Ein flexibles Verfahren zur Durchführung von Telomer-FISH und Immunfluoreszenz in Zellen, die fluoreszierende Proteine exprimieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Telomer-FISH (nativ oder denaturierend) mit Immunfluoreszenz und/oder Visualisierung eines fluoreszierenden Proteins.

Zusammenfassung

Die Visualisierung von Telomeren mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (TelFISH) ist seit langem ein wesentliches Werkzeug in Telomerbiologie-Experimenten. Die Kombination von TelFISH mit Immunfluoreszenz (IF) ist ebenfalls eine etablierte Methode (IF-TelFISH), z. B. bei der Identifizierung von Telomerdysfunktionsstörungen-induzierten Herden, bei denen Telomere mit 53BP1 kolokalisiert sind. In jüngerer Zeit hat sich natives Telomer-FISH (nTelFISH) zu einem wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der alternativen Verlängerung von Telomeren entwickelt, einem Telomererer-Erhaltungsmechanismus, der in einigen Tumorzellen verwendet wird. Die Expression fluoreszierender Proteine ist auch in der Zellbiologie ein wesentliches Werkzeug, da es die Visualisierung von Proteinen und Strukturen ermöglicht, die mit anderen Methoden möglicherweise nicht nachweisbar sind. Da FISH-Puffer Proteine denaturieren, führt die Durchführung des Assays in Zellen mit einem exprimierten fluoreszierenden Protein (FP) zu einem Verlust des FP-Signals. Eine Methode zur Integration von IF und Telomer FISH in Zellen mit einem exprimierten fluoreszierenden Protein, das das FP-Signal auch nach FISH erhält, wird hier beschrieben. Es werden Alternativen für denaturierende und native Telomer-FISH in Kombination mit mehreren IF- und FP-Szenarien bereitgestellt. Zusammengenommen bietet dieses Protokoll einen flexiblen Rahmen für die Erforschung der Telomerbiologie sowohl in normalen als auch in Tumorzellen.

Einleitung

Organismen mit linearen Chromosomen haben mit zwei Problemen zu kämpfen. Erstens erodieren die Enden der Chromosomen aufgrund des Problems der Endreplikation jedes Mal leicht, wenn DNA repliziert wird. Zweitens müssen Zellen in der Lage sein, natürliche DNA-Enden von DNA-Brüchen zu unterscheiden. Telomere haben sich als Lösung für diese Probleme entwickelt. Durch die Wirkung des Ribonukleoproteins Telomerase werden die Chromosomen beim Menschen durch die Zugabe von kurzen Tandemwiederholungen-TTAGGG verlängert. Diese Wiederholungen werden durch den Shelterin-Komplex gebunden, der das Chromosomenende vor der zellulären DNA-Schadensreparaturmaschinerie verbirgt¹. Kurze oder dysfunktionale Telomere führen zu zellulärer Seneszenz und Alterungsphänotypen², während die Flucht aus der Telomerkrise ein wichtiger Meilenstein in der Tumorentstehung^{ist 3}. Aus diesen Gründen ist die Telomerbiologie von besonderem Interesse für das Verständnis der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

Die Telomer-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist seit langem eine wichtige Methode, um Telomere in Interphase-Zellen oder Metaphasen-Spreads sichtbar^{zu machen 4}. Seit Jahrzehnten wird die Telomer-FISH mit der 53BP1-Immunfluoreszenzfärbung (IF) gekoppelt, um Telomerdysfunktionsstörungs-induzierte Herde (TIFs) zu identifizieren, einen Marker für dysfunktionale, unverschlossene Telomere ^5,6. In ähnlicher Weise ist ein Kennzeichen von Tumoren, die die alternative Verlängerung der Telomere (ALT) zur Telomerhaltung verwenden, die Assoziation von Telomeren mit nukleären PML-Körpern zur Bildung von ALT-assoziierten PML-Körpern oder APBs⁷. APBs können durch Paarung von Telomer-FISH- mit PML-IF-Färbung getestet werden. Damit ist IF-FISH ein etabliertes Werkzeug in der Telomerbiologie.

Hier wurde der Einsatz von IF-FISH in zweierlei Hinsicht erweitert. Zunächst wird IF-FISH an Zellen mit exprimierten fluoreszierenden Proteinen (FP) durchgeführt. Die Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen ist zu einem allgegenwärtigen Werkzeug in der Zellbiologie geworden. Die Expression eines markierten Proteins kann die einzige Möglichkeit sein, ein Protein sichtbar zu machen, für das es keine guten Antikörper gibt. Zum Beispiel zeigt der exprimierte GFP-markierte nukleare Aktin-Chromobody (nAC-GFP) die Dynamik des nuklearen Aktins⁸. Dieses Reagenz hat neue Möglichkeiten bei der Erforschung von nuklearem f-Aktin eröffnet, das einst als kontroverses Thema galt. Während FPs wie GFP und mCherry in der Regel die Fluoreszenzaktivität nach der Fixierung beibehalten, werden sie durch das Formamid in FISH-Hybridisierungspuffern dunkel⁹. Um dieses Problem zu umgehen, bietet dieses Protokoll die Innovation eines mit Fluorophoren markierten Anti-FP-"Boosters" im zweiten Schritt der IF-Färbung. Die Helligkeit des Fluorophors wird durch Formamid nicht beeinflusst, so dass IF-FP-FISH möglich ist.

