Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Bewertung der mikrobiellen Zusammensetzung in Milchprodukten durch die Kombination von Kulturwissenschaften mit MALDI-TOF MS. Es liefert Taxonomieergebnisse, die mit der 16S-rRNA-Sequenzierung vergleichbar sind, mit einer kürzeren Durchlaufzeit als herkömmliche Kulturmethoden.

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll vor, das die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS, im Folgenden als "MS" bezeichnet) zur Überwachung des Vorhandenseins von Mikroorganismen in verschiedenen Milchprodukten (Butter, Mozzarella, Käse, Milch, Sahne) unter Verwendung eines proteomischen Ansatzes, moderner Kulturtechnik und verschiedener Probenvorbereitungsverfahren verwendet, die in die Laboratorien für Lebensmittelsicherheit zur Qualitätskontrolle integriert werden könnten. Zuverlässiges und robustes Werkzeug zur Überwachung der mikrobiellen Sicherheit. Es umfasst einen mikrobiellen Isolationsschritt, die Entnahme gewachsener Kolonien, Probenvorbereitungsverfahren (intakte Zellen, Extraktion vor Ort und im Röhrchen), das Einstellen von MS-Analyseparametern, das Generieren und Sammeln von MS-Spektren (Protein-Fingerabdrücke) und schließlich die Taxonomie mithilfe der MS-Plattform, gefolgt von der Dateninterpretation und -visualisierung. Diese durch zahlreiche Studien validierte Methode bietet im Vergleich zu kommerziellen biochemischen Testsystemen eine zuverlässigere und kostengünstigere Identifizierung von Mikroorganismen aus Milch. Es zeichnet sich durch einen vielversprechenden Fortschritt in der Lebensmittelmikrobiologie aus und erfüllt die vielfältigen Anforderungen von Laboren durch einfache Protokolle und eine deutlich verkürzte Analysezeit. Das vorgestellte Protokoll erfüllt die Anforderungen der Lebensmittelindustrie, indem es eine zuverlässige mikrobielle Identifizierung in einer angemessenen Durchlaufzeit (TAT) ermöglicht, die sich gut für Herstellungsprozesse eignet.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine umfassende Methodik zur Überwachung der mikrobiellen Sicherheit verschiedener Milchprodukte, einschließlich Butter, Käse, Milch und Sahne, durch den Einsatz von MS für die Erstellung von bakteriellen proteomischen Profilen bereitzustellen. Dieser Ansatz, der moderne Kulturtechnik mit optimierten Probenvorbereitungsverfahren kombiniert, soll ein schnelles, zuverlässiges und robustes Werkzeug für Laboratorien für Lebensmittelsicherheit und Qualitätskontrolle sein. Der Grund für die Entwicklung und Anwendung dieser Methodik ergibt sich aus den Einschränkungen der Standardmethoden zur mikrobiellen Identifizierung. Veterinär- und Lebensmitteldiagnostiklabore verlassen sich seit vielen Jahren auf konventionelle biochemische Tests, die das Bakterienwachstum und den Stoffwechsel auf differentiellen Nährmedien untersuchen, gefolgt von verschiedenen enzymatischen Assays¹. Diese Methoden, die häufig auf Standardrichtlinien wie denen des Bergey's Manual of Determinative Bacteriology basieren, sind zwar relativ kostengünstig und können sowohl quantitative als auch qualitative Daten liefern, sind jedoch mühsam und zeitaufwändig und erfordern eine umfangreiche Medienvorbereitung, Probenverdünnung, Platingierung, Inkubation, Koloniezählung, Isolierung und detaillierte Charakterisierungsschritte ^2,3.

