Massively Parallel Splicing Assay zur Untersuchung von Spleißfehlern, die durch krankheitsbedingte intronische Varianten verursacht werden

Summary

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung von massiv parallelen Spleiß-Assays (MaPSy) vor, bei denen minigene Konstrukte verwendet werden, um intronische Varianten in großen Mengen systematisch zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse von varianteninduzierten Spleißveränderungen in Zellen durch Amplikon-Sequenzierung und ermöglicht so funktionelle Bewertungen ihrer Auswirkungen auf das prä-mRNA-Spleißen.

Abstract

Spleißfehler machen 10-30% der pathogenen Mutationen aus, die für seltene genetische Störungen verantwortlich sind. RNA-Spleißen gewährleistet eine korrekte Genexpression, indem Exons selektiv verbunden und Introns entfernt werden, wobei sich wichtige regulatorische Sequenzen in den Introns befinden. Die 5'-Spleißstelle und die Verzweigungsstelle interagieren mit kleinen nukleären RNAs, um den Erkennungskomplex des Spleißosoms zu bilden, während Elemente wie der Polypyrimidin-Trakt und Spleißverstärker/-dämpfer Proteine rekrutieren, um die Spleißosomenassemblierung zu regulieren. Die Vorhersage von Spleißstörungen durch intronische Varianten ist aufgrund der Komplexität dieser Wechselwirkungen eine Herausforderung.

Intronische Varianten, die 90 % der natürlichen menschlichen Genvariationen ausmachen, können das kanonische Spleißen stören und zu Krankheiten führen. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, haben wir einen Massively Parallel Splicing Assay (MaPSy) entwickelt, um patientenidentifizierte intronische Varianten zu bewerten. Synthetisierte Oligonukleotide mit Referenz- oder Variantensequenzen wurden zu Spleiß-Minigenen ligiert, die Promotor- und Polyadenylierungssignale enthalten. Jedes Konstrukt enthielt zwei konstante Exons, die ein mittleres Exon flankierten, das die variable Intron-Exon-Übergangssequenz von Interesse beherbergte. Die zelluläre Spleißeffizienz der Variantensequenzen wurde mit Referenz-Pendants verglichen, was es uns ermöglichte, signifikante Störungen als Spleißvarianten zu identifizieren.

Die Ergebnisse des MaPSy können durch zusätzliche Ansätze, wie z.B. Minigen-Assays oder CRISPR-vermittelte Genom-Editierung in vivo, validiert werden. Darüber hinaus kann die aggregierte Analyse der gestörten Verbindungen tiefere Einblicke in die Spleißmechanismen und die molekularen Grundlagen von Krankheiten liefern, die mit Spleißfehlern einhergehen.

Introduction

RNA-Spleißen ist ein entscheidender Prozess, der Exons für die Translation verbindet und Introns entfernt, wodurch der RNA-Export erleichtert und die Nukleinsäure-Homöostase aufrechterhalten wird. Dieser streng regulierte Mechanismus funktioniert zeitlich und räumlich und trägt zur Vielfalt und Komplexität des Transkriptoms^{bei 1}. Das Spleißen wird durch Schlüsselsignale gesteuert, einschließlich der 5'-Spleißstelle (5'ss), der Verzweigungsstelle und der 3'-Spleißstelle (3'ss), zusammen mit zusätzlichen regulatorischen Elementen wie dem Polypyrimidin-Trakt stromabwärts der Verzweigungsstelle und der AG-Dinukleotid-Ausschlusszone, die die 3's-Erkennung unterstützen². Mechanistisch paart sich die kleine nukleäre RNA (snRNA) von U1 mit den 5ss, während die Verzweigungsstelle mit der U2 snRNA³ interagiert. Die koordinierte Aktivität der Verzweigungsstelle, des Polypyrimidin-Trakts und des 3'ss erleichtert die Bindung von U2-Kleinnukleoproteinen (snRNPs) und U2-Hilfsfaktoren, stabilisiert das Spleißosom und positioniert den Verzweigungspunkt für den nukleophilen Angriff auf die 5'ss, wodurch das Spleißen eingeleitet wird.

