Erreichen einer hochwertigen tomografischen Datenerfassung mit dem 200-kV-Transmissionselektronenmikroskop mit Doppelkondensatorlinsensystem

Summary

Die Elektronentomographie ermöglicht eine nahezu atomare Bildgebung von Organellen, Zellen und Makromolekülen in Geweben in kryobiologischen Proben. Um eine solche Auflösung zu erreichen, sind streng kontrollierte Bildgebungsbedingungen erforderlich. Hier beschreiben wir unter Verwendung eines 200-kV-Transmissionselektronenmikroskops mit einem zweistufigen Kondensatorlinsensystem als Beispiel, wie man hochwertige Elektronentomographie-Datenerfassung durchführt.

Abstract

Die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) hat sich als leistungsstarke Technik zur Aufklärung der Strukturen zellulärer Organellen und großer Proteinkomplexe in ihren natürlichen Umgebungen etabliert. Im Gegensatz zur herkömmlichen Raumtemperatur-Elektronenmikroskopie minimiert Kryo-ET strahleninduzierte und präparationsinduzierte Schäden an inneren Strukturen. Außerdem reduziert Kryo-ET im Gegensatz zur Einzelteilchenanalyse (SPA) den Bedarf an wiederholter Reinigung und erhält so die authentischsten strukturellen Informationen der Proben. Um eine hochauflösende Bildgebung zu erreichen, stellt Kryo-ET zudem strenge Anforderungen an die Bildgebungsbedingungen des TEM. Trotz der kontinuierlichen Verbesserung der Effizienz bei der Kryo-ET-Datenerfassung und dem Aufkommen zahlreicher Softwareplattformen sind die meisten Lösungen proprietär, herstellerspezifisch und eng an bestimmte Elektronenmikroskopmodelle gekoppelt, was zu hohen Implementierungskosten führt. In dieser Studie installierten wir die Open-Source-Software SerialEM auf einem 200-kV-Elektronenmikroskop (Glacios 2 Cryo-TEM) mit einem Doppelkondensatorlinsensystem und führten umfassende Kalibrierungen durch, um eine hochwertige tomografische Datenerfassung zu ermöglichen. Unter Verwendung von Apoferritin als Modellprobe beschreiben wir den gesamten Arbeitsablauf – von der Kryoprobenvorbereitung bis zur automatisierten Kryo-ET-Datenerhebung, gefolgt von Tomogrammrekonstruktion und Sub-Tomogramm-Analyse. Diese Methode bietet eine kostengünstige und zugängliche Lösung für die Kryo-ET-Datenerfassung, insbesondere für Labore, die Glacios-Mikroskope ohne Zugang zu proprietärer Software verwenden.

Introduction

Die Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) hat sich als leistungsstarke Technik zur Untersuchung der natürlichen Strukturen makromolekularer Komplexe und zellulärer Organellen in situ etabliert. Ein großer Vorteil der Kryo-ET gegenüber der Einzelteilchenanalyse (SPA) ist ihre Fähigkeit, übermäßige Reinigungsschritte zu vermeiden und so den nativen Zustand der Zielbiomoleküle im biologischen Kontext zu erhalten. Derzeit kann ein breites Spektrum von Proben – darunter gereinigte Organellen ^1,2,3,4, Zellmembranplatten, makromolekulare^{Komplexe 5}, Viren⁶, zelluläre Lamellen⁷ und Gewebeschnitte ^8,9,10 – mit Kryo-ET untersucht werden. Angesichts der Vielfalt der Probentypen und experimentellen Ziele variieren die Datenerhebungsstrategien erheblich und müssen sowohl auf die Probe als auch auf die spezifische Instrumentenkonfiguration zugeschnitten werden.

Datenerhebung ist ein entscheidender Schritt im Cryo-ET-Workflow, da sowohl die Datenqualität als auch die Effizienz der Erfassung direkt die nachgelagerte Verarbeitung und den Gesamterfolg des experimentellen Experiments beeinflussen. Um den sich wandelnden experimentellen Anforderungen gerecht zu werden, wurden mehrere Datenerfassungsplattformen entwickelt. Zu den am weitesten verbreiteten Fällen gehören die kommerzielle Tomographie und die Open-Source-Software SerialEM 11,12,13. Tomographie bietet eine hochintegrierte und benutzerfreundliche Oberfläche mit einer niedrigen Lernkurve, ist jedoch weniger flexibel und erfordert eine kommerzielle Lizenz. Im Gegensatz dazu ist SerialEM ein kostenloses, quelloffenes Paket, das sowohl grafische Benutzeroberflächen- (GUI)-basierte als auch skriptbasierte Workflows unterstützt und größere Flexibilität und Erweiterbarkeit bietet.