Zweitens wird die IF in Verbindung mit nativem Telomer-FISH (nTelFISH) durchgeführt, einer wichtigen Diagnostik für den ALT-Status. Bei der Denaturierung von FISH muss man ein Verfahren verwenden, um die DNA-Stränge¹⁰ zu schmelzen (z. B. Hitze oder Alkali), was den Sondenzugang zu DNA ermöglicht, die normalerweise doppelsträngig ist. Im Gegensatz dazu beinhaltet natives FISH keinen Denaturierungsschritt, so dass die Sonde nur auf DNA zugreifen kann, die bereits einzelsträngig ist. Natives Telomer-FISH weist spezifisch einzelsträngige C-Strang-Telomerwiederholungen nach, ein weiteres Kennzeichen von ALT in Tumorzellen^11,12. Die Kopplung dieses Assays mit der IF-FP-Färbung ermöglicht es uns, neue Fragen zum Verständnis des Mechanismus von ALT zu beantworten, das heute als starker Kandidat für zielgerichtete Tumortherapien gilt.

Das hier beschriebene Protokoll kann nach dem Motto "Choose Your Own Adventure" verwendet werden, um eine beliebige Kombination aus IF, FP und entweder nativem oder denaturierendem Telomer-FISH zu färben. Da das Protokoll hochgradig konfigurierbar ist, kann der Zeitplan erheblich variieren. Im Allgemeinen ist an vier Tagen praktische Zeit erforderlich, aber diese Tage sind möglicherweise nicht aufeinanderfolgend. In Abbildung 1 sind Schätzungen der Zeit dargestellt, die für die Durchführung eines typischen denaturierenden FISH-Arbeitsablaufs erforderlich ist. Native FISH müssen nicht über Nacht hybridisiert werden, so dass man möglicherweise einen Schritt über Nacht (Kombination aus Tag 2 und Tag 3) eliminieren kann, wenn ein langer Tag auf der Bank machbar ist.

Ein typisches konfokales Mikroskop kann vier Farbkanäle abbilden: grob gesagt, blau, grün, rot und dunkelrot. Es werden vier Beispiele für mögliche vierfarbige Kombinationen demonstriert, aber die möglichen Permutationen sind endlos. Es ist möglich, zwei IF-Antikörper oder zwei exprimierte FPs mit gleichem Erfolg zu verwenden. Das Protokoll ist unkompliziert und robust. Jeder Antikörper, der von sich aus gute IF-Ergebnisse liefert, ist geeignet. Während hier nur Telomersonden für FISH enthalten sind, führt die Denaturierung von FISH mit einer Zentromersonde ebenfalls zu guten Ergebnissen. Damit bietet dieses Protokoll ein hohes Maß an Flexibilität bei der Beantwortung wichtiger Fragen der Kernbiologie.

Protokoll

Bevor Sie beginnen, betrachten Sie das Mikroskop, die FP-exprimierende Zelllinie und die verfügbaren Sonden und Antikörper. Blau wird typischerweise für eine DNA-Färbung wie DAPI verwendet, da blaue Fluorophore im Allgemeinen nicht hell sind. Bei Bedarf können blaue Sekundärantikörper verwendet werden. Wenn die Zellen GFP exprimieren, kann eine FISH-Sonde, die mit einem roten Fluorophor markiert ist, zusammen mit einem Sekundärantikörper gegen IF verwendet werden, der mit AF-647 markiert ist. Alternativ kann für die Bildgebung von Zellen, die mCherry exprimieren, ein IF-Sekundärantikörper mit AF-488 und eine mit AF-647 markierte FISH-Sonde ausgewählt werden. Beispiele für vier mögliche IF-FP-FISH-Kombinationen sind in Abbildung 2 dargestellt und sollen als Leitfaden dienen, um die Flexibilität des Versuchsdesigns zu fördern. Es ist wichtig, entweder natives oder denaturierendes FISH zu wählen, da diese Methoden nicht kombiniert werden können. Hier ist eine zuverlässige Methode zum Säurewaschen von Deckgläsern enthalten, um die Zelladhärenz zu ermöglichen. Dies kann jederzeit vor der Verwendung abgeschlossen werden, und sterile Deckgläser können unbegrenzt gelagert werden. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Säurewaschen von Deckgläsern

HINWEIS: Glasdeckgläser müssen gereinigt und mit Säure gewaschen werden, damit die kultivierten Zellen haften können. Für die Züchtung in 12-Well-Platten sind 18 mm runde Deckgläser ideal. Wenden Sie sich an die Mikroskopie-Kerneinrichtung, um festzustellen, ob #1 oder #1,5 Deckgläser bevorzugt werden. Die angegebenen Zeiten für die Reinigung von Deckgläsern sind nicht kritisch, sparen Sie aber nicht an der Säurewäsche.