Mit der rasanten Weiterentwicklung der Sequenzierungstechnologien sinken die Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms weiter, was zu einem ständig wachsenden Katalog menschlicher genetischer Varianten führt. Es wird geschätzt, dass 10-30% der krankheitsassoziierten Mutationen bei seltenen genetischen Erkrankungen das RNA-Spleißen beeinflussen ^4,5,6 und oft aberrante Genprodukte produzieren, die als therapeutische Ziele dienen können. Die Bewertung der funktionalen Auswirkungen von intronischen Varianten bleibt jedoch aufgrund der Komplexität der Spleißsignale, die oft redundant und degeneriert sind, eine Herausforderung. Während die 5'- und 3'-Spleißstellen relativ gut charakterisiert sind, weisen Verzweigungsstellen, Polypyrimidin-Trakte und andere spleißregulatorische Elemente in höheren Eukaryoten eine beträchtliche Sequenz- und Positionsvariabilität auf. Groß angelegte Kartierungsstudien haben außerdem gezeigt, dass innerhalb eines einzigen Introns 7,8,9,10 mehrere Verzweigungsstellen existieren können, was die Interpretation von Intron-Exon-Grenzvariationen erschwert.

Deep Learning wurde eingesetzt, um zu bewerten, wie primäre Sequenzen zur Erkennung von Spleißstellen beitragen ^4,11,12, wobei gezeigt wurde, dass sich Spleißvarianten an kanonischen Spleißstellen häufen, während sie sich spärlich in das Exon und die 3'-Region von Introns erstrecken. Dieses Muster stimmt mit dem etablierten Verständnis überein, dass die Auswahl der 5'-Spleißstelle in erster Linie durch Konsensussequenzen bestimmt wird, während die Erkennung der 3'-Spleißstelle von zusätzlichen intronischen Elementen, wie z. B. Verzweigungsstellen und Polypyrimidin-Trakten, abhängt. Bestehende Modelle wurden jedoch so trainiert, dass sie konstitutive Spleißstellen von alternativen oder künstlichen unterscheiden, anstatt sich speziell auf intronische Varianten zu konzentrieren. Infolgedessen zeigen diese Berechnungswerkzeuge nur eine mäßige Vorhersagegenauigkeit, wobei sie hauptsächlich Spleißstellen und exonische Spleißvarianten identifizieren 13,14,15,16. Zusätzlich zu prädiktiven Modellen würde ein experimentelles System, das in der Lage ist, Spleißvarianten in großen Mengen zu validieren, die Identifizierung und Charakterisierung von Spleißdefekten erheblich verbessern.

Umfassende RNA-Sequenzierungsdaten, die krankheitsassoziierte intronische Varianten mit Spleißphänotypen in Verbindung bringen, sind aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der Schwierigkeit, Spleißergebnisse aus vorhandenen Datensätzen vorherzusagen, nach wie vor rar. Um diese Lücke zu schließen, wurden Hochdurchsatz-Spleiß-Assays und Computermodelle entwickelt, um Spleißvarianten systematisch zu analysieren. Massively Parallel Splicing Reporter Assays (MaPSy) wurden entwickelt, um den Einfluss variabler Sequenzen auf die Auswahl der Spleißstellen zu bewerten. Durch die Einbeziehung von Sequenzvariationen in der Nähe der 5'- und 3'-Spleißstellen oder über ganze Intron-Exon-Regionen innerhalb eines festen Minigen-Rückgrats ermöglicht MaPSy eine funktionelle Bewertung von Spleißveränderungen. Aufgrund der Einschränkungen der Bulk-Oligonukleotidsynthese werden tiefe intronische Varianten und Pseudo-Exon-Aktivierung in diesem Ansatz jedoch nicht erfasst.

Die Robustheit von MaPSy wurde unter Verwendung von 70 unabhängigen Spleiß-Minigenen validiert, was zu einer Pearson-Korrelation von 0,89¹⁷ führte. Bemerkenswert ist, dass etwa 90 % der Spleißspendervarianten (+1 und +2) Spleißdefekte aufwiesen, was die Genauigkeit des Assays unterstreicht. Darüber hinaus hat MaPSy mit randomisierten Verzweigungsstellensequenzen die degenerierte Natur der Verzweigungsstellenerkennung und ihre Abhängigkeit von U2-Kernproteinen aufgedeckt¹⁸. Darüber hinaus wurde ein Split-GFP-MaPSy-Design in Verbindung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) verwendet, um Exon-Skipping-Ereignisse zu untersuchen, die durch genetische Variationen verursacht werden. Dieser Ansatz zeigte, dass sich 54 % der spleißstörenden Varianten in intronischen Regionen befinden, einschließlich der kanonischen Spleißstellen¹³, was die bedeutende Rolle der intronischen Elemente bei der Spleißregulation unterstreicht. Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung intronischer Sequenzen für die Spleißkontrolle und zeigen den Nutzen von MaPSy bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Spleißdefekte (Abbildung 1).

