Methodenartikel

Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

DOI:

10.3791/68995

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16. September 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, Zellmetaboliten für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) zu konservieren, indem es das Waschen flüchtiger Salzlösungen, das schnelle Abschrecken von flüssigem Stickstoff, die Gefriertrocknung und die Lagerung bei -8 °C kombiniert. Es zeigt, dass die Abschreckung von flüssigem Stickstoff für die Aufrechterhaltung von Metabolitenprofilen unerlässlich ist, während eine längere Kühllagerung minimiert werden sollte, um metabolische Veränderungen zu vermeiden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung des zellulären Stoffwechsels geworden. Aufgrund der Fortschritte in der modernen Massenspektrometrie (MS) und der Nachfrage nach Studien zur Zellheterogenität in den biologischen Grundlagenwissenschaften und bei menschlichen Krankheiten wurde eine Vielzahl verschiedener SCMS-Techniken entwickelt und in der Laborforschung eingesetzt. Da Metaboliten den Zellstatus genau widerspiegeln können, gilt die SCMS-Metabolomik-Analyse lebender Zellen als ein leistungsfähiges Werkzeug, um molekulare Informationen über Zellen zu liefern. Eine große Herausforderung bei der SCMS-Analyse lebender Zellen besteht jedoch darin, die endogenen Metabolitenprofile während der Probenvorbereitung, des Transports und der Messung zu erhalten. Zelluläre Metaboliten durchlaufen einen schnellen Umsatz und reagieren sehr empfindlich auf Umweltveränderungen, was sie anfällig für Abbau oder Umwandlung vor der Analyse macht. Um diese Einschränkung zu beheben, stellen wir ein robustes und reproduzierbares Zellpräparationsprotokoll vor, das entwickelt wurde, um die Integrität der zellulären Metaboliten für SCMS zu erhalten. Das Protokoll integriert das Waschen der Zellen mit einer Lösung aus flüchtigem Ammoniumformiat (AF), das schnelle Abschrecken mit flüssigem Stickstoff (LN2), die Vakuum-Gefriertrocknung und die Lagerung bei -80 °C. Dieser Ansatz minimiert die Schädigung der Zellmembran und stoppt gleichzeitig effektiv die Stoffwechselaktivität. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine schnelle Zelllöschung von entscheidender Bedeutung ist. Eine Begrenzung der Lagerzeit auf -80 °C ist jedoch notwendig, um die Zellmetaboliten zu erhalten. Das vorgeschlagene Protokoll kann möglicherweise für andere bestehende SCMS-Techniken für breite Anwendungen verwendet werden.

Einleitung

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Die Heterogenität von Zelle zu Zelle hat sich zu einem grundlegenden Prinzip biologischer Systeme entwickelt, insbesondere im Kontext des Krankheitsverlaufs, der Arzneimittelresistenz und der zellulären Differenzierung 1,2. In mehrzelligen Organismen können selbst genetisch identische Zellen in derselben Mikroumgebung unterschiedliche Phänotypen aufweisen, die sich aus Unterschieden auf der transkriptomischen3, der proteomischen4 und vor allem der metabolomischenEbene 5 ergeben. Während die Einzelzellgenomik und Transkriptomik in den letzten zehn Jahren erheblich an Bedeutung gewonnen haben, ist die Einzelzell-Metabolomik aufgrund der inhärenten Komplexität und schnellen Dynamik der Metaboliten nach wie vor vergleichsweise unterentwickelt6. Metaboliten reagieren sehr empfindlich auf Umwelteinflüsse, haben unterschiedliche chemische Strukturen und Polaritäten7 und liegen in geringen Konzentrationen in kleinen Zellvoluminavor 8. Diese Eigenschaften machen die zuverlässige Messung an einzelnen Zellen zu einer analytischen Herausforderung. Da die Metabolomik die genaueste Momentaufnahme des Echtzeit-Funktionszustands einer Zelle bietet, ist die Weiterentwicklung von Methoden zur robusten Untersuchung des Metaboloms mit Einzelzellauflösung für ein tieferes Verständnis der zellulären Physiologie und Pathologie unerlässlich7.