1. Verwenden Sie eine Deckglaszange (Abbildung 3A), um Deckgläser so in die Gitter zu legen, dass sich ihre Oberflächen nicht berühren. Platzieren Sie bei Bedarf zusätzliche Deckgläser diagonal, um die Kapazität zu erhöhen (Abbildung 3B). Setzen Sie mehrere Gitter bequem in die Färbeschale ein (Abbildung 3C).
2. Füllen Sie die Fleckenschale mit Wasser und einer kleinen Menge Spülmittel. Senken Sie die Gitter mit den Deckgläsern vorsichtig in die Form ab.
3. Rühren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit einer Wippe oder einem Nutator in das Seifenwasser.
4. Heben Sie die Gitter mit den Deckgläsern aus der Färbeschale. Entsorgen Sie das Seifenwasser.
5. Spülen Sie die Färbeschale aus und füllen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie die Gitter mit den Deckgläsern wieder in das saubere Wasser und legen Sie sie auf eine Wippe, um sie 5 Minuten lang leicht zu rühren.
6. Wiederholen Sie die Spülung mit zwei weiteren Wechseln von sauberem, entionisiertem Wasser, also insgesamt drei Spülgänge.
7. Heben Sie die Gitter mit den Deckgläsern aus der Färbeschale. 1 N HCl in die Form geben.
   ACHTUNG: HCl ist ätzend. Greifen Sie mit einem Abzug und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung. Senken Sie die abgedeckten Deckgläser vorsichtig in die Säurelösung. Stellen Sie sicher, dass der 1 N HCl die Deckgläser vollständig bedeckt. Lege den Deckel auf die Färbeschale.
8. Stellen Sie die Färbeschale mit den Deckgläsern und der Säurelösung in den Tank eines Bad-Ultraschallgeräts. 15 min bei 55 °C beschallen.
9. Lassen Sie die Deckgläser über Nacht im Säurebad.
10. Nehmen Sie die Deckglasgestelle am nächsten Tag vorsichtig aus der Fleckenschale. Entsorgen Sie den 1 N HCl gemäß den institutionellen Sicherheitsprotokollen.
11. Spülen Sie die Färbeschale aus und füllen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie die Gitter mit den Deckgläsern wieder in das saubere Wasser und legen Sie sie auf eine Wippe, um sie 5 Minuten lang leicht zu rühren.
12. Wiederholen Sie die Spülung mit zwei weiteren Wechseln von sauberem, entionisiertem Wasser, für insgesamt drei Spülgänge.
13. Heben Sie die Gitter mit den Deckgläsern aus der Färbeschale. Leeren Sie die Schale und füllen Sie sie mit 70% Ethanol. Die Gitter mit den Deckgläsern wieder in die Schüssel legen und 5 Minuten lang vorsichtig rühren.
14. Heben Sie die Gitter mit den Deckgläsern aus der Färbeschale. Leeren Sie die Schale und füllen Sie sie mit 100% Ethanol. Die Gitter mit den Deckgläsern wieder in die Schüssel legen und 5 Minuten lang vorsichtig rühren.
15. Bringen Sie das Gericht mit 100% Ethanol und die Deckgläser zu einer Gewebekulturhaube. Entfernen Sie in der Haube die Gitter mit den Deckgläsern von der Schüssel und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
16. Leeren Sie die Schüssel und legen Sie die Gitter mit den Deckgläsern wieder hinein. Mit aufgesetztem Deckel lagern, um die Sterilität zu erhalten. Die Färbeschale ist nicht luftdicht; Wenn die Deckgläser in Ethanol belassen werden, verdunstet es schließlich. Die Deckgläser bleiben verwendbar.

2. Plattieren von Zellen auf Deckgläsern

HINWEIS: Der Umgang mit Deckgläsern erfordert Übung. Es ist einfacher, mit einer 6-Well-Platte zu beginnen, bis man sicher ist. Wenn Sie eine 6-Well-Platte verwenden, verdoppeln Sie das Spülvolumen, das für 12-Well-Platten angegeben ist.

1. Kultivieren Sie gesunde, wachsende Zellen, die das Protein von Interesse exprimieren, das mit GFP oder mCherry markiert ist (mehrere rote oder grüne FPs sind geeignet; siehe Anmerkungen in der Materialtabelle). In den gezeigten Beispielen werden U2OS-Osteosarkomzellen verwendet, die ALT zur Telomererhaltung verwenden.
   1. Verwenden Sie transient transfizierte Zellen oder Zelllinien mit stabiler FP-Expression. Wenn das Experiment eine medikamentöse Behandlung oder Transfektion erfordert, berücksichtigen Sie die gewünschte Konfluenz bei der Fixierung (typischerweise 70 %-80 %), die Behandlungsdauer und die Zellwachstumsrate, um die geeignete Anzahl von Zellen zu berechnen, die pro Deckglas platiert werden sollen.
2. Bereiten Sie Deckgläser in der Gewebekulturhaube vor, um die Sterilität zu erhalten. Geben Sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte 1 ml steriles PBS. Legen Sie mit einer Deckglaszange ein sauberes, mit Säure gewaschenes Deckglas in jede Vertiefung. Einige Sekunden lang vorsichtig mit der Hand rühren.
3. PBS ansaugen. Fügen Sie 1 ml frisches steriles PBS pro Vertiefung hinzu. Den Teller beiseite stellen.
4. (Fakultativ) Deckgläser mit Fibronektin beschichten, um die Zelladhäsion zu verbessern. Viele adhärente Zelllinien haften gut auf säuregewaschenen Deckgläsern, wenn sie vor der Fixierung mindestens 18 Stunden lang plattiert werden. Wenn Zellen nicht gut haften oder kurz nach dem Plattieren fixiert werden müssen, beschichten Sie Deckgläser, um die Haftung zu fördern.
   1. Bereiten Sie eine 5 μg/ml-Lösung von Fibronektin in sterilem PBS vor.
   2. Aspirieren Sie PBS von den Deckgläsern. Tragen Sie vorsichtig ca. 300 μl Fibronektinlösung auf jedes Deckglas auf und bilden Sie ein Tröpfchen, das von der Oberflächenspannung gehalten wird.
   3. Mehrere Stunden bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Spülen Sie mehrmals mit PBS und halten Sie die Deckgläser in einem letzten Wechsel von PBS. Legen Sie die Platte beiseite, während Sie die Zellen vorbereiten.
   5. Wenn Fibronektin nicht geeignet ist, sollten Sie Poly-L-Lysin, Kollagen oder Gelatine als Alternativen in Betracht ziehen.
5. Trypsinisieren Sie die Zellen und verdünnen Sie eine geeignete Anzahl in 12 ml Kulturmedium auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der gewünschten Zelldichte bei der Fixierung.
6. Aspirieren Sie PBS aus den Deckgläsern und fügen Sie 1 ml der Zellsuspension pro Vertiefung hinzu.
7. Legen Sie die Zellen in den Inkubator.
8. Behandeln Sie Zellen nach Bedarf mit Medikamenten, siRNAs oder anderen Reagenzien entsprechend dem Versuchsdesign. Wachsen Sie bis zur gewünschten Konfluenz.