Tomografische Datenerhebung aus Kryo-Lamellen stellt besondere Herausforderungen dar. Hochwertige Lamellen sind schwer herzustellen, und ihre mechanische Instabilität sowie hohe Empfindlichkeit gegenüber Elektronenbestrahlung erschweren die Datenerhebung zusätzlich. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, entwickelte Fabian Eisenstein den PACEtomo-Workflow¹⁴, eine Verbesserung von SerialEM, die Strahlbildverschiebung einführt, um mehrere Tomogramme pro Neigungsserie zu erfassen und so die Fokusfrequenz und Verfolgungsanpassungen zu reduzieren. Diese Strategie maximiert die Menge an nutzbaren Daten aus jedem Abschnitt und minimiert gleichzeitig unnötige Elektronenexposition. Ähnliche Funktionen sind auch in der kommerziellen Tomography5-Software verfügbar.

Im Gegensatz dazu ist die Datenerhebung aus kryofixierten Organellen oder Membranblättern in der Regel unkomplizierter, da diese Proben typischerweise auf löcherigen Kohlenstoffgittern vorbereitet werden, was ausreichend Platz zum Fokussieren und Verfolgen von^15,16 bietet. In solchen Fällen bieten SerialEMs integrierte Cryo-ET-Erfassungs-Workflows – direkt über die grafische Oberfläche zugänglich – eine bequeme, skriptfreie Option, die besonders für Anfänger oder kleinere Labore geeignet ist. Dennoch empfehlen wir aus Effizienzsicht immer noch Strategien auf Basis von Strahlbildverschiebungen, wann immer es möglich ist.

Angesichts der hohen Kosten von Kryo-Elektronenmikroskopen ist die Optimierung der Datenerfassungsstrategien zur Maximierung der Instrumentennutzung unerlässlich. Ein 200-kV-TEM mit einem zweistufigen Kondensatorlinsensystem bietet bei dicken Proben eine etwas geringere Elektronendurchdringung als ein 300-kV-Instrument, bleibt aber bei richtiger Kalibrierung für Kryo-ET voll funktionsfähig. Sein relativ enger, paralleler Strahlbereich und die feste Punktgröße über Vergrößerungen hinweg machen es jedoch im Allgemeinen weniger geeignet für hochauflösende Kryo-ET, es sei denn, das System wird präzise optimiert.

Unser Elektronenmikroskopie-Setup ist mit einer Falcon 4i Direktelektronendetektionskamera ausgestattet, die erhebliche Vorteile bei der Einzelelektronenzählung und der Hochgeschwindigkeits-Dauerbildgebung bietet. Um die Leistung dieses Detektors voll auszuschöpfen, muss das TEM unter gut optimierten Bildgebungsbedingungen betrieben werden. Bei TEMs mit einem zweistufigen Kondensatorsystem ist die präzise Kalibrierung der Beleuchtungsbedingungen für paralleles Licht ein wichtiger Faktor zur Verbesserung der Bildqualität^17,18. In modernen zweistufigen Kondensatorsystemen muss der Brennpunkt der zweitstufigen Kondensatorlinse mit der vorderen Brennweite der oberen Objektivlinse zusammenfallen, um sicherzustellen, dass der optische Pfad, der sich mit der Abprobenebene schneidet, parallel verläuft. Genau festgelegte parallele Lichtbedingungen sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die Unterfokuswerte und Vergrößerung an lokalen Positionen in den gesammelten Bildern konstant bleiben.

In dieser Studie konzentrierten wir uns darauf, einen hochwertigen Cryo-ET-Workflow unter Verwendung von Apoferritin als Modellprobe zu etablieren. Da das 200-kV-Transmissionselektronenmikroskopsystem nicht für die kommerzielle Tomographie-Software lizenziert ist, haben wir stattdessen die Open-Source-Plattform SerialEM installiert und kalibriert. Durch sorgfältige Optimierung der parallelen Strahlparameter für das zweistufige Kondensatorlinsensystem des Mikroskops erreichten wir eine automatisierte tomografische Datenerfassung über die grafische Schnittstelle SerialEM – ohne Notwendigkeit von Python-Skripten oder komplexer Konfiguration. Dieser Ansatz bietet eine benutzerfreundliche und kosteneffiziente Lösung für eine effiziente Kryo-ET-Datenerfassung auf 200-kV-Geräten wie Glacios.

