren Sie für weitere 0,5 bis 4,0 Stunden.
   HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit hängt von der Zelllinie und der Zelldichte ab. In dieser Studie kultivierten wir Zellen für etwa 1,5 Stunden. Wenn die Inkubationszeit zu kurz oder zu lang ist, wird die Absorption jeder Vertiefung im nächsten Schritt zu gering oder zu hoch sein. Infolgedessen wird es nicht möglich sein, den Unterschied in der Zellviabilität zu bestätigen. Daher sollte man für die erste Testung mehrere Inkubationszeiten testen, um die entsprechende Inkubationszeit zu bestätigen.
8. Messen Sie die WST-1-Absorption mit einem Mikroplatten-Reader.
   HINWEIS: Die Zielabsorption beträgt 450 nm (420-480 nm wird empfohlen) und die Hintergrundabsorption beträgt 650 nm (600 nm oder höher wird empfohlen).

2. Berechnung der Zellviabilität und des Wertes der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC₅₀)

1. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen aus der Absorption. Die Extinktion beträgt (A450nm-A650nm).
   Lebensfähigkeit der Zellen (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
   As: Probenabsorption (medikamentös behandelte Zellen)
   Ab: blanke Absorption (nur Medium, keine Zellen)
   Ac: Kontrolle der Absorption (medikamentenunbehandelte Zellen)
2. Fassen Sie die im vorherigen Abschnitt berechnete Zellviabilität in einer Tabellenkalkulationssoftware zusammen.
3. Berechnen und notieren Sie den IC₅₀ für die Elternzellen durch nichtlineare Regressionsanalyse.
   HINWEIS: Das logistische Modell mit vier Parametern (4PL) ist oft eine geeignete Berechnungsmethode. Online-Berechnungstools für IC₅₀ stehen zur Verfügung⁷. Das 4PL-Modell sollte jedoch nicht verwendet werden, wenn die Wirksamkeit der Verbindung außerhalb des Konzentrationsbereichs liegt und die Daten die unteren und oberen Asymptoten der Sigmakurve nicht vollständig darstellen können.
   1. Um einen solchen Anstieg zu vermeiden, messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen an so vielen Konzentrationspunkten wie möglich. Wenn keine Sigmoidkurve erhalten werden kann, verwenden Sie einen Modus mit zwei oder drei Parametern mit festen Minimal- und Maximalwerten⁷.
   2. Wenn Sie keine Berechnungssoftware oder Statistiksoftware verwenden, einschließlich der im Internet verfügbaren Software, verwenden Sie die folgende Formel:
      IC₅₀=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      A: Der niedrigste Wert unter den gemessenen Wirkstoffkonzentrationen mit einer Zellviabilität von ≤50%
      B: Der höchste Wert unter den gemessenen Wirkstoffkonzentrationen mit einer Zellviabilität von >50 %
      C: Zellviabilität bei B
      D: Zellviabilität bei A
      HINWEIS: Bei dieser Formel wird davon ausgegangen, dass das Diagramm zwischen den beiden Punkten, die den IC_50-Wert umgeben, eine gerade Linie ist.

3. Exposition gegenüber Arzneimitteln

HINWEIS: Eine Übersicht über die in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren finden Sie in Abbildung 1.