Abbildung 1: Experimentelles Design eines massiv parallelen Spleißassays (MaPSy) von near-exon-intronischen Mutationen. Varianten, die in Datenbanken menschlicher Krankheiten dokumentiert sind, wurden gesammelt und als 5.307 Paare von Oligos synthetisiert. Jedes Oligopaar enthält eine Referenz und ein variantes Allel in den intronischen und 35-nt-exonischen Regionen mit 78 Nukleotiden (nt). Die Oligos werden von gemeinsamen Priming-Stellen für die Amplifikation und Ligation in 3-Exon-Spleiß-Minigene flankiert. Dementsprechend umfasst die synthetisierte Region die 3 ́s des zweiten Exons des Minigens. Nach dem Assemblieren der Minigene wurden die gepoolten Minigene in menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293T) gespleißt. Die resultierenden gespleißten Isoformen wurden geerntet und durch Amplikon-Sequenzierung aufgelöst. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Chiang et ^al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Synthese der MaPSy-Oligonukleotid-Bibliothek (Oligo)

1. Grundlegende Oligostruktur: Entwerfen Sie jedes Oligo im 155-Nunkleotid-Pool (nt) so, dass es eine exonische 35-nt-Sequenz und eine intronische 80-nt-Sequenz enthält, wodurch eine genspezifische Region mit 115 nt gebildet wird, die an jedem Ende von gemeinsamen 20-nt-Priming-Sequenzen flankiert wird (Abbildung 2A).
2. Variantensammlung: Um die Integrität des Motivs zu bewahren und sich auf regulatorische Bereiche zu konzentrieren, die das Spleißen beeinflussen, sammeln Sie die intronischen Varianten, die:
   -78 bis +10 nt von der 3 SS
   -3 bis +30 nt von den 5ern
   HINWEIS: Klinische Varianten können aus ClinVar¹⁹, niederfrequenten Einträgen in dbSNP²⁰, relevanten Publikationen und zusätzlichen klinischen Datenbanken stammen. Genomkoordinaten können verwendet werden, um Varianten mit den gewünschten Genomregionen zu überschneiden (z. B. mit BEDTools²¹). Es sollten nur Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und kleine Insertionen/Deletionen (Indels) unter 15 nt ausgewählt werden, um die Größenvariabilität innerhalb des Oligopools für die Massensynthese zu minimieren.
3. Grundlegende Minigenstruktur: Um die Spleißübergangsstruktur zu erhalten, enthält jedes Minigen-Rückgrat drei Exons: zwei konstante äußere Exons, die für Fragmente von EGFP (aus pGint, Addgene Plasmid #24217) kodieren, und ein mittleres Exon, das vom Exon 15 des humanen CAMTA2 abgeleitet ist (Abbildung 2B). Verdauen Sie sowohl das CAMTA2-Fragment als auch pGint mit BamHI- und SalI-Restriktionsenzymen und ligieren Sie das CAMTA2-Fragment in pGint zwischen den EGFP-Exons, wodurch pGint-CAMTA2-Drei-Exon-Minigene entstehen (Ergänzende Datei 1).
   HINWEIS: Das mittlere Exon, d. h. das CAMTA2-Exon 15, sollte eine mittlere Spleißeffizienz aufweisen, wenn es in Zielzellen exprimiert wird. Diese Eigenschaft ist wichtig, da sie eine ausgewogene Ausgangsbasis bietet, die es ermöglicht, sowohl Zu- als auch Abnahmen der Spleißeffizienz aufgrund varianter Effekte zu erkennen.
4. Design der Priming-Stelle: Hängen Sie die Sequenz der Insertionsstelle an beide Enden der Bibliothek an, so dass jedes Oligo ~20-nt-flankierende Sequenzen enthält, die sich mit der beabsichtigten Insertionsstelle innerhalb des mittleren Exons/Introns überlappen (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Wenn der Oligo-Pool für mehrere Minigen-Konstrukte ausgelegt ist, können mehrere Priming-Stellen eingebaut werden.
5. Barcode-Design: Bei intronic-Varianten sind exonische Barcodes unerlässlich, um Genotypen von gespleißten Produkten zu unterscheiden, da intronische Sequenzen nach dem Spleißen verloren gehen. Um Spleißänderungen aufgrund von Barcode-Sequenzen (d. h. dem Barcode-Effekt) zu vermeiden, positionieren Sie die Barcodes distal innerhalb der Exons, weg von den Spleißstellen (d. h. direkt neben der exonischen Priming-Stelle).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, nach Möglichkeit mehrere Barcodes pro Variante zu verwenden. Die erforderliche Barcode-Länge hängt von der Komplexität der Bibliothek ab. Zum Beispiel:
   Ein 1-nt-Barcode ist ausreichend, wenn ein Referenzallel nur mit einer Variante gepaart ist.
   Ein 2-nt-Barcode ist vorzuziehen, wenn ein Referenzallel mit sechs verschiedenen Varianten gepaart ist.
   Bibliotheken mit mehreren Varianten, die eng mit einem einzigen Referenzallel verwandt sind (z. B. die sich nur durch ein Nukleotid unterscheiden), können die Komplexität der Analyse erhöhen.
6. Ordnen von Oligos: Ordnen Sie Oligos im FASTA-Dateiformat an, wobei jede Variantenjunction zusammen mit ihrem Referenzallel gepaart ist.
   HINWEIS: Für Übergänge mit mehreren Varianten wird nur ein Referenzallel pro Übergang benötigt. Gepoolte Sequenzsynthesedienste werden von Unternehmen wie GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) und Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis) angeboten. Die Länge der Synthese, die Bibliothekskapazität und die Kosten können je nach Anbieter und Region variieren.