3. IF-FP-Färbung

HINWEIS: Lassen Sie die Deckgläser während des gesamten Protokolls nicht austrocknen. Es ist ratsam, mit einer Hand zu pipettieren und mit der anderen Lösung zu aspirieren, damit Deckgläser so kurz wie möglich aus der Lösung herauskommen. Pipettieren Sie Lösungen vorsichtig gegen die Wand der Vertiefung, nicht direkt auf das Deckglas. Behandeln Sie Deckgläser fest, aber vorsichtig mit einer Pinzette. Es ist leicht, ein Deckglas zu brechen, wenn man es mit zu viel Kraft greift. Planen Sie zu Beginn doppelte Deckgläser für den Fall eines Bruchs ein. Mit der Erfahrung werden kaputte Deckgläser zu einem seltenen Ereignis. Deckgläser können nicht aus einem trockenen Brunnen entnommen werden. Deckgläser müssen mit Puffer bedeckt sein, damit sie aufgenommen werden können.

1. Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit dem Fixiermittel Ihrer Wahl. Ein Spülen der Zellen vor der Fixierung ist nicht erforderlich. Verwenden Sie 1 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte oder 2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte.
   1. Option 1: Verwenden Sie 4% Formaldehyd in PBS.
      ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig. Mit Handschuhen anfassen und ordnungsgemäß entsorgen. Frisch zubereiten mit 16 % methanolfreiem Formaldehyd und 10x PBS-Brühe. 15 min bei Raumtemperatur fixieren.
   2. Option 2: Verwenden Sie 4% Formaldehyd in Zytoskelettpuffer mit Saccharose (CBS).
      HINWEIS: Dieser Puffer wird bevorzugt zur Erhaltung der Zytoskelettstruktur¹³ verwendet. CBS hat eine Endkonzentration von 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA und 0,32 M Saccharose. Zur Herstellung des Fixiermittels stellen Sie eine 2x CBS-Brühe mit 20 mM MES pH 6,1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA her. Bereiten Sie eine separate Brühe von 1,28 M Saccharose vor. Beide Bestände bei 4 °C lagern. Mischen Sie für frisch arbeitendes Fixiermittel 1 Volumen 16 % methanolfreies Formaldehyd, 1 Volumen Saccharose-Brühe und 2 Volumen 2x CBS-Brühe. 15 min bei Raumtemperatur fixieren.
   3. Option 3: Mit -20 °C Methanol fixieren. Empfohlen für Nukleinsäure-Antikörperziele (z. B. ssDNA, G-Quadruplexe, RNA-DNA-Hybride). 5 min bei -20 °C fixieren.
2. Fixiermittel aspirieren und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.
3. Deckgläser mehrmals mit PBS spülen.
   1. STOPPPUNKT: Feste Deckgläser können mehrere Tage lang bei 4 °C mit minimalem Signalverlust in PBS gelagert werden. Für eine längere Lagerung auf 100 % Ethanol dehydrieren (2 min in 70 % Ethanol, 2 min in 90 % Ethanol, in 100 % Ethanol lagern), die Platte mit Laborfolie versiegeln und bei -20 °C lagern. Deckgläser können auf diese Weise über Wochen bis Monate aufbewahrt werden. Wenn Sie bereit zum Färben sind, rehydrieren Sie Deckgläser (2 min in 90 % Ethanol, 2 min in 70 % Ethanol, 15 min in PBS) und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
4. Permeabilisieren Sie die Deckgläser in 0,5 % Triton X-100 in PBS für 5 min bei 4 °C. Führen Sie diesen Schritt in der Platte aus.
5. Deckgläser mehrmals mit PBS spülen.
6. Bereiten Sie die Befeuchtungskammer vor (Abbildung 3D). Lege feuchte Papiertücher auf den Boden der Kammer. Um eine Stütze für die Färbung zu erstellen, beschriften Sie die Oberseite eines Deckels von einer 12-Well-Platte so, dass sie den Deckgläsern entspricht.
   1. Decken Sie den Deckel mit Laborfolie ab, damit die Etiketten sichtbar bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Kammer mit einem eng anliegenden Deckel lichtdicht ist. Bei Bedarf mit Folie abdecken (Abbildung 3E).
7. Pipettieren Sie 75 μl Tropfen mit 100 μg/ml RNase A in PBS auf den markierten Träger. Nehmen Sie vorsichtig jedes Deckglas auf und tupfen Sie die Kante auf das Laborgewebe, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Deckgläser auf die RNase A-Tropfen umdrehen (mit der Zellseite nach unten). Stellen Sie die Halterung in die befeuchtete Kammer und schließen Sie den Deckel. 45 min bei 37 °C inkubieren.
8. Gib frisches PBS auf die 12-Well-Platte. Legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben wieder auf die Platte. Mehrmals mit PBS spülen.
9. 30 min oder länger bei Raumtemperatur blockieren. Wischen Sie die RNase-Lösung von der mit Folie bedeckten Unterlage ab. Pipettieren Sie 75 μl Tropfen mit 20 % Eselsserum in PBS auf die Folie. Deckgläser auf den Blockierpuffer umdrehen (mit der Zellseite nach unten).
10. Bereiten Sie den primären Antikörper vor.
    1. Verwenden Sie 75 μl pro Deckglas. Bereiten Sie 10 % extra vor, um Pipettierfehler auszuschließen.
    2. Verdünnen Sie den Antikörper in 5% Eselserum. Antikörperverdünnungen empirisch bestimmen. Eine Verdünnung von 1:100 ist ein vernünftiger Ausgangspunkt.
    3. Bereiten Sie während der Blockierung einen zweiten markierten Träger für die Inkubation des primären Antikörpers vor. Decken Sie den Deckel mit einer Folie ab und tragen Sie 75 μl Tropfen des verdünnten Antikörpers an den dafür vorgesehenen Stellen auf.
11. Am Ende des Blockierungsschritts übertragen Sie Deckgläser auf die Antikörpertröpfchen (mit der Zellseite nach unten). Stellen Sie die Stütze in die befeuchtete Kammer, schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie sie mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
12. Gib frisches PBS auf die 12-Well-Platte. Legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben wieder auf die Platte. In PBS dreimal für jeweils 5 min bei Raumtemperatur waschen und dabei schaukeln.
13. Bereiten Sie während der abschließenden Wäsche Sekundärantikörper vor.
    1. Verwenden Sie 75 μl pro Deckglas. Bereiten Sie 10 % extra vor, um Pipettierfehler auszuschließen.
    2. Für fluoreszierende Sekundärantikörper und GFP/RFP-Booster-Antikörper wird eine Verdünnung von 1:400 empfohlen. Passen Sie es nach Bedarf an, basierend auf den Erfahrungen mit dem Ziel.
    3. Verdünnen Sie Sekundärantikörper in 5% Eselserum. Tragen Sie 75 μl Tropfen auf die entsprechenden Stellen auf dem beschrifteten Träger auf.
14. Nach dem Waschen werden Deckgläser auf die sekundären Antikörpertröpfchen übertragen (mit der Zellseite nach unten). Mindestens 30 min bei Raumtemperatur in der verschlossenen befeuchteten Kammer inkubieren.
15. Gib frisches PBS auf die 12-Well-Platte. Legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben wieder auf die Platte. In PBS dreimal für jeweils 5 min bei Raumtemperatur waschen und dabei schaukeln.