Die Einführung kommerzieller halbautomatischer und automatisierter Systeme wie Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek und Biolog MicroPlates rationalisierte die mikrobielle Identifizierung mithilfe biochemischer Assays und reduzierte so Kosten und Durchlaufzeiten. Diese Systeme weisen jedoch einige Nachteile auf, wie z. B. schlechte Reproduzierbarkeit, fehlende Einträge in ihren jeweiligen Datenbanken und Schwierigkeiten bei der Bestimmung phänotypischer Variationen zwischen Stämmen, insbesondere bei nicht-fermentativen Bakterien oder Stämmen innerhalb einer Spezies mit geringen biochemischen Unterschieden, was zu falschen In-vitro-Ergebnissen führen könnte⁴. Vor diesem Hintergrund hat sich MS zu einer wirksamen Alternative entwickelt, die derzeit in der klinischen Mikrobiologie üblich ist und in veterinärmedizinischen Diagnostik- und Milchqualitätslabors an Aufmerksamkeit gewinnt. Dieser Ansatz wurde durch seine Schnelligkeit, Genauigkeit und Kosteneffizienz beim Nachweis mehrerer Mikroorganismen ergänzt¹. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass MS eine zuverlässigere Identifizierung von Mikroorganismen aus Milch bietet und schnellere und kostengünstigere Ergebnisse liefert als kommerzielle biochemische Testsysteme ^5,6,7. Während biochemische Tests für die Identifizierung auf Gattungs- oder Gruppenebene ausreichen können, erfordert die Diagnose auf Speziesebene oft fortschrittlichere Methoden wie MS oder 16S rRNA-Sequenzierung⁸. In der Tat gilt MS als vielversprechende Plattform für die flexible und zuverlässige Identifizierung von mikrobiellen Lebensmittelisolaten, die durch ihre einfachen Protokolle und die erheblich verkürzte Analysezeit die unterschiedlichen Anforderungen von Lebensmittelmikrobiologielabors erfüllt und dadurch die Lebensmittelsicherheit erhöht ^4,5. Die Betriebskosten sind aufgrund des geringen Reagenzienverbrauchs minimal, und die Probenhandhabung ermöglicht eine höhere Automatisierung und einen hohen Durchsatz⁸. Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Nutzen dieser Methode von Natur aus von den gewählten mikrobiellen Wachstumsbedingungen (einschließlich des Kulturmedientyps) und einer Referenzdatenbank-Speziesabdeckung abhängt, die als Schlüsselfaktoren für ihre Nützlichkeit anerkannt werden.

MS spielt eine wichtige Rolle in der Lebensmittelmikrobiologie, indem sie lebensmittelbedingte pathogene Bakterien, Milchsäurebakterien (LAB) und andere fermentative Bakterien identifiziert und unterscheidet⁹. Ihr Nutzen erstreckt sich auch auf die moderne Kultur, da sie die Identifizierung aller mikrobiellen Kolonien ermöglicht, die auf Kulturmedien gezüchtet wurden, und die Erfassung von Informationen über koloniebildende Einheiten (KBE) erleichtert⁷. Dieser Ansatz wurde bereits erfolgreich angewendet, um so komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu entdecken, wie sie im menschlichen Darm vorkommen, an diabetischen Fußinfektionen beteiligt sind oder mit den Harnwegen in Verbindung stehen, wodurch kulturabhängige Methoden in mikrobiologischen Praktiken revitalisiert^{werden 10,11}.