Abbildung 2: Oligo- und Spleiß-Minigen-Design für MaPSy. (A) Design für die gepoolte Oligosynthese des 3'- oder 5'-Endes von Introns. Die Diagramme veranschaulichen die Grundstruktur der 155-nt-Oligos. Die tatsächliche Kapazität der Oligosynthese hängt von dem Unternehmen ab, das für die Produktion ausgewählt wird. (B) Design der MaPSy-Minigenese. Ein Drei-Exon-Minigen (ii) wurde aus dem pGint-Plasmid (i) modifiziert, und die Spleißstellen wurden durch die gepoolten Oligos ersetzt, um Spleißsignalvariationen (iii) einzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Aufbau von DNA-Templates der MaPSy-Bibliothek

1. Erste Amplifikation nach Erhalt des Oligo-Pools
   1. Nach Erhalt des Oligopools amplifizieren Sie 10-50 ng der Oligobibliothek mit den entworfenen flankierenden Priming-Stellen durch eine 100-μL-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der High-Fidelity-DNA-Polymerase, um die Oligos in Doppelstränge umzuwandeln (LibF- und LibR-Primer in Tabelle 1, Thermocycler-Einstellungen in Tabelle 2).
   2. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit Hilfe von Aufreinigungssäulen. Binden Sie das PCR-Produkt an die Säulenmembran und waschen Sie es dann mit Puffern, die 70 % Ethanol enthalten, um Primerreste, Salze und Polymerase zu entfernen. Zum Schluss eluieren Sie das gereinigte PCR-Produkt mit salzarmem Puffer oder nukleasefreiem Wasser.
   3. Überprüfen Sie die amplifizierte Oligogröße durch Gelelektrophorese. Laden Sie 5 μl des gereinigten PCR-Produkts auf ein 1,5%iges Agarosegel, das in 1× TAE-Puffer (40 mM Trisbase, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA, pH 8,0) hergestellt wurde.
      HINWEIS: Begrenzen Sie die PCR-Amplifikationszyklen auf 15, um eine Überamplifikation und PCR-Verzerrung zu vermeiden. Eine sekundäre Fuzzy-Bande, die typischerweise größer als das Zielprodukt ist, kann auf eine Überverstärkung und ein unvollständiges Abkühlen innerhalb des Oligo-Pools hinweisen. Speichern Sie einen Teil der PCR-Produkte und sequenzieren Sie den Oligo-Pool, um Qualität und Fehlerraten zu bewerten, bevor Sie fortfahren (Stopppunkt).
2. Konstruktion von MaPSy-Spleiß-Minigenen - Erste PCR.
   1. Rückgratfragmente: Verwenden Sie 0,5 ng des pGint-CAMTA2-Plasmidrückgrats als Quelle für die beiden Haupt-PCR-Fragmente
      1. PCR-Produkt 1: Amplifizieren Sie den CMV-Promotor, das erste Exon (N-terminales EGFP) und einen Teil des ersten Introns (Tabelle 1 und Tabelle 2).
      2. PCR-Produkt 3: Amplifizieren Sie einen Teil des mittleren Exons (CAMTA2-Exon 15), des zweiten Introns, des dritten Exons (C-terminales EGFP) und des SV40-Polyadenylierungssignals (Abbildung 3, Tabelle 1 und Tabelle 2).
   2. Bibliotheksamplikon: PCR-Produkt 2: Amplifizieren Sie für die 3er-Bibliothek die Bibliotheksamplikons mit überlappenden Sequenzen an jedem Ende, um sie an den inneren Enden von PCR-Produkt 1 und PCR-Produkt 3 abzugleichen, was eine effiziente Integration an den 3er-Zellen des CAMTA2-Exons 15 ermöglicht (Abbildung 3, Tabelle 1 und Tabelle 2).
      HINWEIS: Ersetzen Sie für die 5er-Bibliothek das 5'-Ende des mittleren Exon-Übergangs durch die Bibliothekssequenz.
3. Reinigen Sie nach der PCR alle Produkte mit Aufreinigungssäulen wie in Schritt 2.1.2. Um eine Kontamination durch den Template-Vektor zu verhindern, reinigen Sie die gewünschten Produkte aus PCR1 und PCR3 durch Agarose-Gel-Extraktion. Insbesondere wird nach der Elektrophorese ~ 100 mg Agarosegel, das das Ziel-PCR-Produkt enthält, herausgeschnitten und im Bindungspuffer aufgelöst. Binden Sie die gelöste Gellösung an die Säulenmembran und fahren Sie dann mit dem Standard-PCR-Aufreinigungsprotokoll fort.