Protocol

1. Vorbereitung und Beladung von Kryoproben

1. Um den Vitrobot vorzubereiten, schalten Sie ihn ein und stellen Sie die Temperatur auf 10 °C ein. Stelle die Luftfeuchtigkeit auf 100 %. Ersetzen Sie das Filterpapier.
2. Setze ein 300-Mesh R1.2/1.3-Löcher-Kohlenstofffilm-Cu-Gitter in das Glow-Entlasssystem. Stellen Sie die Glühentladungsbedingungen für 60 Sekunden auf 15 mA bei einem Vakuumdruck von 0,39 mBar, negative Ladung. Führen Sie die Glühentladung durch, um die Gitteroberfläche hydrophilisiert zu machen.
3. Stellen Sie die Vitrobot-Parameter wie folgt ein: Lot-Zeit: 3 s, Wartezeit: 0 s, Klontkraft: 2, Temperatur: 8 °C, Luftfeuchtigkeit: 90%.
4. Bereiten Sie flüssiges Ethan in einem Ethanbecher vor, der in flüssigen Stickstoff eingewickelt ist, indem Sie es mit flüssigem Stickstoff abkühlen.
5. Trage 3 μL Apoferritinprobe auf das glühentladene Gitter auf. Die Probe sofort mit flüssigem Ethan verglasten
6. Übertragen Sie die Probe von Ethan in eine vorgekühlte Lagerbox in flüssigem Stickstoff. Die Kryoprobevorbereitung ist nun abgeschlossen.
   VORSICHT: Folgende Sicherheitsprotokolle müssen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und Ethan strikt eingehalten werden: Persönliche Schutzausrüstung (z. B. kryogene Handschuhe und Schutzbrillen) ist erforderlich, um Erfrierungen während des Betriebs zu verhindern; Vor der Ethankondensation sollte sichergestellt werden, dass der Aufnahmebecher frei von flüssigem Stickstoff ist, um Spritzer durch schnelles Kochen zu vermeiden; Nach Gebrauch werden die Haupt- und Druckreglerventile des Ethangassystems sicher geschlossen, um Leckagen zu verhindern; Resteher und flüssiger Stickstoff müssen nach der Probenpräparation in ausgewiesenen Lüftungsanlagen im Vorbereitungsraum entsorgt werden.

2. Bestimmung der parallelen Lichtbedingungen für die Elektronenmikroskopie

1. Vor der Durchführung der parallelen Ausrichtung des Strahls passen Sie zunächst die folgenden Parameter des Mikroskops ein: Stufe auf euzentrischer Höhe, Objektivlinse im Fokus, nP-Strahlneigung ppX/ppY, komafreier Drehpunkt X/Y, Koma und Stigma.
2. Mit einem Kreuzgitter wird bestätigt, dass die Probe in euzentrischer Höhe und korrektem Fokus bei einer Vergrößerung von SA 73.000× (ohne Energiefilter) im Nano-Sondenmodus liegt.
3. Schalte in den Beugungsmodus (Kameralänge: D750 mm) und setze die 100 μm große Objektivblende ein (Abbildung 1A, 1B).
4. Klicken Sie auf den Tab Anpassen für die Objektivblende und verwenden Sie die Multifunktions-X- und Y-Knöpfe, um die Objektivblende aus der Mitte zu verschieben, sodass der Rand der Blende die goldenen Beugungsringe überlappt und den zentralen Punkt teilweise verdeckt (Abbildung 1C).
5. Bringen Sie die hintere Brennweite des Objektivs ins Blickfeld, indem Sie den Beugungsfokus mit dem Fokusknopf einstellen, bis der Rand der Objektivblende so scharf wie möglich ist (Abbildung 1D).
6. Stellen Sie die Strahlintensität (C2-Stärke) an, bis die Breite der goldenen Beugungsringe minimiert ist.
7. Zentriere die Objektivöffnung. Verlängern Sie die Beugungskameralänge, bis nur noch der zentrale Punkt sichtbar ist (Abbildung 1E).
8. Klicken Sie auf den Diffraction-Tab im Stigmator-Panel und verwenden Sie die Multifunktions-X- und Y-Knöpfe, um die Form des zentralen Punktes zu verstellen, während Sie über und unter dem Weichweichenpunkt zyklieren, sodass der Strahl rund wird (Abbildung 1F).
9. Stellen Sie die Strahlintensität an, bis der zentrale Punkt minimiert ist. Dies stellt parallele Beleuchtungsbedingungen her. Da die Parallelbeleuchtungsbedingungen je nach Fleckgröße variieren können, dokumentieren Sie die entsprechenden C2-Einstellungen für jede häufig verwendete Fleckgröße, um eine schnelle Konfiguration bei zukünftigen Experimenten zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die genaue Punktgröße, die bei der Datenerfassung verwendet wird, hängt von der Vergrößerung und der C2-Blendeneinstellung ab; Wir müssen sicherstellen, dass die Bildaufnahme mit der optimalen Dosisrate für die Kamera durchgeführt wird.