Dieses Protokoll soll Laboratorien bei der effektiven Implementierung von MS für die routinemäßige Bewertung der mikrobiellen Sicherheit in Milchprodukten unterstützen und den Bedarf der Industrie an einer zuverlässigen mikrobiellen Identifizierung innerhalb einer für Herstellungsprozesse geeigneten praktischen Durchlaufzeit (TAT) erfüllen. Das Protokoll beschreibt wichtige Schritte, einschließlich (1) mikrobieller Isolierung aus flüssigen (Milch, Sahne, Molke) und festen (Butter, Käse) Milchprodukten unter Verwendung einer Auswahl geeigneter Nährmedien (de Man, Rogosa und Sharpe Agar - MRS-Agar, M-17-Agar, Allzweck-Tween-80-Agar - APT-Agar, China Blue Lactose Agar - CBL-Agar, Milchplattenzahl-Agar - MPCA, Tryptischer Soja-Agar - TSA) und maßgeschneiderte Inkubationsbedingungen; (2) standardisierte Probenvorbereitungsverfahren für die MS-Analyse, die Optionen wie direkten Kolonietransfer, On-Target-Ameisensäureextraktion und Ethanol/Ameisensäure-Proteinextraktion im Röhrchen bieten, um verschiedenen Bakterientypen und Laborabläufen gerecht zu werden; und (3) systematische MS-Analyse, einschließlich Instrumentenkalibrierung, Definition optimaler Spektrenerfassungsparameter und Richtlinien für die Dateninterpretation, einschließlich Bewertung des Score-Werts und Konsistenzprüfungen für eine sichere taxonomische Zuordnung. Durch die Bereitstellung eines strukturierten und validierten Ansatzes zielt dieses Protokoll darauf ab, die Genauigkeit und Effizienz des mikrobiellen Monitorings in der Milchindustrie zu verbessern und letztendlich zu einer verbesserten Lebensmittelqualität und öffentlichen Gesundheit beizutragen.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von Milchbakterien

1. Gewinnung von Bakterienkulturen aus flüssigen oder festen Milchprodukten
   1. Auswahl der Kulturmedien
      1. Für die bakterielle Isolierung aus Milchproben wählen Sie die Nährmedien entsprechend den zu erwartenden mikrobiellen Gruppen aus, einschließlich allgemeiner Wachstumsmedien, Medien für gramnegative Bakterien, Milchsäurebakterien (LAB), sporenbildende Bakterien sowie langsam wachsende oder anspruchsvolle Mikroorganismen.
         HINWEIS: Um die Erholung sowohl dominanter als auch seltener Spezies zu maximieren, sollten mehrere Medien parallel geimpft werden. Eine Reihe von Beispielmedien für die Mikrobiomanalyse aus Milchproben ist in Tabelle 1 dargestellt.
   2. Inokulation und Beschichtung
      1. Entnehmen Sie eine repräsentative Probe des Milchprodukts und mischen Sie es gründlich.
      2. 1 ml (flüssige Proben: Milch, Sahne, Buttermilch) oder 1 g (feste Proben: Käse, Butter) der Probe werden aseptisch in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 9 ml sterilem flüssigem Medium (Peptonwasser / 0,85 % NaCl-Lösung) überführt. Bei festen Proben erwärmen Sie das flüssige Medium auf 40-42 °C, bevor Sie die Probe hinzufügen.
      3. Homogenisieren Sie die Probe, indem Sie sie 30-60 s lang kräftig vortexen. Bei fettigen oder harten Proben ist die Homogenisierung fortzusetzen, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten ist.