4. Konstruktion von MaPSy-Spleiß-Minigenen - Überlappungsverlängerungs-PCR: Führen Sie eine oder mehrere aufeinanderfolgende Runden überlappender PCR durch, um die drei Hauptfragmente (PCR-Produkt 1, das Bibliotheks-Amplikon und das PCR-Produkt 3; verwenden Sie jeweils ~ 20 ng als Template) zu einem Spleiß-Minigen in voller Länge zu ligieren (verwenden Sie die meisten externen Primer CAMGFPF und CMVGFPR in Tabelle 1 und die Thermocycler-Einstellungen in Tabelle 2).
   HINWEIS: Das Endprodukt enthält den CMV-Promotor und drei Exons, wobei die ersten 3 aus der Oligonukleotidbibliothek stammen, und es ist transfektionsfähig für zellbasierte Experimente.
5. Reinigen Sie nach dem Assemblieren die DNA-Templates in voller Länge mit PCR-Aufreinigungssäulen. Wenn unspezifische Banden im Gel beobachtet werden, führen Sie eine Gelextraktion durch, um genau das gewünschte Produkt in voller Länge zu isolieren, wie in Schritt 2.3.
   HINWEIS: Sehr ähnliche Sequenzen in der Bibliothek können zu einer unvollständigen Montage führen. Wenn die vollständige Assemblierung in einer einzigen PCR-Reaktion schwierig ist, können sequentielle überlappende PCRs (beginnend mit zwei Fragmenten, dann Hinzufügen eines dritten) versucht werden. Um die PCR-Spezifität zu verbessern, sollten Sie eine Anpassung der Annealing-Temperatur oder die Implementierung einer Touch-down-PCR in Betracht ziehen, um die Bindungsspezifität für komplexe Templates zu erhöhen. Bereiten Sie genügend MaPSy-Konstrukte vor, um mindestens vier unabhängige Experimente durchzuführen. Speichern Sie ein kleines Aliquot jedes Konstrukts für die Sequenzierung der nächsten Generation, um die Integrität der Sequenz zu überprüfen, da einige Oligonukleotide möglicherweise nicht effizient amplifizieren und zu unvollständigen Assemblierungen führen (Stopppunkt).

Abbildung 3: Arbeitsablauf beim Aufbau von Bibliotheken. (A) Primer, die in der überlappenden PCR verwendet werden (siehe auch Tabelle 1). (B) Das Verfahren für die überlappende PCR. Kurz gesagt, die Oligo-Pools und die anderen Teile der Spleiß-Minigene wurden durch 25 PCR-Zyklen amplifiziert. Das Fragment, das den Promotor und das erste Exon (PCR-Produkt 1) enthält, wurde durch überlappende PCR unter Verwendung von 20 Amplifikationszyklen an den Oligopool (PCR-Produkt 2) genäht. Dann wurde das genähte Produkt (PCR-Produkt 1+2) unter Verwendung von 20 Amplifikationszyklen weiter an das Fragment genäht, das das 3^. Exon und das Polyadenylierungssignal (PCR-Produkt 3) enthielt, um das endgültige Konstrukt (PCR-Produkt 1+2+3) zu erhalten. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Chiang et ^al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aufbau einer MaPSy-Bibliotheksgrundierung		Anmerkung
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR-Produkt 1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR-Produkt 1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR-Produkt 2
Libr	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR-Produkt 2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR-Produkt 3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	PCR-Produkt 3
PCR-Primer für die Amplikon-Sequenzierung mit MaPSy-Bibliothek
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTGTAGT
Einführung in die Validierung
Lib0F (Validierung von Bibliotheken)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (Validierung von Bibliotheken)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Primer.