3. Hochwertige Elektronentomographie-Datenerhebung für Apoferritinproben

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt ein standardisiertes Verfahren zur Hochdurchsatz-Tomografie-Datenerfassung, das sowohl für erfahrene Nutzer als auch für neue Forscher geeignet ist.

1. Um das Gitter zu befestigen und die vorbereitete Kryoprobe ins Elektronenmikroskop zu laden, wird der O-Ring in das Ausrichtungswerkzeug gesetzt, wobei das vorbereitete Gitter in der Mitte des O-Rings platziert wird. Benutze den Federstift, um den C-Ring am O-Ring zu befestigen und das Muster dazwischen zu fixieren.
2. Stecken Sie das Autogrid vertikal in den Schlitz der Kassette, übertragen Sie es durch die Arbeitsstation in die Nanocup und laden Sie es dann in das Elektronenmikroskop.
3. Um mit SerialEM eine vollständige Montage des gesamten Gitters zu erfassen, starten Sie die SerialEM-Software. Aktivieren Sie den Niedrigdosis-Modus. Definieren Sie den Suchmodus bei 115× Vergrößerung.
   HINWEIS: Die Suchvergrößerung wird typischerweise verwendet, um Karten mit großen Flächen zu erfassen. Diese Vergrößerung wird so niedrig wie möglich eingestellt, um den Kartierungsprozess zu beschleunigen und gleichzeitig die Genauigkeit des Bildzusammenschnitts zu gewährleisten.
4. Öffnen Sie die Navigator-Datei. Geh zu Navigator > Montaging & Grids > Setup Full Montage. Im Dialogfeld setzen Sie den Suchmodus verwenden; Speichere Bilder im bin4-Format. Klicke auf Start unter Montage-Steuerungen.
5. Um die Such- und Ansichtsfelder zu kalibrieren, finden Sie im Suchmodus ein sehr erkennbares Orientierungszeichen (Abbildung 2A). Klicken Sie im Navigator auf Marker hinzufügen . Klicken Sie auf Gehe zu Marker , um zum Marker-Standort zu gelangen.
6. Schalte in den View-Modus (2600× um denselben Orientierungspunkt zu finden. Klicken Sie auf das Wahrzeichen. Gehe zum Navigator, klicke auf Shift to Marker , um die Felder auszurichten (Abbildung 2B). Nach den Anweisungen im Dialogfeld werden die Strahlverschiebungen beider Vergrößerungen allen Markern in der Suchkarte zugewiesen und die Verschiebungswerte gespeichert (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die Ansichtsvergrößerung ist in der Regel auf die niedrigste Vergrößerung des ausgewählten Bereichs (SA) eingestellt, um sicherzustellen, dass sowohl Ansicht als auch Aufnahme im gleichen Modus sind, was den Zentrierungsprozess beim Vergrößerungswechsel erleichtert.
7. Zur Kalibrierung der Ansichts- und Aufzeichnungsfelder (Abbildung 3). Im View-Modus finden Sie ein sehr bekanntes Wahrzeichen. Wechsel in den Aufnahmemodus (120k×). Benutze die Maus, um das Orientierungszeichen im Aufzeichnungsmodus zu zentrieren.
   HINWEIS: Die Einstellung der Record-Vergrößerung hängt von der geschätzten Zielauflösung ab (wobei die Zielauflösung doppelt so groß wie die Pixel ist) und der Größe der Probe.
8. Schalte zurück in den Ansichtsmodus und mach ein Foto. Ziehen Sie das Zielobjekt unter der Ansichtsvergrößerung mit der rechten Maustaste auf das Fadenkreuz, das das Zentrum des Sichtfelds repräsentiert.
9. Klicken Sie im Abschnitt Defokus auf Setzen neben Shift , um die Felder auszurichten.
10. Um das Zielquadrat auszuwählen und eine Karte mit mittlerer Vergrößerung zu erfassen, 5.1 in der vollständigen Montage, klicken Sie auf Polygon hinzufügen , um das zu erfassende Gebiet zu markieren. Nachdem Sie einen Bereich umrissen haben, klicken Sie auf Hinzufügen stoppen , um die Auswahl abzuschließen.
11. Wiederhole Schritt 3.10 für alle gewünschten Bereiche. Für jedes Polygon im Navigator aktivieren Sie bei den Optionen Item Acquire (A) und New File (Neue Datei).