1. Samenelternzellen auf Zellkulturplatten (2,0 × 10⁶ Zellen/Schale für 100 mm Schale).
2. Geben Sie Paclitaxel in einer zellviabilitätshemmenden Konzentration von ~10-20% (IC_10-20, ~0,5 nM in diesem Fall) in das Medium und kultivieren Sie es 2 Tage lang in einem Inkubator.
3. Durch Paclitaxel-freies Medium ersetzen und mehrere Tage inkubieren.
4. Sobald die Zellen gewachsen und zu 80 % zusammenfließend sind, werden sie in eine neue Zellkulturplatte geleitet. Kryokonservieren Sie die restlichen Zellen.
5. Fügen Sie den passierten Zellen Paclitaxel in einer Konzentration von ~1,5-2,0-fach der Ausgangskonzentration (0,75-1 nM) hinzu. Inkubieren Sie 2 Tage lang in einem Inkubator.
6. Durch Paclitaxel-freies Medium ersetzen und mehrere Tage inkubieren.
7. Wenn die Zellen ähnlich wachsen, wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.6 und erhöhen Sie die Konzentration der Paclitaxel-Exposition Schritt für Schritt.
   HINWEIS: Die Erhöhung der Wirkstoffkonzentration (1,5-2,0-fach) kann vom Experimentator frei eingestellt werden, und der Versuch sollte bei dieser Konzentration wiederholt werden. Wir empfehlen, die Zellen jedes Mal einzufrieren und zu lagern, wenn die Wirkstoffkonzentration erhöht wird. Wenn die Paclitaxel-Konzentration weiter ansteigt, kann es sein, dass sich die Zellproliferation nicht erholt und die Zellen absterben können. In solchen Fällen tauen Sie die Zellen auf, die sich vor dem Tod in der Konzentration vermehrt haben, reduzieren Sie den Paclitaxel-Anstieg auf das 1,1- bis 1,5-fache (das 1,2-fache wird empfohlen) und wiederholen Sie die Kultur.
8. Erhöhen Sie allmählich die Resistenz der Zelllinie gegen das Arzneimittel und berechnen und zeichnen Sie dann den IC₅₀ mit WST-1 und Software auf, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
   HINWEIS: Wenn ein Anstieg von IC₅₀ um mindestens das 3-5-fache beobachtet wird, kann festgestellt werden, dass es sich bei dem Stamm um eine arzneimittelresistente Zelllinie handelt.

4. Aufrechterhaltung der Arzneimittelresistenz

1. Um den resistenten Phänotyp der arzneimittelresistenten Zelllinie zu erhalten, inkubieren Sie mit einer Wirkstoffkonzentration von IC_10-20.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den IC₅₀ in einem Zellüberlebensassay regelmäßig zu messen, da sich die Arzneimittelresistenz ändern kann.

Ergebnisse

Mit dieser Methode haben wir zuvor 9 Monate lang erfolgreich Paclitaxel-resistente DU145-Zellen (DU145-TxR) etabliert. Die Ergebnisse des Zellviabilitätsassays zeigten, dass der IC_50-Wert von Paclitaxel für die DU145-Elternzelllinie 1,1 nM betrug, während der IC_50-Wert für DU145-TxR 149,6x höher war als der der Elternzelllinie (IC₅₀: 164,6 nM) (Tabelle 1 und Abbildung 2). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass DU145-TxR eine sehr hohe Arznei...

Diskussion

Die Entwicklung von arzneimittelresistenten Krebszelllinien ist eine etablierte Methode zur Untersuchung von Toxizitäts- und Resistenzmechanismen von Arzneimitteln, aber die erste Herausforderung für die Forscher besteht darin, ein geeignetes Modell für die Expression von Resistenzen auszuwählen. Eine gängige Methode zur Herstellung arzneimittelresistenter Zelllinien in vitro besteht darin, die Zelllinie dem Zielarzneimittel auszusetzen, aber es muss überlegt werden, wie die Expositionsk...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
10 mL serologische Einwegpipette	Fisher Scientific	13-678-11E
100 mm Schale	Corning	353003
	Corning	352097
2,0 mL Kryofläschchen	Corning	431386
96-Well-Zellkulturplatte	Corning	353072
Zellzählkammer Objektträger	Invitrogen	C10228
Zellproliferationsreagenz WST-1	Sigma	5015944001
Zentrifuge 5702 R	eppendorf
unzählige II	Invitrogen		Zellzähler
Dimethylsulfoxid	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	Prostatakrebs-Zelllinie
EVOS FLc	Thermo Fisher Scientific		Digitales Inverses Mikroskop
FBS	Gibco	A5670701
Paclitaxel	Selleck	S1150
Penicillin– Streptomycin	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek		Mikroplatten-Reader
Trypanblaue Lösung 0,4%	Invitrogen	15250061

konisches Röhrchen 15 mL