PCR-Reaktionsmischung
Komponenten	Volumen
ddH2Ω	13,4 μl
5x HF-Puffer	4 μL
10 mM dNTPs	0,4 μl
Vorwärts-Grundierung 10 μM	0,5 μl
Umgekehrte Grundierung 10 μM	0,5 μl
cDNA (englisch)	1 μL
High-Fidelity-DNA-Polymerase	0,2 μl

Führen Sie das PCR-Programm durch (20 μl Reaktion)
	Aushilfe	Zeit	Zyklen
Anfängliche Denaturierung	98°C	ca. 1 min	1
Denaturierung	98°C	30 Sek.	10–20
Glühen	65°C	30 Sek.
Erweiterung	72°C	30 Sek.	Zurück zur Denaturierung
Letzte Verlängerung	72°C	5 Minuten	1
Halten	4°C	Halten	Halten

Tabelle 2: Einstellungen des Thermocyclers.

3. Expression und Rückgewinnung von Spleiß-Minigenen aus Säugetierzellen

1. Zellkultur: Halten Sie HEK293T Zellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin in 5 % CO₂ bei 37 °C.
2. Transfektion von Spleiß-Minigenen:
   1. Platte 5 × 10⁵ HEK293T Zellen in 2 ml Medium in 6-Well-Platten 24 h vor der Transfektion.
   2. Transfizieren Sie Zellen mit 1-2 μg MaPSy-Konstrukten, die 5 Minuten lang mit 3,75 μl Transfektionsreagenz vorinkubiert wurden, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Eine erfolgreiche Transfektion wird durch das Vorhandensein von EGFP-Signalen aus der gespleißten Bibliothek angezeigt.
   3. Lysieren Sie die Zellen mit 250 μl Trizol (oder gleichwertig) 24 Stunden nach der Transfektion.
3. RNA-Extraktion: Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Miniprep-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Binden Sie die RNA im Trizol an die Säulenmembranen, waschen Sie sie mit Puffern, die 70 % Ethanol enthalten, um Salze, Proteine und andere Verunreinigungen zu entfernen, und eluieren Sie die gereinigte RNA mit einem salzarmen Puffer oder nukleasefreiem Wasser.
   ACHTUNG: Trizol (oder gleichwertig) ist stark ätzend und giftig. Die Exposition kann zu schweren Verätzungen, dauerhaften Narben und Nierenversagen führen.
   HINWEIS: RNA kann in Trizol (oder einem gleichwertigen Trizol-basierten Reagenz, wie z. B. dem TOOLSmart RNA-Extraktor von TOOLS) bei -80 °C für bis zu einem Jahr gelagert werden (Stopppunkt). Aufgereinigte RNA kann bis zu zwei Jahre bei -80 °C gelagert werden, wenn die Gefrier-Auftau-Zyklen minimiert werden (Stop-Point).
4. Reverse Transkription: Bereiten Sie cDNA aus 2 μg Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase mit zufälligen Hexameren gemäß dem Protokoll des Herstellers vor. Inkubieren Sie die RNA 10 Minuten lang mit 50 μM zufälligen Hexameren bei Raumtemperatur, um das Abkühlen zu ermöglichen, und führen Sie dann 10 Minuten lang eine reverse Transkription bei 55 °C durch.
   HINWEIS: cDNA kann bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden (Stopppunkt).
5. Amplifikation der gespleißten Minigene: Führen Sie die PCR mit den spezifischen Priming-Sequenzen für die gespleißten Minigene durch (Tabelle 2). Verwenden Sie die minimale Anzahl von Zyklen, die erforderlich ist, um das Produkt auf einem Agarose-Gel zu visualisieren.
   HINWEIS: Gemischte Banden aus nicht gespleißten und gespleißten Produkten sollten auf dem Gel sichtbar sein. Banden können aufgrund der gemischten Population von DNA-Spezies diffus erscheinen (Abbildung 4A).
6. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit Aufreinigungssäulen wie Schritt 2.1.2.
7. Anbringen von Sequenzieradaptern: Führen Sie eine letzte PCR-Runde durch, um die Sequenzen der Sequenzieradapter an den Amplikonenden anzubringen. Fügen Sie 0-3 zufällige Nukleotide am Ende der Amplikons ein, um eine ausgewogene Fluoreszenzdetektion auf der NextSeq-Plattform zu gewährleisten (Tabelle 1).
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit Aufreinigungssäulen wie Schritt 2.1.2.