12. Im Dialogfeld, das nach dem Anklicken von Neue Datei bei Element erscheint, wählen Sie Folgendes aus: Montage von Bildern; Montage auf Polygon anpassen; Schließen Sie die Datei, wenn die nächste neue Datei geöffnet werden soll. Klick OK.
13. Im neuen Dialogfeld wählen Sie Folgendes aus: Bühne bewegen statt Bild verschieben; Verwenden Sie die View-Parameter im Low Dose-Modus. Speichere das Bild an der angegebenen Stelle.
14. Um die Karte mit mittlerer Vergrößerung zu erfassen, klicken Sie im Navigator-Menü auf Items erwerben. Prüfen Sie folgende Optionen: Bild oder Montage aufnehmen und speichern; Erstellen Sie eine Navigator-Karte.
15. Im Abschnitt Primäre Aktion aktivieren Sie den Modus "Ansicht verwenden" zum Aufnehmen von Bildern. Im Abschnitt Aufgaben vor oder nach der Grundschule prüfen Sie die Rough Eucentricity. Klicken Sie auf GO, um mit der Erfassung der mittleren Vergrößerungskarte zu beginnen.
16. Um Punkte auf der Mittelvergrößerungskarte auszuwählen. Öffnen Sie die Mittelvergrößerungskarte in der Navigator-Oberfläche. Klicken Sie auf Punkt hinzufügen und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Zielobjekte auf der Karte.
17. Wiederhole das für alle gewünschten Punkte. Nachdem Sie alle Punkte ausgewählt haben, klicken Sie auf Stopp hinzufügen , um die Auswahl abzuschließen.
18. Für die Aperturausrichtung verwenden Sie direkte Ausrichtungen in der Mikroskop-Benutzeroberfläche, um die nP-Strahlneigung ppX/ppY und den komafreien Pivotpunkt X/Y anzupassen und so das Wackeln des Strahlflecks im Sichtfeld zu minimieren.
19. Führen Sie Tune Scope mit einem Skript aus der SerialEM-Skriptbibliothek (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47) aus.
20. Um die Tomographie-Datenerfassung zu starten, finden Sie in der Navigator-Schnittstelle die ROI und prüfen Sie die Tilt Series. Wählen Sie im Dialogfeld Bilder ein; Wählen Sie den Speicherort.
21. Im Einstellungsdialog stellen Sie einen Gradbereich von -50° bis 50° ein. Setze das Basisinkrementement auf 2,5°, den Startwinkel auf 0° und aktiviere das Dosis-symmetrisches Schema.
    HINWEIS: Die Einstellungen für die Dosis pro Neigung, Neigungswinkel und Neigungsschritt folgen im Allgemeinen den unten beschriebenen Prinzipien: Die Gesamtdosis wird bei etwa 100 e⁻/Ų gehalten. Der Neigungsbereich wird so gewählt, dass die Probe selbst beim höchsten Neigungswinkel weitgehend unbehindert bleibt und eine ausreichende Elektronenübertragung und Bildgebung ermöglicht. Ist der Neigungsbereich relativ groß (z. B. über ±60°), kann der Neigungsschritt auf 3° eingestellt werden. Für einen kleineren Neigungsbereich (z. B. etwa ±50°) kann der Neigungsschritt auf 2,5° oder 2° reduziert werden, um sicherzustellen, dass die Gesamtdosis bei etwa 100 e⁻/Ų bleibt. Dies ist besonders wichtig für 200-kV-Mikroskope, bei denen Strahlenschäden im Vergleich zu 300-kV-Mikroskopen ausgeprägter sind, weshalb es unerlässlich ist, eine übermäßige Gesamtdosis zu vermeiden.
22. Im Abschnitt Strahlintensität oder Belichtungskontrolle wähle Strahlintensität halten. Stellen Sie das Defokus-Ziel auf -3 μm ein und stellen Sie die Autofokusfrequenz auf einmal pro Neigung ein.
23. Prüfe Stopp, wenn Autoalign mehr als 60 % der Bildgröße verschiebt, setze Verfolgen vor und nach.
24. Um mit der Datenerhebung zu beginnen, klicken Sie in Navigator auf Erhalten bei Items. In der Hauptaktion aktivieren Sie das Defokussierungsziel im Autofokus, Drift Warten & TS.
25. Stellen Sie den Defokusbereich von -3,5 bis -4,5 μm in 4 Schritten ein. Unter General aktivieren Sie am Ende die Säulenventile schließen. Im Abschnitt Aufgaben vor oder nach Primär aktivieren Sie Realign to Item und Feinheit Euzentrizität vor Primär.

