$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Virale Vektoren haben sich aufgrund ihrer natürlichen Fähigkeit, genetisches Material in Wirtszellen zu bringen, als wirksame Werkzeuge in der Gentherapie, der onkolytischen Virotherapie und der Entwicklung genetischer Impfstoffe erwiesen. Sie nutzen die natürlichen Tropismus- und Transduktionsmechanismen von Viren und erleichtern so sowohl die vorübergehende als auch die langfristige Genexpression. Sie sind in der Lage, in der extrazellulären Umgebung zu überleben, sich an einen spezifischen zellulären Rezeptor (der den viralen Tropismus definiert) zu binden und dessen Internalisierung zu fördern, die Genexpressionsmaschinerie der Wirtszelle zu kapern und die Expression ihrer eigenen Gene voranzutreiben und sich membrangebundenen und intrazellulären Sensoren des angeborenen Immunarms zu entziehen 1,2. Auf diese Weise verwandeln Viren nach einer produktiven Virusinfektion Zellen in virale Nachkommenfabriken, die neue Viren in den Organismus einschleusen und schließlich eine Krankheit verursachen.
Wildtyp-Viren können durch Gentechnik in ein biotechnologisches Werkzeug umgewandelt werden: Ihr Genom kann leicht manipuliert werden, um die Transduktionsfähigkeit zu erhalten und ein klinisches Ergebnis zu erzielen. Basierend auf ihrer klinischen Anwendung können virale Vektoren so konstruiert werden, dass sie ihre Replikationskompetenz (zumindest teilweise) beibehalten oder abtragen, um entweder replikationskompetente oder replikationsinkompetente Vektoren zu erzeugen 3,4.
Replikationsfähige Viren sind hauptsächlich für onkolytische Viruszwecke bestimmt. Krebszellen, denen es oft an antiviraler Abwehr mangelt1, ermöglichen die Replikation abgeschwächter rekombinanter Viren, die durch Deletion von Virulenzgenen manipuliert wurden. Diese Viren vermehren sich selektiv in Tumoren und schonen dabei normales Gewebe. Mit dem fortschreitenden Verständnis der Virologie wurden abgeschwächte Viren durch präzisere Genommodifikationen ersetzt, die sowohl die Sicherheit als auch die therapeutische Wirksamkeit verbessern sollen.
Zu den Interessengebieten, die ein chirurgisches Molecular Engineering von viralen Genomen erfordern, gehören: i) Replikationsbedingte onkolytische Viren, bei denen virale Promotoren durch tumorassoziierte Promotoren (zelluläre Promotoren, die in Tumorzellen übertranskribiert werden) ersetzt werden, wodurch die virale Genexpression auf erkrankte Zellen beschränkt wird5. ii) Viren mit verändertem Tropismus 6,7, bei denen Hüllglykoproteine, die eine Infektion bestimmen, modifiziert oder durch Antikörperfragmente oder Liganden ersetzt werden können, die auf Proteine abzielen, die auf Tumorzellen überexprimiert werden 8,9. iii) Bewaffnete onkolytische Viren. Der durch onkolytische Viren induzierte Tumorzelltod löst den immunogenen Zelltod (ICD) aus, der durch die Freisetzung von Entzündungsmediatoren 1,10 und Tumorantigenen11 gekennzeichnet ist. Diese Signale fördern die effiziente Erkennung von Tumorantigenen durch das Immunsystem, stellen die Überwachungwieder her 12und ermöglichen die Kombination mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren 13,14,15 und anderen Immuntherapeutika wie RNA-basierten Therapien und Impfstoffen16.
Zur Unterstützung dieser immuntherapeutischen Wirkung können Transgene von Interesse innerhalb des viralen Genoms kodiert werden, wodurch das Virus nicht nur für seine onkolytische Aktivität genutzt wird, sondern auch zur Verbesserung seines immuntherapeutischen Potenzials durch die In-situ-Produktion relevanter Nutzlasten 3,7,17,18,19. Diese Nutzlasten können Zytokine, Chemokine, Antikörper, Selbstmordgene und Antigene umfassen 3,20. Die Insertion erfordert Präzision, wobei intergene Regionen des viralen Genoms bevorzugt werden, um die Störung viraler Gene zu minimieren und die Replikation und Potenz zu erhalten7. Daher sind Techniken, die das Screening sowohl optimaler Insertionsstellen als auch von Transgenen von Interesse ermöglichen, unerlässlich.
Auf der anderen Seite ist es im Zusammenhang mit nicht-replikativen Viren, die für die Gentherapie oder als Vehikel für genetische Impfstoffe verwendet werden, wichtig, dass der virale Vektor das Transgen (entweder vorübergehend oder lang anhaltend) liefert, ohne sich in die Wirtszelle zu replizieren, um Toxizität zu vermeiden21. Adenovirale Vektoren zeichnen sich durch eine hohe Transduktionseffizienz, eine robuste Expression von Transgenen und die Fähigkeit aus, sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen zu infizieren3. Diese Eigenschaften haben sie zu den ersten ihrer Klasse für die Entwicklung genetischer Impfstoffe gemacht, einschließlich solcher für neu auftretende Infektionskrankheiten wie COVID-19 sowie von Genersatztherapien22. Das bekannteste Beispiel für einen adenoviralen Vektor, der auf den Markt gekommen ist, ist der COVID-19-Impfstoff von Oxford-AstraZeneca, der unter dem Handelsnamen Covishield oder Vaxzevria bekannt ist und auf einem modifizierten Schimpansen-Adenovirus, ChAdOx1, basiert, das für das Spike-Protein von SARS-CoV-2 kodiert. Wenn Covishield intramuskulär injiziert wird, ist es in der Lage, in das Innere der Zellen einzudringen und die Expression des Spike-Proteins zu induzieren, wodurch das Immunsystem darauf vorbereitet wird, eine Immunantwort dagegen aufzubauen3.