4. Amplikon-Sequenzierung und -Analyse

1. Short-Read-Sequenzierung: Unterziehen Sie die PCR-Amplikons einer 150-Paired-End-Sequenzierung mit Illumina Miseq, Novaseq oder gleichwertig über eine Core Facility oder einen kommerziellen Service.
2. Ausrichtung:
   1. Erstellen Sie ein Referenzgenom: Erstellen Sie ein synthetisches "Referenzgenom", indem Sie jeden einzigartigen Genotyp als separates Chromosom markieren. Das Referenzgenom umfasst die synthetischen Exons und Introns, die in den Amplikons enthalten sind.
   2. Sequenzierungs-Reads ausrichten: Richten Sie die Paired-End-Reads mit HISAT2^22,23 am Referenzgenom aus und passen Sie die Parameter an, um Spleiß-spezifische Elemente zu steuern (siehe Ergänzende Datei 2 für Befehlszeilendetails).
   3. Auswählen von Lesevorgängen mit hoher Qualität: Konvertieren Sie SAM in das BAM-Format, filtern Sie nach Lesevorgängen mit hoher Qualität (Zuordnungsqualität ≥60), und sortieren und indizieren Sie dann die BAM-Dateien²⁴ (siehe Ergänzende Datei 2 für Befehlszeilendetails).
   4. Identifizieren von Spleißverbindungen und Berechnen der Junction-Lesevorgänge: Quantifizieren Sie die Verwendung von Spleißverbindungen, indem Sie Exon-Skipping-Ereignisse aus CIGAR-Zeichenfolgen in der ausgerichteten BAM-Datei extrahieren. Identifizieren Sie die Junction-übergreifenden Lesevorgänge basierend auf "N"-Operationen, und aggregieren Sie die Leseanzahl pro Junction-Koordinate und Strang, um Spleißmuster zu bewerten (siehe Ergänzende Datei 2 für Befehlszeilendetails).
   5. Kanonische Spleißstellen klassifizieren: Klassifizieren Sie Spleißstellen als kanonisch, wenn sie mit den annotierten GT-AG-Verbindungen übereinstimmen.
      HINWEIS: In seltenen Fällen können Referenzallele in MaPSy nicht-kanonische Spleißstellen verwenden. Lesevorgänge, bei denen keine Knoten vorhanden sind, die sich über die angegebene Position der Spleißstelle erstrecken, werden als nicht gespleißte Lesevorgänge beibehalten.
3. Statistische Analyse zur Identifizierung von Spleißvarianten: Kategorisieren Sie Lesevorgänge in drei Gruppen:
   (1) gespleißte versus nicht gespleißte Lesevorgänge;
   (2) kanonisch versus nicht-kanonisch unter allen gespleißten Lesevorgängen;
   (3) Kanonische versus nicht-kanonische plus nicht gespleißte Lesevorgänge.
   Führen Sie einen zweiseitigen exakten Fisher-Test durch, gefolgt von einer Korrektur der False Discovery Rate (FDR) (Tabelle 3), um die Auswirkungen von Varianten auf die Spleißeffizienz und -genauigkeit zu bewerten.
4. Filtern Sie nach Spleißvarianten mit hoher Konfidenz: Klassifizieren Sie sowohl Referenz-/Variantenpaare mit mehr als 100 Lesevorgängen und einem q-Wert von weniger als 0,05 über vier Wiederholungen als signifikant. Betrachten Sie dann Kandidaten mit einer 2-fachen Odds-Ratio-Änderung, wobei entweder das Referenz- oder das Variantenallel >5 % nicht gespleißte und nicht-kanonische Reads aufweist, was zu hochzuverlässigen Spleißvarianten führt (Abbildung 4B).

Liest	Gespleißt	Nicht gespleißt und/oder nicht-kanonisch
Referenz	ein	b
Variante	c	d

Tabelle 3: Zwei-mal-Zwei-Tabelle für den exakten Fisher-Test.