4. Subtomogramm-Durchschnitt von Apoferritin

1. Führen Sie Bewegungskorrektur und CTF-Schätzung mit Warp¹⁹ durch. Führen Sie eine tomographische Neigungsreihenausrichtung mit AreTomo3²⁰ durch.
2. Führe tomographische Rekonstruktion und Dekonvolution mit Warp aus. Führen Sie vorlagenbasierte Partikelauswahl mit PyTom²¹ durch.
3. Führen Sie die erste Verfeinerung mit RELION 5²² durch. Führen Sie hochauflösende Verfeinerungen mit M²³ durch.
4. Bestimmung der Endstruktur durch Verarbeitung von acht Neigungsreihen, gefolgt von der Auswahl von 5.939 Partikeln und iterativer Verfeinerung, wobei eine Endauflösung von 2,8 Å erreicht wird (Abbildung 4).

Results

Nach präziser paralleler Strahlausrichtung führten wir die Tomographie-Datenerhebung für Apoferritin mithilfe der grafischen Schnittstellenfunktion von SerialEM durch. Die anschließende Verarbeitung mit Warp, AreTomo, PyTom, RELION und anderer relevanter Software ergab eine endgültige Struktur mit einer Auflösung von 2,8 Å. Diese Auflösung zeigt ausreichend die hohe Qualität unserer Daten, die ein derzeit durch Subtomogramm-Durchschnitt bei relativ hoher Auflösung erreichbares Niveau erreicht werden kann. Wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigen die ausgerichteten und rekonstruierten Ergebnisse (Abbildung 4A) eindeutig die Gesamtarchitektur und räumliche Verteilung von Apoferritin. Die Subtomogramm-Mittelung wurde an Partikeln durchgeführt, die aus acht ausgerichteten und rekonstruierten Neigungsreihen extrahiert wurden, was eine Struktur mit einer Auflösung von 2,8 Å ergab (Abbildung 4B). Die entsprechende Fourierschalen-Korrelationskurve (FSC) ist in Abbildung 4C dargestellt.