Traditionelle Bulk-Metabolomik-Techniken mittelnieren Signale über große Zellpopulationen, maskieren die zelluläre Heterogenität und verschleiern möglicherweise seltene, aber signifikante Stoffwechselsignaturen. Im Gegensatz dazu zeigt die Einzelzell-Metabolomik einzigartige biochemische Profile auf der Ebene einzelner Zellen, was sie von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von Prozessen wie Stammzelldifferenzierung, Arzneimittelreaktionen und Krankheitsmechanismen macht 6,9,10,11,12,13. Auf Massenspektrometrie (MS) basierende Methoden, wie z. B. die matrixgestützte Laserdesorption-Ionisation (MALDI) MS und die Sekundärionen-MS (SI), haben das Gebiet vorangetrieben, stehen jedoch vor Herausforderungen wie komplexer Präparation, Vakuumanforderungen und destruktiver Ionisation, die die Lebendzellanalyse einschränken 9,14. Insbesondere die jüngsten Entwicklungen in der Instrumentierung führten zu hochmodernen Techniken, darunter die Transmissionsmoden-MALDI in Verbindung mit laserinduzierter Postionisation (t-MALDI-215) und die Orbitrap-Sekundärionen-Massenspektrometrie (OrbiSIMS)16,17, die eine markierungsfreie, hochauflösende 3D-Stoffwechselbildgebung auf Einzelzell- und subzellulärer Ebene ermöglichten und eine außergewöhnliche Massengenauigkeit und räumliche Auflösung bieten.

Die Umgebungsionisation MS befasst sich mit diesen Problemen. Zu den repräsentativen Umgebungs-SCMS-Techniken gehören die Live-Einzelzell-Video-Massenspektrometrie (Video-MS)18, DESI19 und nano-DESI20. Unter ihnen ist das SCMS mit einer Sonde eine der Techniken, die sich durch ihre Fähigkeit auszeichnet, lebende Zellen in Echtzeit mit einem Doppelkapillarsystem 21,22,23,24 direkt zu entnehmen und zu ionisieren. Diese Technik minimiert die Störung der Proben und ermöglicht gleichzeitig eine hochauflösende In-situ-Erstellung von metabolischen Profilen und wurde erfolgreich in Studien zur Wirkstoffaufnahme und zum Einfluss auf den Zellstoffwechsel 22,25,26,27,28,29,30, Umweltreaktionen 31,32 und metabolische Heterogenität33 angewendet. 34,35,36 unter den einzelnen Zellen.

Während viele umgebungsbezogene SCMS-Methoden die Analyse lebender Zellen ermöglichen, leiden sie in der Regel unter einem geringen Durchsatz aufgrund der manuellen Handhabung, die für die Auswahl einzelner Zellen erforderlich ist 23,37,38. Da der Zellstoffwechsel hochdynamisch ist, kann eine ausgedehnte Probenvorbereitung die Metabolitenprofile verändern. Um dies zu beheben, wenden die Forscher Quenchtechniken unmittelbar nach der Isolierung der Zellen an39,40. Durch das Quenchen wird die Stoffwechselaktivität entweder durch schnelles Abkühlen 41,42,43,44 oder durch Enzymdenaturierung 43,45,46,47 gestoppt, wodurch der biochemische Zustand der Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt erhalten bleibt. Dieser Schritt ist wichtig, um genaue und zeitlich relevante metabolomische Daten zu gewährleisten. Ein wirksames Quenching-Protokoll muss die intrazelluläre Stoffwechselaktivität schnell und gründlich stoppen. Es wurden verschiedene Methoden evaluiert, darunter kalte isotonische Kochsalzlösung48, gekühltes Acetonitril46, kaltes Methanol 44,47,48,49, eiskalte Phosphatpufferlösung (PBS)43,50, LN2 43,44,51 und sogar Heißluftbehandlungen 52. Während viele von ihnen ursprünglich für die Metabolomik von Massenzellen entwickelt wurden, wurden einige, wie kaltes Methanol und Acetonitril, für Einzelzelltechniken wie Pico-ESI-MS39 und MALDI-MS46 angepasst. Trotz ihrer Wirksamkeit hat jede Methode Nachteile: Organische Lösungsmittel können Metabolitenleckagen und Schäden an den Zellmembranen verursachen48,53, und nichtflüchtige Salzlösungen können MS beeinträchtigen, indem sie eine Ionensuppressionverursachen 54, die Empfindlichkeit verringern und die Datengenauigkeit beeinträchtigen47,55.