4. Refixieren und Dehydrieren

1. Bereiten Sie 4% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für die Refixierung vor. Verwenden Sie für diesen Schritt Formaldehyd, auch wenn Methanol für die Erstfixierung verwendet wurde. Entfernen Sie die letzte PBS-Wäsche und fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang unter leichtem Schaukeln.
2. Aspirieren Sie das Fixiermittel und entsorgen Sie es in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien.
3. Spülen Sie die Deckgläser mehrmals mit PBS aus.
4. Dehydrieren Sie die Deckgläser und trocknen Sie sie an der Luft, um sie für die Hybridisierung vorzubereiten:
   1. 2 min in 70%igem Ethanol inkubieren.
   2. 2 min in 90%igem Ethanol inkubieren.
   3. 2 min in 100% Ethanol inkubieren.
   4. Nach 100 % Ethanol legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben auf beschriftetes Filterpapier, um die Ausrichtung beizubehalten. Lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen, während Sie die FISH-Sonde vorbereiten.

5. FISCH (OPTION 1): DENATURIERUNG FISCH

1. Bereiten Sie zwei Folienstützen vor (siehe Abbildung 3F).
   1. Falten Sie ein Stück Alufolie in Viertel, um vier Schichten zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die stumpfe Seite nach außen zeigt.
   2. Schneiden Sie die gefaltete Folie so ab, dass sie in den Deckel einer 12-Well-Platte passt. Reiben Sie die Folie mit einem Labortuch gegen die Innenseite des Deckels, so dass die Rillen des Deckels ein Muster auf die Folie prägen. Dadurch entstehen Rillen, die verhindern, dass die Deckgläser bei den nachfolgenden Schritten ineinander rutschen.
   3. Bereiten Sie zwei solcher Stützen vor. Sie können abgewischt und in späteren Experimenten wiederverwendet werden.
2. Verdünnen Sie die 10-μM-Sonde 1:50 in Hybridisierungspuffer (70 % deionisiertes Formamid, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5 % 10 × Roche-Blockierungslösung). Verwenden Sie 75 μl dieser verdünnten Sonde pro Deckglas und bereiten Sie 10 % extra vor, um den Pipettierverlust auszugleichen. Die endgültige Sondenkonzentration sollte 200 nM betragen.
3. Heizen Sie einen Heizblock auf 90 °C und einen Thermocycler auf 85 °C vor.
4. Deckgläser denaturieren: Luftgetrocknete Deckgläser mit der Zellseite nach oben auf einen der vorbereiteten Folienträger legen. Legen Sie die Folie vorsichtig auf den Thermocycler-Block und schließen Sie den Deckel. 5 Minuten inkubieren, um zu denaturieren.
5. Gleichzeitig wird die verdünnte Sonde im Heizblock 5 min lang auf 90 °C erhitzt.
6. Pipettieren Sie 75 μl Tropfen der denaturierten Sonde auf den zweiten vorbereiteten Folienträger. Stellen Sie sicher, dass die stumpfe Seite der Folie nach oben zeigt, damit sich gut geformte Tröpfchen bilden können. Wenn die glänzende Seite nach oben zeigt, breitet sich die Sonde aus und verliert an Oberflächenspannung.
7. Drehen Sie die vergällten Deckgläser auf die Sondentropfen und legen Sie sie mit der Zelle nach unten.
8. Den Folienträger mit Sonde und Deckgläsern in den auf 85 °C eingestellten Thermocycler-Block übertragen und 5 min inkubieren. Verwenden Sie einen Spatel, um die Übertragung zu unterstützen. Bewegen Sie sich mit Vorsicht, um ein Anstoßen oder Verschieben der Deckgläser zu vermeiden.
9. Schieben Sie die Folie mit Deckgläsern und Sonde in eine befeuchtete Kammer. Mit dem Deckel abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.