Abbildung 1: Bestimmung des Parallelbeleuchtungszustands mit dem zweiten Kondensatorlinsensystem. (A) Beugungsmuster im Beugungsmodus ohne Apertur. (B) Beugungsmuster nach Einsetzen einer 100-μm-Objektivöffnung. (C) Blendenversatz vom Beugungszentrum, um die Kantenschärfe besser zu visualisieren. (D) Fokussierte Blendenkante und optimierte Beugungsringe durch Anpassung von Objektiv- und C2-Linsenströmen. (E) Elliptischer zentraler Beugungspunkt, der über das Stigmatorpanel korrigiert werden muss. (F) Kreisförmiger und minimierter zentraler Beugungspunkt, der eine optimierte parallele Beleuchtung anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Ausrichtungsprozess von hoher bis niedriger Vergrößerung von Suche (115×) zu View (2600×). (A) Suchmodus-Bild mit dem Marker (roter Pfeil) am Rand des Lochs. (B) Bild im Betrachtungsmodus mit dem Marker (roter Pfeil) an derselben Objektposition wie in (A). Die Option "Shift to Marker" wird im Navigator aktiviert. (C) Im Pop-up-Fenster werden die Strahlverschiebungen beider Vergrößerungen allen Markern in der Suchkarte zugewiesen, und die Verschiebungswerte werden gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Ausrichtungsprozess von hoher bis niedriger Vergrößerung von View (2600×) bis Record (120k×). (A) Im Aufzeichnungsmodus wird das Zielobjekt im Zentrum des Sichtfelds positioniert (der rote gestrichelte Kreis hebt das Zielobjekt hervor). (B) Bild im Ansichtsmodus aufgenommen, bei dem das Zielobjekt nicht mit dem roten Fadenkreuz ausgerichtet ist (roter gestrichelter Kreis hebt das Zielobjekt und das rote Fadenkreuz hervor). (C) Das Zielobjekt wird durch Rechtsklick und Bewegung in die Mitte des roten Fadenkreuzes gezogen, gefolgt vom Drücken der Set-Taste neben der Shift-Taste (das rote gestrichelte Feld hebt die Taste hervor). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Strukturbestimmung von Apoferritin. (A) Strukturelle Bildgebung. Lokale Auflösungsabbildung des endgültigen Subtomogramm-Durchschnitts. Die Textur wirkt einheitlich, mit eng angeordneten, sich wiederholenden nanoskaligen Merkmalen über das gesamte Sichtfeld. (B) räumlich aufgelöste quantitative Abbildung. Eine falschfarbige, kreisförmige Karte derselben oder einer verwandten nanostrukturierten Region. Die Farben reichen von Blau/Grün bis Gelb/Rot und entsprechen den zahlenmäßigen Werten, die auf der untenstehenden Farbskala angezeigt werden (etwa 2,5 bis 3,5 in beliebigen Einheiten). Die heterogene Farbverteilung zeigt eine räumliche Variation in einer gemessenen Eigenschaft (zum Beispiel Höhe, Dicke, Brechungsindex oder mechanische/optische Antwort) über die Probe hinweg. (C) Globale spektrale oder funktionale Charakterisierung. Fourier-Schalen-Korrelationskurve (FSC) wird zur Auflösungsschätzung verwendet. Die Endauflösung von 2,8 Å wird durch die gestrichelte Linie bei FSC = 0,143 angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

Die Verfahren zur Kryoprobenvorbereitung und zur Elektronentomographie-Datenerhebung müssen an den spezifischen Probentyp angepasst werden. Die hier beschriebene experimentelle Strategie eignet sich gut für biologische Makromoleküle, Proteinkomplexe und kleine Organellen. Diese Proben können direkt auf EM-Gitter verglastet werden, und ihre relativ geringe Dicke gewährleistet eine effiziente Elektronenübertragung und die Aufnahme von hochkontrastigen Bildern. Idealerweise sollte die Probendicke 200 nm nicht überschreiten.

Für tauchgefrorene Proben wird in der Regel eine laterale Dimension von weniger als 10 μm bevorzugt, um die kristalline Eisbildung zu minimieren, die die strukturelle Integrität beeinträchtigen kann. Bei größeren Proben kann Hochdruckgefrieren oder die Zunahme von Kryoprotektanten wie Glycerol im Puffer die Eisnukleation²³ verzögern. Um jedoch die Dickenanforderungen für TEM zu erfüllen, ist oft ein weiteres Ausdünnen erforderlich. Unter den verfügbaren Verdünnungsmethoden ist das fokussierte Ionenstrahl-(FIB)-Fräsen²⁴aufgrund seiner Präzision und minimalen Schäden am weitesten verbreitet und erzeugt Lamellen, die für hochauflösende Kryo-ET geeignet sind.

Bei der Sammlung von Lamellendaten ist es entscheidend, die Lamellennutzung zu maximieren. Die Implementierung der Beam-Image-Shift-Erfassung kann den Bedarf an wiederholten Fokus- und Nachverfolgungsschritten verringern und so die Datenerfassungsrate erhöhen. Obwohl hier nicht im Detail beschrieben, wurde diese Technik in der PACEtomo-Methodik ausführlich beschrieben.