Es besteht ein klarer Bedarf, virale Genome zu modifizieren, ohne durch Restriktionsenzym-Erkennungsstellen eingeschränkt zu sein. Unter den onkolytischen Viren bieten Herpes-Simplex-Virus-1 (HSV-1)-basierte Vektoren einzigartige Vorteile, einschließlich lytischer Fähigkeit, Sicherheit und großer Genomgröße, die die Insertion von großen Transgenen oder mehreren genetischen Elementen ermöglichen23,24. Neben HSV sind viele andere Viren therapeutisch vielversprechend, wie kürzlich in Sasso et al.3 untersucht wurde. Anstelle eines universellen "Best-in-Class"-Vektors eignen sich verschiedene virale Plattformen für unterschiedliche therapeutische Bedürfnisse3. Derzeit sind homologe Rekombinationssysteme in Bakterien oder die Klonierung von Hybridhefe-Bakterien nach wie vor die gebräuchlichsten Alternativen zu Restriktionsenzymen, aber diese sind mühsam, mehrstufig und ineffizient25.
Eine aufkommende Alternative ist die Verwendung von CRISPR/Cas9, das kürzlich zur Entwicklung von Genomen von Viren eingesetzt wurde, darunter das Vaccinia-Virus (VV), das Herpes-simplex-Virus und adenovirale Vektoren. Cas9 ist attraktiv für die Geninaktivierung über Indel-Mutationen, wird aber weniger praktisch, wenn mehrere Schnitte erforderlich sind, um Genomsegmente zu löschen oder ein Transgen über Spender-DNA einzufügen. Darüber hinaus ist die Editierung durch das gRNA-Design, Off-Target-Effekte sowohl im Virus- als auch im Wirtsgenom und die Abhängigkeit von PAM-Sequenzen in den interessierenden Regionen begrenzt25.
Vor diesem Hintergrund und anhand von zwei Beispielen, die auf HSV und Adenoviren basieren, veranschaulicht dieser Artikel die Rekombinationsmethode, die breit angewendet werden kann – von Viren über Bakteriophagen bis hin zu komplexen Plasmiden und verschiedenen experimentellen Systemen. Recombineering (homologes RECOMBInation-mediates genetisches EngiNEERING) ist eine gentechnische In-vivo-Technik , die hauptsächlich in Escherichia coli eingesetzt wird und temperaturabhängige Bakteriophagen-Rekombinationsproteine nutzt, um die homologe Rekombination zwischen DNA-Elementen mit einer Homologie von nur 30 bp zu katalysieren26. Dieser Ansatz ermöglicht die präzise Insertion, Deletion oder Modifikation von Sequenzen ohne Abhängigkeit von Restriktionsstellen oder DNA-Größe. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Version, die auf dem hitzeinduzierbaren E. coli-Stamm SW102 basiert, obwohl auch alternative Stämme mit spezifischen induzierbaren Systemen verfügbar sind27.
Die Rekombination beginnt mit der Aufbereitung elektrokompetenter Bakterienzellen durch einen kontrollierten Temperaturschock, um die Phagen-Rekombinationsmaschinerie zu aktivieren. DNA-Moleküle, die die entsprechenden Homologiearme tragen, werden dann elektroporiert. Dabei kann es sich um doppelsträngige DNAs (dsDNAs) handeln, die durch Restriktionsverdau oder PCR erzeugt werden, oder um einzelsträngige DNAs (ssDNAs), wie z. B. Oligonukleotide. Das Vorhandensein von homologen Sequenzen zusammen mit aktiven Rekombinationsproteinen ermöglicht die Schaffung neuer DNA-Moleküle mit der gewünschten Modifikation.
Die rekombinierbare molekulare Klonierungstechnologie ermöglicht eine präzise Gentechnik und wird in verschiedenen Kontexten eingesetzt, einschließlich der Insertion von selektierbaren oder nicht selektierbaren Markern in Plasmiden, bakterieller chromosomaler DNA und bakterieller künstlicher Chromosomen (BAC). BACs sind besonders wertvoll für die Klonierung großer genomischer Fragmente, einschließlich adenoviraler und HSV-DNA, und ermöglichen so die schnelle Produktion viraler Vektoren. Über die translationale Anwendung hinaus unterstützt das Rekombinieren auch die Grundlagenforschung, indem es die gezielte Deletion, Modifikation oder den Ersatz von viralen Genen oder Proteindomänen ermöglicht. Die Rekombinierung hat einige Einschränkungen: Kurze Homologiearme behindern die Rekombination in repetitiven Regionen; PCR-amplifizierte Substrate können gelegentlich Mutationen einführen; und die Sequenz der Zielregion muss bekannt sein.