6. FISCH (OPTION 2): Heimischer FISCH

1. Verdünnen Sie die 10-μM-Sonde 1:200 in Hybridisierungspuffer (70 % deionisiertes Formamid, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5 % 10× Roche-Blockierungslösung). Die endgültige Sondenkonzentration beträgt 50 nM. Verwenden Sie 75 μl pro Deckglas und bereiten Sie 10 % extra vor, um Pipettierfehler auszuschließen.
2. Tragen Sie 75 μl Tropfen der verdünnten Sonde auf die dafür vorgesehenen Stellen auf dem mit Folie bedeckten Träger auf.
3. Drehen Sie die vergällten Deckgläser auf die 75 μl starken Sondentropfen um und legen Sie sie mit der Zellseite nach unten.
4. Legen Sie die Stütze in eine befeuchtete Kammer und schließen Sie den Deckel. Mindestens 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Inkubation kann auf Wunsch auf Nacht verlängert werden.

7. Waschen und Montage

HINWEIS: Das optimale Einbettmedium hängt von der numerischen Apertur des Mikroskopobjektivs ab. Wenden Sie sich an die örtliche Mikroskopie-Kerneinrichtung, um Empfehlungen zu erhalten. Eine geeignete Wahl kann ProLong Glass mit NucBlue sein, das einen Brechungsindex von 1,52 hat. Je nach Mikroskop kann jedoch ein alternatives Eindeckmedium besser geeignet sein.

1. Legen Sie die Deckgläser zum Waschen wieder auf die 12-Well-Platte. Drehen Sie sie so um, dass sie mit der Zellseite nach oben zeigen.
2. 3× 10 min in 70 % Formamid/10 mM Tris, pH 7,5 waschen.
   ACHTUNG: Formamid ist giftig; Entsorgen Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien.
3. 3× 5 min in TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05 % Tween-20, pH 7,5) waschen.
4. Mehrmals in PBS spülen. Wenn ein DNA-Fleck nicht im Eindeckmedium enthalten ist, sollten Sie in Erwägung ziehen, DAPI in der letzten Wäsche hinzuzufügen. Um mit DAPI zu färben, geben Sie 300 nM DAPI zu PBS, tragen Sie es auf Deckgläser auf und inkubieren Sie es 5 Minuten lang. Entsorgen Sie die DAPI-Lösung gemäß den institutionellen Richtlinien.
5. Montieren Sie Deckgläser mit einem Tropfen Eindeckmedium auf Objektträger. Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf den Tropfen umdrehen.
6. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten, bevor Sie es aufnehmen.

Ergebnisse

Typische Ergebnisse dieses Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt. Bei richtiger Ausführung wird die Zellmorphologie gut erhalten bleiben, und die Fluoreszenzsignale sind hell. Die Denaturierung des Telomers FISH sollte ein Muster von Dutzenden von Punktzahlen in jedem Zellkern aufzeigen, die jedes Telomer repräsentieren (siehe Abbildung 4, Beispiele 1 und 2). Telomerherde sollten fast ausschließlich im Zellkern vorhanden sein, obwohl es manchmal zu zytoplasmatischen Telomerfärbungen kommt, insbesondere bei ALT-Zelllinien. Die daraus resultierenden Telomersignale neigen dazu, extrem hell zu sein, so dass darauf geachtet werden muss, dass das Telomersignal nicht in andere Nachweiskanäle blutet. In ALT-Zelllinien clustern sich Telomere häufig an PML-Körpern¹⁴, was zu weniger Herden führt, als normalerweise zu erwarten wäre. Diese Clusterbildung ist in Abbildung 4, Beispiel 2 zu sehen.

In Zelllinien, die ALT zur Telomererhaltung verwenden, weist natives Telomer-FISH die telomerische ssDNA nach, die ein Kennzeichen von ALT^11,12 ist. Es wird nicht erwartet, dass jeder Zellkern Telomer-ssDNA aufweist oder dass mehr als eine kleine Anzahl von Puncta in einem einzigen Zellkern vorhanden ist (siehe Abbildung 4, Beispiele 3 und 4). Das native Telomer-FISH-Signal ist nicht so hell wie das denaturierende Telomer-FISH. Die Osteosarkom-Zelllinie U2OS ist eine gute Positivkontrolle für native FISH. Es ist nicht zu erwarten, dass Telomer-ssDNA in Zelllinien mit Telomeren beobachtet wird, die durch Telomerase aufrechterhalten werden.

Sowohl bei denaturierenden als auch bei nativen FISH ist eine starke nukleoläre Fluoreszenz künstlich. Wenn ein übermäßiges nukleoläres Signal beobachtet wird, versuchen Sie, eine frische Lösung von RNase A zu verwenden oder die Behandlung mit RNase A¹⁵ zu verlängern (Protokollschritt 3.8). Für native Telomer-FISH-Experimente mit Zellen mit unbekanntem ALT-Status wird eine positive ALT-Zelllinie wie U2OS zur Kalibrierung der Nachweiseinstellungen verwendet.

Beobachtungen von FPs in IF-FP-FISH-Experimenten können zur Validierung leicht mit Experimenten zur Bildgebung lebender Zellen verglichen werden. Wenn Unstimmigkeiten festgestellt werden, versuchen Sie, die Fixierungsbedingungen zu variieren. Die Fixierung in CSB-Puffer (Protokollschritt 3.1.2) kann für die Erhaltung zellulärer Strukturen von Vorteil sein und eine genauere FP-Lokalisierung ermöglichen¹³.

Die Immunfluoreszenzfärbung variiert stark je nach Protein, das von Interesse ist. Die IF-Ergebnisse sollten mit Proben verglichen werden, die ohne FISH hergestellt wurden, um den Einfluss des FISH-Protokolls auf die Lokalisation und Intensität des interessierenden Proteins zu bewerten. Im Allgemeinen eignen sich IF-FP-FISH-Experimente zur Zählung von Brennpunkten, aber die Intensitäten sind möglicherweise nicht quantitativ⁶.