      4. Bereiten Sie eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen vor, indem Sie 1 ml Suspension nehmen und in aufeinanderfolgende Röhrchen mit 9 ml steriler Lösung überführen. Jede Verdünnung gut mischen.
         HINWEIS: Abhängig von der Art der Probe und dem erwarteten Grad der mikrobiellen Kontamination sind Verdünnungen im Bereich von ^10-1 bis ^10-6 vorzubereiten. Für die meisten Proben sind Verdünnungen von bis zu ^10-3 ausreichend; Bei der Analyse von Frischmilch oder Blauschimmelkäse müssen jedoch weitere Verdünnungen vorbereitet werden. Um eine genaue Isolierung und eine einfache Auswahl der Kolonie zu gewährleisten, sollte die optimale Inokulationsverdünnung 30-300 Kolonien pro Platte ergeben. Dieser Bereich ermöglicht eine klare Unterscheidung der einzelnen Kolonien und minimiert das Risiko von Überlappungswachstum, wodurch nicht kontaminierte und homogene Bakterienkulturen für die spätere Analyse gewonnen werden können. Für einige verarbeitete Milchprodukte (z. B. Buttermilch) kann eine unverdünnte frische Probe (z. B. 0,1 ml) für die Direktbeschichtung verwendet werden.
      5. Entnehmen Sie 0,1 ml der Probe oder ihrer Verdünnung und übertragen Sie sie auf die Oberfläche zuvor vorbereiteter Petrischale, die das entsprechende Agarmedium enthalten.
      6. Verteilen Sie das Inokulum mit einem sterilen Spreader gleichmäßig auf der Agaroberfläche. Lassen Sie das Inokulum 15 Minuten lang in das Medium einziehen, dann drehen Sie die Platten um.
   3. Inkubation
      1. Aerobe Inkubation: Für alle untersuchten Proben APT-, M-17-, CBL-, MPCA- und TSA-Agarplatten inokulieren, unter aeroben Bedingungen bei 37 °C und 30 °C für 24 h inkubieren. Die Inkubationstemperaturen wurden auf der Grundlage der optimalen Wachstumsanforderungen der verschiedenen mikrobiellen Gruppen bestimmt, die für die Beurteilung sowohl der hygienischen Qualität (30 °C für allgemeine Mesophile) als auch der Sicherheit für die öffentliche Gesundheit (37 °C für humanassoziierte Krankheitserreger und Indikatororganismen) von Milchprodukten entscheidend sind.
         HINWEIS: Wenn ein intensives Wachstum von sporenbildenden Bakterien erwartet wird, wird im Falle von TSA eine kürzere (~12 h) Inkubationszeit bevorzugt.
      2. Anaerobe Inkubation: Für alle untersuchten Proben werden MRS-Agarplatten inokuliert, unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C und 30 °C für 24-72 h inkubiert, wobei das mikrobielle Wachstum täglich überprüft wird. Die Inkubationstemperaturen wurden wie in Schritt 3.1 erwähnt bestimmt.
         HINWEIS: Anaerobe Inkubationsbedingungen können erreicht werden, indem Platten in luftdichte Behälter mit anaeroben Atmosphären-erzeugenden Beuteln gestellt werden, die Sauerstoff eliminieren und eine geeignete Atmosphäre für das Wachstum anaerober Bakterien bieten.
   4. Gewinnung von Reinkulturen
      1. Nach der Inkubation inspizieren Sie die Platten und wählen Sie gewachsene Einzelkolonien anhand ihrer morphologischen Merkmale (z. B. Größe, Form, Farbe, Textur) aus.
      2. Reinigen Sie die ausgewählten Kolonien durch Subkultivierung (Streifenbildung) auf demselben Agarmedium unter Verwendung einer mikrobiellen 1-μl-Schleife und der gleichen Inkubationsbedingungen.