Das LN 2-Schockfrosten wird häufig in der biologischen Forschung verwendet56, da es den Zellstoffwechsel schnell stoppt, ohne nichtflüchtige Salze zu hinterlassen, was es gut für SCMS geeignet macht. Es kann jedoch Zellmembranen schädigen, was für SCMS57,58 problematisch ist. Um diesen Schaden zu verringern, wurde in einigen Studien eine Methode verwendet, die eine schnelle Filtration, kaltes NaCl-Waschen und LN 2-Einfrieren umfasst, die dazu beiträgt, schnell umsatzstarke Metaboliten zurückzuhalten 53,59. Dennoch ist diese Methode nicht ideal für SCMS, da es schwierig ist, einzelne Zellen zu isolieren und Matrixeffekte aus Salzrückständen auftreten können. Die Lagerung bei -80 °C ist eine weitere gängige Konservierungsmethode, deren Auswirkungen auf einzellige Metabolitenprofile jedoch unklar bleiben. Wir haben bereits über Studien berichtet, die diese Einschränkungen durch die Kombination mehrerer wichtiger Schritte beheben: Die Zellen werden zuerst mit einer flüchtigen, MS-kompatiblen AF-Lösung gewaschen, dann mit LN2 abgeschreckt, vakuumgefriergetrocknet und bei niedriger Temperatur (-80 °C)60 gelagert. Der derzeitige Ansatz minimiert Zellschäden und den Abbau von Metaboliten und ermöglicht so genauere SCMS-Messungen. Diese Arbeit konzentriert sich auf experimentelle Details und zielt darauf ab, die Einführung dieser Zellpräparationsmethode für robuste SCMS-Techniken zu fördern.

Protokoll

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Führen Sie jeden Schritt in einem zertifizierten Biosicherheitslabor der Klasse II und unter sterilen Bedingungen durch. In dieser Studie wurde die HCT-116-Zelllinie als Modellsystem verwendet, und die Zellen wurden in vollständigem Kulturmedium kultiviert. Die Regenten und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur

  1. Bereiten Sie das komplette Medium vor. Ergänzen Sie McCoy's 5A Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Erwärmen Sie es auf 37 °C.
  2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Überwachen Sie die Konfluenz täglich und den Durchgang, wenn die Kulturen eine Konfluenz von ~80 % erreichen.
  3. Durchgang der Zellen (alle ~2 Tage).
    1. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie es einmal mit 5 ml 1x PBS aus.
    2. 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA in die Kulturschale geben und 3 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die Zellablösung zu erleichtern.
    3. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 8 ml vorgewärmtes Vollmedium hinzufügen und vorsichtig pipettieren, um die Zellen zu dispergieren.
    4. 1 ml der Suspension in 9 ml frisches vollständiges Medium überführen.
    5. Zählen Sie die Zellen.
      HINWEIS: Die Zellen wurden mit einem TC20 Automated Cell Counter gemäß den Anweisungen des Herstellers gezählt. Trypanblau oder andere Färbemittel wurden nicht verwendet.
  4. Samenzellen auf den Deckgläsern.
    1. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von ~1 × 106 Zellen/ml.
    2. Legen Sie die einzelnen 18-mm-Glasdeckgläser in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte.
      HINWEIS: Glasdeckgläser müssen autoklaviert werden, bevor sie für die Zellkultur verwendet werden.
    3. Fügen Sie 2 ml des gesamten Mediums und 200 μl der Zellsuspension hinzu (~2 × 105 Zellen/Well).
    4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um die Zellanheftung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass sich die Zellen in einem normalen Wachstumszustand befinden, überprüfen Sie routinemäßig die Morphologie und den Wachstumsstatus der Zellen (mit einem Mikroskop) und untersuchen Sie eine mögliche Mykoplasmenkontamination (mit einem Mykoplasmen-Nachweiskit).