Abbildung 1: Beispiel-Workflow mit geschätzter Dauer. Ein zusätzlicher Tag kann erforderlich sein, wenn die Inkubation des Primärantikörpers über Nacht durchgeführt wird. Im Falle von nativen FISH werden manchmal die Tage 2 und 3 kombiniert, obwohl dies zu einer längeren Laborzeit führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche experimentelle Kombinationen, die mit der Vierfarbenbildgebung verwendet wurden. Die Beispiele 1 und 2 zeigen die Denaturierung von Telomer-FISH, während 3 und 4 natives FISH verwenden. Beachten Sie, dass dieses Protokoll nützlich ist, unabhängig davon, ob es zwei Zielproteine immunfärbt (Beispiel 1), eine FP- und eine IF-Färbung kombiniert (Beispiele 2 und 4) oder zwei FPs (Beispiel 3). Repräsentative Ergebnisse für diese Versuche sind in Abbildung 4 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: In diesem Protokoll verwendete Geräte. (A) Pinzette des Deckglases. Während gerade Pinzetten für die Handhabung von Deckgläsern verwendet werden können, erleichtern abgewinkelte Deckglaszangen die Aufgabe erheblich. (B) Deckgläser, die zum Waschen in Racks gestellt werden. Beachten Sie, dass Deckgläser nicht nur gerade quer angeordnet werden, sondern auch zwischen benachbarten Rillen abgewinkelt sind, um die Kapazität zu erhöhen. (C) Vier Racks mit Deckgläsern in einer Färbeschale. Eine Glasfärbeschale fasst Dutzende von Eindeckgläsern und ist unempfindlich gegen die HCl-Säurewäsche. (D) Eine vorbereitete befeuchtete Kammer. Die Außenseite ist mit Folie überzogen, um eine dunkle Umgebung zu schaffen und die Fluorophore zu erhalten. Feuchte Papiertücher am Boden sorgen für Feuchtigkeit. (E) Die versiegelte Befeuchtungskammer. Ein dicht schließender Deckel ist unerlässlich, um ein Austrocknen zu verhindern. (F) Herstellung der Aluminiumfolienstütze. Prägerippen auf der beschnittenen Folie helfen, ein Ineinanderrutschen der Deckgläser während des Denaturierungsschritts zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Vierkanal-Bildgebungsexperimenten, einschließlich IF, FISH und exprimierten FPs. Die Tafeln zeigen die tatsächlichen Ergebnisse der in Abbildung 2 beschriebenen Experimente. DAPI färbt DNA, nAC-GFP markiert nukleäres f-Aktin, TelFISH und TRF2-mCherry markieren Telomere, PML-Immunfärbung markiert nukleäre PML-Körper und nTelFISH zeigt telomere ssDNA. Alle Zellen sind U2OS-Osteosarkomzellen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit Superauflösungsfähigkeit aufgenommen. Die Bilder von Beispiel 1 wurden mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie aufgenommen; alle anderen Bilder wurden mit Structured Illumination Microscopy aufgenommen. Alle Maßstabsbalken stehen für 5 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Experimente mit IF-FISH sind seit langem eine tragende Säule auf dem Gebiet der Telomere als Assay für Telomerstress oder den Nachweis von ALT ^5,6,16. Hier wird das Protokoll um ein fluoreszierendes Protein erweitert. Zusätzlich wird die Option des nativen Telomers FISH als orthogonaler ALT-Assay¹¹ angeboten. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und liefert zuverlässig zufriedenstellende Ergebnisse.

Durch die Arbeit auf Deckgläsern mit Tröpfchen von Antikörpern oder PNA-Sonden ist dieses Protokoll so konzipiert, dass es sparsam ist. Durch die Verwendung von Tröpfchen werden wertvolle Reagenzien gespart. Im Gegensatz dazu sind Alternativen wie Kammerschlitten teuer und bieten weniger Flexibilität. Während der Umgang mit Deckgläsern Übung erfordert, um Kenntnisse zu entwickeln, lohnt sich die Zeitinvestition aufgrund der Kosteneinsparungen. Es ist zu beachten, dass Reagenztröpfchen, die größer als 75 μl sind, nicht empfohlen werden. Größere Tröpfchen lassen die Deckgläser einfach verrutschen und verbessern das Ergebnis nicht.

Die Expression von nAC-GFP ist ein unverzichtbares Werkzeug für die Visualisierung von nukleärem f-Aktin⁸, wie in Abbildung 4 zu sehen ist. Es gibt viele weitere markierte Reagenzien, die helfen können, wichtige biologische Fragen zu beantworten. Zum Beispiel kann das FUCCI-Plasmidsystem verwendet werden, um den Zellzyklus zu visualisieren, und unter Verwendung dieses Protokolls könnte es mit dem Telomer FISH¹⁷ kombiniert werden. Ein anderer Ansatz zur Untersuchung des Zellzyklus könnte den PCNA-Chromobody verwenden, um Zellzyklusinformationen zu gewinnen¹⁸. Je nachdem, welche Frage gestellt wird, sind viele FP-markierte Reagenzien im Handel erhältlich.

Hier wird dieses Protokoll mit Telomer-FISH demonstriert, aber auch mit Zentromer-FISH wurden erfolgreiche Ergebnisse erzielt, wobei eine PNA-Sonde bei gleicher Konzentration verwendet wurde. Es ist beispielsweise möglich, eine FAM-markierte Zentromersonde mit einer Cy3-markierten Telomersonde zu multiplexen. Es ist wichtig zu betonen, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Protokoll mit Single-Locus-DNA-FISH funktioniert. Für die Sondierung eines einzelnen Locus ist ein Proteaseaufschluss der Probe erforderlich, und dieser Aufschluss ist eindeutig nicht mit dem ZF- oder FP-Nachweis vereinbar¹⁹. Bei der Kombination von IF und mRNA-FISH mit einem ähnlichen Ansatz wurde jedoch Erfolg erzielt. Offensichtlich muss der RNase-Behandlungsschritt in diesem Szenario weggelassen werden.