Nährmedium	Anwendung	Kultureller Zustand
Tryptischer Soja-Agar (TSA)	allgemeines Medium für die Kultivierung einer Vielzahl von Bakterien	30–37 °C, 24–48 h, aerob
Blutagar (BLA; mit 5 % Schafsblut)	angereichert, Differenzierung der Hämolyse, nützlich für Streptokokken, Listerien, Bazillus	30–37 °C, 24–48 h, aerob
MRS-Agar (de Man-, Rogosa- und Sharpe-Agar)	selektiv für Lactobacillus und andere LAB Fügen Sie 1% Tween-80 hinzu, um das Wachstum von L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus oder L. acidophilus zu unterstützen.	30 °C, 48–72 h, anaerob oder mikroaerophil
M17-Agar	selektiv für Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, anaerob oder mikroaerophil
APT Agar (Allzweck Tween 80 Agar)	selektiv für LAB und einige Bifidobakterien	30 °C, 48–72 h, anaerob oder mikroaerophil
Scheadler Agar	selektiv und anreichernd, Isolierung von Anaerobiern, einschließlich Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, anaerob
CBL-Agar (China Blue Lactose Agar)	Differentialmedium, für coliforme Bakterien und andere laktosefermentierende Bakterien	37 °C, 24–48 h, aerob
Milchplattenzahl-Agar (MPCA)	universell, für die Gesamtzahl aerober mesophiler Bakterien	30–37 °C, 24–48 h, aerob

Tabelle 1: Liste der empfohlenen Medien für die Mikrobiomanalyse von Milchproben unter bestimmten Kulturbedingungen.