5. Validierung

1. Minigen-Spleißen zur Validierung:
   1. Oligosynthese und Amplifikation: Synthetisieren Sie die DNA-Oligos ausgewählter MaPSy-Kandidatensequenzen einzeln (z. B. durch integrierte DNA-Technologien). Anschließend werden die Oligos unter Verwendung der entworfenen flankierenden Sequenzen durch PCR unter Verwendung der High-Fidelity-DNA-Polymerase in Doppelstränge amplifiziert (Tabelle 2).
   2. Minigen-Klonierung: Verdauen Sie sowohl die resultierenden PCR-Produkte als auch das pGint-CAMTA2 mittels BbsI und SmaI und ligieren Sie das verdaute Produkt durch DNA-Ligasen.
   3. Transfektion: Transfizieren Sie die resultierenden Konstrukte in HEK293T Zellen mit einem Transfektionsreagenz wie in Schritt 3.2.2.
   4. RNA-Extraktion: Extrahieren Sie RNA aus den transfizierten Zellen, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
   5. Reverse Transkription: Führen Sie eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit zufälligen Hexameren durch.
   6. Spleiß-Isoform-Amplifikation: Amplifizieren Sie die Spleiß-Isoformen mit Primern, die auf die ersten beiden Exons des Minigens abzielen (Lib0F und Lib0Rl, Tabelle 1, Thermocycler-Einstellungen in Tabelle 2). Lösen Sie die amplifizierten Produkte durch Elektrophorese auf und visualisieren Sie sie mit dem Gel Doc System.
   7. Quantifizierung: Quantifizieren Sie die Signalintensität jeder Spleißisoform mit ImageJ (National Institutes of Health, USA)^25,26. Alternativ können Sie das DNA-Screening-Kit mit dem Hochleistungs-Nukleinsäureanalysator eGENE HDA-GT12 verwenden, um die Intensität und das Molekulargewicht der PCR-Produkte zu quantifizieren.
   8. Isoform-Extraktion und -Bestätigung: Isolieren Sie jede Isoform durch Agarose-Gel-Extraktion wie Schritt 2.3 und bestätigen Sie das Spleißergebnis durch Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte durch eine Core Facility oder einen kommerziellen Service, wobei Sie auf normales Spleißen, Intron-Einschluss und Exon-Skipping prüfen.
2. Multi-Exon-Spleiß-Minigenese:
   1. Nach der Validierung der MaPSy-Ergebnisse wählen Sie die gewünschte Variante aus und klonen drei bis fünf Exons aus genomischer DNA (gDNA), um einen genomischeren Kontext für den beobachteten Spleißdefekt zu erhalten.
   2. Führen Sie eine ortsgerichtete Mutagenese mit mutagenisierenden Primern und überlappender PCR durch, um Minigen-Konstrukte zu assemblieren, die die gewünschte Sequenzalteration an der Zielstelle beherbergen.
      HINWEIS: Wenn die flankierenden Introns für das Klonen zu lang sind, behalten Sie ca. 300 nt der intronischen Sequenz für jede Spleißstelle bei, um einen korrekten Spleißkontext zu gewährleisten.
   3. Führen Sie den zellbasierten Spleiß-Assay durch, wie oben in 5.1 beschrieben.
3. Zelluläre Validierung: Um den Spleißeffekt in Zellen zu validieren, verwenden Sie die vorlagenbasierte CRISPR-Bearbeitung, um die Sequenz der ausgewählten Varianten in einem geeigneten zellulären Modell zu ändern.
   HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie menschliche Proben, die die spezifische Variante tragen, um das Spleißmuster direkt zu beurteilen.

Results

Nach dem zellulären Spleißen von MaPSy-Konstrukten liegen sowohl gespleißte als auch nicht gespleißte Produkte als Gemisch vor. Aufgrund der Größenvielfalt der Bibliothek und des Potenzials für nicht-kanonisches Spleißen können beide Arten von Produkten auf einem Gel etwas diffus erscheinen. In Konstrukten, die auf das 3'-Ende abzielen, neigt das zweite Intron, das partielle adenovirale Sequenzen enthält, dazu, sehr robust zu spleißen (Abbildung 4A).

In MaPSy-Expe...

Discussion

Das intrinsische EGFP-Signal im MaPSy-Konstrukt ermöglicht die fluoreszenzbasierte Detektion von Exon-Skipping. Wenn die Sequenz im mittleren Exon oder Introns das Exon-Überspringen fördert, erzeugt die Ligation des ersten und dritten Exons ein EGFP-Signal, das mit FACS detektiert werden kann, was dies zu einer wertvollen Methode zur Identifizierung von Varianten macht, die das Exon-Überspringen beeinflussen, und zur Erleichterung der mikroskopiebasierten Visualisierung von Spleißvariant...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Direct-Zol RNA MiniPrep Plus Kit	Zymo-Forschung	Nr. R2072
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965084
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	A2916801
Lipofectamin 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
pGint-Plasmid	Addgene	24217
Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530L
QIAquick Gel-Extraktionskit	Qiagen	28706
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106
QIAxcel DNA-Screening-Kit (2400)	Qiagen	929004
Reverse Transkriptase SuperScript IV	Thermo Fisher Scientific	18090010