Schließlich ist offensichtlich, dass das native Telomer FISH schnell zu einem essentiellen Assay für den ALT-Status wird ^20,21 . Im Gegensatz zum C-Kreis-Assay für ALT, der populationsbasiert^{ist 22}, liefert das native Telomer FISH eine ALT-Auslesung auf zellulärer Ebene, was eine empfindliche Detektion von Veränderungen der ALT-Dynamik ermöglicht. Durch die Vereinigung des nativen Telomers FISH mit der IF- und FP-Expression können wichtige Einblicke in den ALT-Mechanismus gewonnen werden. Wir hoffen, dass diese Erkenntnisse mit der Zeit zu zielgerichteten Therapeutika für Tumore führen werden, die für die Telomererhaltung auf ALT angewiesen sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 % Tween-20	Bio-Rad	1610781	Verwerfen, wenn die Lösung trüb ist.
10x PBS	Gibco	70011044	Zur Herstellung von Fixiermitteln und anderen Puffern verwenden Sie die Nachfixierung
12-Well-Zellkulturplatten	Nunc	150628
16% methanolfreies Formaldehyd	Thermo Scientifc	28908
5 M Natriumchlorid	Millipore Sigma	Nr. S6546
Adhärente Zellen, z.B. U2OS-Osteosarkomzellen	ATCC	HTB-96
Luftdichte Box für befeuchtete Kammer	Mepal	106415032500	Jede geeignete luftdichte Schachtel funktioniert, aber Vorsicht vor Kästen mit unebenem Boden.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
Alufolie	Fisher Scientific	01-213-100
Geeignetes Zellkulturmedium, z.B. McCoy's 5A	Gibco	16600082	für U2OS, fügen Sie 15% FBS hinzu
Zentromersonde (FAM)	PNA Biografie	Nr. F3001	Es stehen mehrere Fluorophore zur Verfügung
ChromoTek Nukleares Aktin-Chromobody-Plasmid (TagGFP)	Proteintech-Technologie	ACG-N
Deckglas-Zange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	11251-33
Eindeckglas-Gestelle	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	Nr. D21490	Optional, falls das Einbettmedium keinen DNA-Fleck enthält
Esel-Serum	Jackson Immunforschung	017-000-121
EGTA (EGTA)	Bio-Welt	40520008	0,5 M Lösung pH 8,0
Ethanol	Warner-Graham	200 Polierte Platte
Fötales Rinderserum	Gibco	A5670801
Fibronektin	Millipore Sigma	Nr. F0635	Zur optionalen Beschichtung von Deckgläsern
Formamid	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: 47671-250ML-F
Deutsche Glasdeckgläser	Warner Insruments	64-0714	CS-18R15 (#1,5 Dicke, bestätigen Sie, dass dies für Ihr Mikroskop geeignet ist)
GFP-Verstärker	Proteintech-Technologie	gb2AF488	erkennt GFP/mClover/YFP/Venus und andere.  Eine umfassende Liste finden Sie in den Produktinformationen
Glasbeizschale mit Deckel	Millipore Sigma	900203
Beheizter Ultraschallreiniger mit digitalem Timer	Branson	CPX-952-218R	Dieses Modell des Badsonicators umfasst Wärme, verfügt jedoch nicht über eine konfigurierbare Leistung oder Intensität.
Salzsäure	Millipore Sigma	258148	Konzentrierter HCl beträgt 12 N. Fügen Sie 20 mL konzentriertes HCl zu 220 mL deionisiertem Wasser für 1 N HCl hinzu
Magnesiumchlorid-Lösung	Millipore Sigma	63069	1 M Lösung
MES	Millipore Sigma	475893
Methanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	USA Wissenschaftlich	3023-4526
Kaliumchlorid	Millipore Sigma	Nr. P9541
Primärer Antikörper  Anti-PML für Maus	Santa Cruz	SC-377390
Primärer Antikörper  Kaninchen Anti-53BP1	Novus	NB100-904
Primärer Antikörper  Kaninchen Anti-PML	ABklonal	Nr. A1184
Glas verlängern mit NucBlue	Invitrogen	Nr. P36981
RFP-Verstärker	Proteintech-Technologie	rb2AF568	erkennt mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Eine umfassende Liste finden Sie in den Produktinformationen
RNAse A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Roche Blockierungslösung	Millipore Sigma	11096176001
Sekundärantikörper z.B. AF488 Anti-Maus	Invitrogen	Nr. A-11001	Oder ähnlich
Sekundärantikörper z.B. AF594 Anti-Kaninchen	Invitrogen	Nr. A-11012	Oder ähnlich
Sekundärantikörper z.B. AF647 Anti-Maus	Invitrogen	Nr. A-21235	Oder ähnlich
Spatel	Fisher Scientific	10257402
Steriles PBS	Gibco	14190144	Zur Vorbereitung von Deckgläsern
Saccharose	Millipore Sigma	Nr. S0389
TelC-Sonde (Cy3)	PNA Biografie	Nr. F1002	Es stehen mehrere Fluorophore zur Verfügung
TelG-Sonde (AF647)	PNA Biografie	Nr. F1014	Es stehen mehrere Fluorophore zur Verfügung
Tris Basis	Millipore Sigma	648311	1 M Lösung in Wasser herstellen, pH-Wert mit HCl einstellen
triton X-100	Millipore Sigma	X100
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	Gibco	25200072
Zeiss Elyra Mikroskop	Zeiss		Oder ähnlich