2. Vorbereitung von Bakterienproben für die MS-Analyse

1. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die MALDI-Matrixlösung vor
   HINWEIS: Die am häufigsten verwendete Matrixverbindung ist HCCA, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure. Diese Verbindung ist lichtempfindlich, also bereiten Sie die Matrix vor und lagern Sie sie in dunklen Behältern oder vor Licht geschützt.
   1. Bereiten Sie das Lösungsmittelgemisch mit folgenden Anteilen vor: 50 % Acetonitril (HPLC-Qualität), 47,5 % Wasser (HPLC-Qualität) und 2,5 % Trifluoressigsäure (TFA).
   2. Löse die Matrix in der Lösungsmittelmischung bis zu einer Endkonzentration von ca. 10 mg/ml auf (oder bis zur Sättigung - bis ungelöste Kristalle sichtbar bleiben).
   3. Wenn die Lösung nicht klar ist (Kristalle verbleiben), zentrifugieren oder filtrieren Sie die Lösung (z. B. durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter), um eine klare Flüssigkeit zu erhalten.
      HINWEIS: Die Lagerung im Kühlschrank ist für kurze Zeit erlaubt, sofern eine geringe Anzahl von Auftauzyklen vorhanden ist.
2. Um Bakterien anhand von MS zu identifizieren, verwenden Sie eines der 3 Verfahren zur Probenvorbereitung:
   1. Direkter Kolonietransfer - Verwenden Sie diese einfachste und schnellste Methode, wenn Sie mit gut wachsenden, nicht lysisresistenten Bakterien, wie z. B. den meisten gramnegativen Bakterien, umgehen.
      1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher eine kleine Menge (~1 μL) der gewachsenen Kolonie auf eine Stelle auf der MALDI-Platte.
      2. Schmieren Sie das Bakterienmaterial direkt auf eine dafür vorgesehene Stelle auf der MALDI-Zielplatte, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen.
      3. Nach dem Trocknen den Fleck mit 1 μl HCCA-Matrixlösung überlagern und bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen.
   2. On-Target-Ameisensäure-Extraktion - Für schwer zu identifizierende Bakterien (z. B. grampositive, Hefe), deren Zellwände es schwierig machen, Proteine ohne zusätzliche Verarbeitung freizusetzen.
      1. Nehmen Sie eine kleine Menge bakterieller Biomasse von einer einzelnen Bakterienkolonie mit einer mikrobiellen Einwegschlaufe oder einem sterilen Zahnstocher auf.
      2. Schmieren Sie das Bakterienmaterial direkt auf eine dafür vorgesehene Stelle auf der MALDI-Zielplatte, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen.
      3. Das verschmierte Bakterienmaterial mit 1 μl 70%iger Ameisensäurelösung überziehen und bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
      4. Nach dem Trocknen den Fleck mit 1 μl HCCA-Matrixlösung überlagern und bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen.
   3. Proteinextraktion im Röhrchen (Ethanol/Ameisensäure-Methode) - Verwenden Sie diese Methode für schwer zu identifizierende Mikroorganismen, einschließlich einiger grampositiver Bakterien, Hefen und Mykobakterien.
      1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schlaufe oder einem Tupfer 1-3 vollständige Kolonien von einer Agarkulturplatte in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μl sterilem Wasser.
      2. Fügen Sie 900 μl absolutes Ethanol hinzu, um die endgültige Ethanolkonzentration auf ca. 75 % einzustellen. Mischen oder einige Sekunden lang wirbeln.
      3. Zentrifugieren Sie die Probe 2 min lang bei 15.000 x g (Raumtemperatur).
      4. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören.
         HINWEIS: Bei Schleimhautstämmen wird eine zusätzliche Zentrifugation bei 4 °C empfohlen.
      5. Lassen Sie das Pelletrohr offen, bis das restliche Ethanol verdampft ist (5-10 min, Raumtemperatur).
      6. Geben Sie 20-50 μl 70%ige Ameisensäure (FA) zum getrockneten Zellpellet. Mischen Sie durch Pipettieren oder Vortexen, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist.
         HINWEIS: Das Volumen sollte proportional zur Menge an biologischem Material sein.
      7. Geben Sie ein gleiches Volumen Acetonitril (ACN) zur Ameisensäuresuspension. Vorsichtig mischen.
      8. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 2 min (Raumtemperatur).
      9. 1 μl des Überstands wird auf eine dafür vorgesehene Stelle auf einer MALDI-Zielplatte übertragen.
      10. Lassen Sie die Stelle bei Raumtemperatur vollständig an der Luft trocknen.
      11. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit 1 μl α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA)-Matrixlösung.
      12. Lassen Sie die Matrix vor der MS-Analyse vollständig bei Raumtemperatur an der Luft trocknen (Abbildung 1).
          HINWEIS: 70% Ameisensäure: ätzend; verursacht Verbrennungen. Griff in einem Abzug. Acetonitril: Entflammbar und giftig. Von Flammen fernhalten und Einatmen/Kontakt vermeiden. Trifluoressigsäure (TFA): Stark, ätzend und flüchtig; Haut-/Augenkontakt und Einatmen vermeiden. Tragen Sie immer einen Laborkittel, chemikalienbeständige Handschuhe und eine Schutzbrille. Behandeln Sie alle Reagenzien in einem Abzug, um ein Einatmen zu vermeiden. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt; Arbeiten Sie nicht in der Nähe von offenem Feuer. Sammeln Sie saure und organische Lösungsmittelabfälle in deutlich gekennzeichneten, kompatiblen Behältern zur ordnungsgemäßen Entsorgung.