Derzeit gehören beliebte Softwareoptionen zur Tomographie-Datenerfassung Tomographie (Thermo Fisher Scientific) und SerialEM. Tomographie ist eine kommerzielle Lösung mit begrenzter Flexibilität für Anpassungen, während SerialEM, entwickelt von David Mastronarde an der University of Colorado Boulder, eine Open-Source-Software ist, die skriptbasierte Automatisierung unterstützt. Allerdings erfordert die vollständige Ausnutzung der Fähigkeiten von SerialEM eine erhebliche Lernkurve. In dieser Studie präsentieren wir einen optimierten Workflow, der die GUI von SerialEM nutzt, wodurch Skripte oder Python-basierte Konfigurationen überflüssig werden und gleichzeitig unbeaufsichtigte Datenerfassung über Nacht ermöglicht wird.

Eine häufige Herausforderung bei der Tomographiedatenerfassung mit dieser Methode ist das ungenaue Verfolgen, was zu unvollständigen Neigungsreihen mit fehlenden Winkeln führen oder die nachfolgende Ausrichtung erschweren kann. Um diese Probleme zu mindern, müssen die Tracking-Parameter basierend auf dem Kontrast der Probe und der Stabilität der Neigungsstufe optimiert werden. Effektive Strategien umfassen die Anpassung der Belichtungszeit an den Tracking-Positionen zur Sicherstellung der Bildklarheit, das physische Trennen von Tracking- und Fokussierpositionen zur Reduzierung der kumulativen Strahlungsschäden sowie die Reduzierung der Tracking-Vergrößerung bei schlechter Stage-Stabilität, um eine zuverlässige Mustererkennung zu ermöglichen. Zusammen sind diese Anpassungen unerlässlich, um eine robuste Nachverfolgungsleistung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu erreichen. In dieser Arbeit verwenden wir Apoferritin als Modellexemplar. Unter dem Konzept, paralleles Licht zu testen und zu korrigieren, nutzen wir die integrierten Funktionen von SerialEM, um hochwertige Daten für Kryo-ET zu sammeln und Subtomogramm-Berechnungen an den Ferritinproben durchzuführen, wobei letztlich die Endstruktur bei 2,8 Å erreicht wird.

Diese Methode wurde entwickelt, um die Anwendbarkeit von 200-kV-Elektronenmikroskopen für hochauflösende Kryo-ET zu erweitern. Das Erreichen einer solchen Auflösung hängt grundlegend von der Gewinnung hochwertiger Bilddaten ab, was wiederum präzise Beleuchtungsbedingungen erfordert. Zu diesem Zweck führten wir eine genaue parallele Ausrichtung der Beleuchtung als entscheidenden Vorbereitungsschritt durch. Das hier beschriebene Ausrichtungsverfahren ist speziell für TEMs konzipiert, die mit einem Zwei-Kondensator-Linsensystem ausgestattet sind, wie den Thermo Fisher Scientific Talos Arctica und Glacios. Im Gegensatz zu Instrumenten mit einer dritten Kondensatorlinse (C3) beschränken diese Systeme die Bedingungen für parallele Beleuchtung auf einen einzigen, spezifischen Anregungswert der C2-Linse. Diese inhärente Einschränkung erfordert eine außergewöhnlich präzise Ausrichtung des Elektronenstrahls, um das Quellbild an der vorderen Brennfläche der oberen Objektivlinse zu positionieren – eine Voraussetzung für optimale Bildgebungsleistung. Unsere anschließenden Datenverarbeitungsergebnisse zeigen, dass nach dieser Ausrichtung die mit diesem 200-kV-Mikroskop erreichte Datenerfassungsqualität für die getesteten Proben nahezu vergleichbar mit der typischerweise erwarteten 300-kV-Instrumente ist.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti-Gitter	Najingdingxin	M04240922A	Verwendet zur Kryoprobenvorbereitung
Apoferritin	Biortus	BP17854-00A	Verwendet zur Kryoprobenvorbereitung
Kreuzgittergitter	Agar Scientific	AGS106	zur Bestimmung der parallelen Lichtbedingungen verwendet
Glacios2	Thermofischer	9959084	Verwendet für die Sammlung von Tomo-Daten
Filterpapier Nummer 2, 55 mm	Whatman	10311807	Löschpapier
PELCO easiGLOW	TED PELLA	91000-01020	Verwendet für Glüutladung
Quantifoil Cu-Gitter	Quantifoil	N1-C14nCu30-01	Verwendet zur Kryoprobenvorbereitung
Vitrobot Mark IV	Thermofischer	230101164	Verwendet zur Kryoprobenvorbereitung