Abbildung 1: Ein Entscheidungsbaum, der den Prozess der Auswahl eines geeigneten Probenvorbereitungsverfahrens für die Identifizierung von Bakterienisolaten über die MS-Technik visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Spektrenerfassung und mikrobielle Identifizierung mit der MS-Technik

1. Kalibrierung
   HINWEIS: Für eine genaue Massenbestimmung in MS kalibrieren Sie das Gerät vor der Analyse unbekannter Proben mit geeigneten Standards. Die richtige Kalibrierung des Geräts ist für eine zuverlässige Identifizierung von entscheidender Bedeutung.
   1. Kalibrator-Spots auf der MALDI-Zielplatte vorbereiten, die 1 μl enthalten: (a) Bakterieller Teststandard (BTS), der einen Extrakt aus Escherichia coli DH5 alpha enthält und einen Massenbereich von 3,6-17 kDa abdeckt (für MBT-Biotyper); (b) Mikrobiologie-Kalibrator mit E . coli ATCC 25922-Proteinextrakt, Ribonuklease und Myoglobin, das einen Massenbereich von 3,6 bis 17 kDa abdeckt (für EXS2600 System). Lassen Sie die getrockneten Kalibratorflecken an der Luft trocknen und überlagern Sie sie mit 1 μl HCCA-Matrixlösung, ähnlich wie bei der Probenvorbereitung.
   2. Legen Sie die MALDI-Zielplatte mit den vorbereiteten Proben und Kalibrierungsspots in das Gerät ein. Führen Sie die Analyse für kalibrierende Spots im Kalibrierungsmodus (automatisch) durch.
   3. Überprüfen Sie die Kalibrierung, um sicherzustellen, dass die Massengenauigkeit über den angegebenen Massenbereich (2-20 kDa) innerhalb akzeptabler Grenzen (100 ppm) liegt.
2. Erfassung von Spektren
   HINWEIS: Wenn das Gerät kalibriert ist, werden Massenspektren von jedem vorbereiteten Probenfleck erfasst.
   1. Allgemeine Akquisitionsparameter
      1. Betreiben Sie das Massenspektrometer im linearen positiven Ionenmodus.
      2. Stellen Sie den Massenerfassungsbereich von 2.000 bis 20.000 m/z (2-20 kDa) ein.
   2. Verwenden Sie die folgenden gerätespezifischen Einstellungen
      1. Spannungen der Ionenquelle: Ionenquelle 1 (IS1) bei 20 kV, Ionenquelle 2 (IS2) bei 18 kV, Linsenspannung bei 9 kV. Die Beschleunigungsspannung kann bis zu 25 kV betragen.
      2. Detektorspannung: Eingestellt auf ca. 2,65 kV.
      3. Einstellungen für die Extraktion gepulster Ionen: 100 ns, verzögerte Extraktionszeit auf 230 ns festgelegt.
      4. Einstellungen für die Laserleistung: Passen Sie sie manuell an, um die beste Spektrumsqualität (unter Berücksichtigung der Anzahl der Signale und Signalintensitäten) zu erhalten, die in der Regel zwischen 40 % und 65 % der minimal erforderlichen Leistung liegt.
      5. Anzahl der Schüsse pro Spektrum: Erfassen Sie eine ausreichende Anzahl von Laserschüssen aus verschiedenen Bereichen jedes Spots, um ein Summenspektrum mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) zu erzeugen→ (a) durchschnittlich 200 Aufnahmen, die in 50-Schuss-Schritten aus 4 verschiedenen Regionen jedes Spots aufgenommen wurden, oder (b) Erfassung in 500 Schussschritten - 50 Aufnahmen aus zehn verschiedenen Positionen des Zielpunkts im AutoXecute-Modus.
   3. Strategie zur Messung von Stichproben
      1. Messen Sie mehrere Spots pro Isolat (mindestens 2 Spots pro Isolat).
      2. Erfassen Sie Spektren in Replikation für jeden Spot, um Konsistenz und Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten → messen Sie in doppelter Ausführung, mit dem Ziel einer bestimmten Anzahl von Gesamtspektren pro Probe (mindestens 4 Spektren pro Probe → technische Replikate).
         HINWEIS: Untersuchen Sie biologische Proben (mindestens 3), um biologische Replikate zu erhalten.

4. Identifizierung von Mikroorganismen und Datenanalyse

HINWEIS: Die Identifizierung des Organismus erfolgt durch den Vergleich des erhaltenen Proteinprofils (spezifischer Protein-"Fingerabdruck" des Mikroorganismus) mit einer Referenzdatenbank, und die resultierende Korrelation von Signalposition und -intensität wird verwendet, um einen Matching-Wert zu generieren, der das Konfidenzniveau beschreibt, mit dem der untersuchte Organismus mit seinem entsprechenden Referenzmikroorganismus abgeglichen wurde. Identifizieren Sie Mikroorganismen, indem Sie verarbeitete Spektren mit Referenzdatenbanken vergleichen.

1. Verarbeitung von Spektren
   1. Verwenden Sie geeignete Software für die Spektrenverarbeitung: (a) flexAnalysis für MALDI Biotyper-Systeme oder (b) EX-Accuspec für EXS2600 Systeme.
   2. Wenden Sie eine Savitzky-Golay-Methode als Glättungsalgorithmus an (Breite 2 m/z, 10 Zyklen).
   3. Führen Sie eine Grundlinienkorrektur durch, um Hintergrundgeräusche mit dem TopHat-Algorithmus zu entfernen (S/N-Schwellenwert = 2, TopHat-Filterbreite 0,2 Da ).
   4. Verwenden Sie einen Schwerpunktmodus als Peak-Erkennungsalgorithmus (S/N-Schwellenwert = 2 ).
2. Datenbankvergleich und Interpretation der Punktzahl
   1. Laden Sie die verarbeiteten Massenspektren unbekannter Isolate auf die MALDI-Plattform zur mikrobiellen Identifizierung hoch. Führen Sie anschließend die Identifizierung aus.
      HINWEIS: In diesen Studien wurde folgende Software verwendet: Biotyper Version 4.1.100, Ex-Accuspec Version V1. Im Falle der MALDI Biotyper-Software wird die Erstellung von Hauptspektren (MSPs) aus Rohspektren empfohlen, um die beste Übereinstimmungszuverlässigkeit zu gewährleisten.
   2. Werten Sie die Identifizierungsergebnisse gemäß den vom Hersteller üblichen Schwellenwerten aus.
      HINWEIS: Für MALDI Biotyper und EXS2600 sind die Score-Werte:
      2.300-3.000: sehr wahrscheinliche Artbestimmung;
      2.000-2.299: sichere Gattungsidentifikation, wahrscheinliche Artbestimmung;
      1.700-1.999: wahrscheinliche Gattungsidentifikation;
      0.000-1.699: keine zuverlässige Identifikation.
      Bei der Auswertung des Bestimmungsergebnisses, das von der MALDI-Biotyper-Plattform abgeleitet wurde, unterstützen Sie die Ergebnisse anhand von Konsistenzkategorien: A- Spezies konsistent → beste Übereinstimmung und alle anderen Übereinstimmungen mit einem ähnlich hohen Punktzahlwert (>1.999 ) weisen auf dieselbe Art hin; B - Gattung Konsistent → beste Übereinstimmung und andere Übereinstimmungen mit ähnlichen Werten (1,700 - 1,999) weisen auf dieselbe Gattung hin, können sich aber auf Artebene unterscheiden. C- Keine Konsistenz → Anforderungen an die Konsistenz auf Art- oder Gattungsebene wurden nicht erfüllt.

Ergebnisse

Kulturomischer Ansatz
Der kulturelle Ansatz ist eine Strategie, die darauf abzielt, die Bedingungen für die Kultivierung von Mikroorganismen maximal zu diversifizieren, um die Chancen zu erhöhen, unter anderem seltene, schwer zu kultivierende oder bisher unbeschriebene Arten^{zu isolieren 12}. Dies ermöglicht es, ein viel breiteres Bild der Artenvielfalt der Mikroflora zu erhalten, die in verschiedenen Proben, z. B. Lebensmittelproben, vorhanden i...

Diskussion

Das Protokoll für die mikrobielle Identifizierung von Milchprodukten bietet einen wichtigen Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden, indem es einen optimalen Konsens über Geschwindigkeit, Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz gewährleistet. Nichtsdestotrotz erfordern einige entscheidende Schritte innerhalb des Protokolls besondere Aufmerksamkeit. Erstens ist die Isolations- und Kultivierungsphase grundlegend. Die Nährmedien und Inkubationsbedingungen müssen der erwarteten mikrobiellen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
70 % Ameisensäure	Chempur	115676307
Acetonitril	Merck KGaA	1.00014.1011
APT agar	Merck KGaA	1.10453.0500
Bakterienteststandard	Bruker Daltonik GmbH	8255343
CBL Agar (China Blue Laktose-Agar)	Merck KGaA	1.02348.0500
Columbia Blood Agar	Oxoid	CM0331B
M17 Agar
Milchplatten-Zähl-Agar (MPCA)	Oxoid	cm0681
MRS agar (de Man, Rogosa und Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 zielt auf polierte Stahl-BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Peptonwasser	Sigma-Aldrich	70179
Scheadler agar	Sigma-Aldrich	91019
Schafblut	Biomaxima	SL0160-100
Trifluoressigsäure	Sigma-Aldrich	T6508
Tryptisches Sojaagar (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Wasser	Merck KGaA	1.15333.2500
α-Cyano-4-Hydroxycinnaminsäure	Bruker Daltonik GmbH	8201344