2. Zellwäsche mit Ammoniumformiat-Lösung (AF)

HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal eine neue AF-Lösung vor.

  1. Bereiten Sie den AF-Waschpuffer vor. Wiegen Sie 0,45 g Ammoniumformiat ab und lösen Sie es in 50 ml Wasser der Qualität LC/MS auf. Die Endkonzentration von Ammoniumformiat beträgt 0,14 M (0,9 % w/w).
    HINWEIS: Bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung eiskalt (0-4 °C) auf.
  2. Geben Sie 2 ml kalte AF-Lösung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte.
  3. Spülen Sie die Deckgläser aus. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette jedes Deckglas, das adhärente Zellen enthält, vorsichtig aus seiner Vertiefung und legen Sie es dann kurz (für 2-3 s) in eine separate Vertiefung, die mit 2 ml kalter 0,9%iger Ammoniumformiat-Lösung (AF) vorgefüllt ist. Wiederholen Sie den Spülvorgang.
    HINWEIS: Um eine Störung der Zellen während des Waschvorgangs zu vermeiden, führen Sie die Zellen sehr vorsichtig aus.

3. Zelllöschung mit flüssigem Stickstoff (LN2)

  1. Legen Sie jedes mit AF gespülte Deckglas (Zellen nach oben) in die Petrischale in den Aluminiumfolienbehälter.
    HINWEIS: Tragen Sie kryogene Handschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. Führen Sie die gesamte LN2-Handhabung in einem gut belüfteten Bereich durch. Aluminiumfolie kann verwendet werden, um einen Behälter für das Abschrecken von LN2 zu falten.
  2. Gießen Sie langsam 10-20 ml flüssigen Stickstoff über die Deckgläser, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten.
  3. Kippen Sie die Petrischale sofort mit einer Pinzette, um den restlichen flüssigen Stickstoff zu dekantieren.
    HINWEIS: Führen Sie diese Aktion innerhalb weniger Sekunden durch, um die Bildung großer Eiskristalle durch Restwaschfeuchtigkeit zu verhindern.

4. Gefriertrocknung der Zellen im Vakuum

  1. Unmittelbar nach dem Abschrecken von LN2 gefriertrocknen, um ein Auftauen zu verhindern.
    HINWEIS: Entfernen Sie den Rotor des SpeedVac, um eine flache Plattform zu schaffen, die eine 100-mm-Petrischale aufnehmen kann.
  2. Setzen Sie die Petrischale mit den gekühlten Deckgläsern LN2 mit Kryohandschuhen und einer isolierten Pinzette auf die Vakuumkonzentratorkammer.
  3. Mit den Standard-Vakuumeinstellungen fortfahren und 5-7 Minuten lang fortfahren, bis das sichtbare LN2 verdunstet ist und die Deckgläser trocken erscheinen. Getrocknete Deckgläser sollten keine Rückstände von LN2 und Eiskristallen enthalten.

5. Lagerung der Zellen in einem -80 °C Gefrierschrank

  1. Wickeln Sie den Behälter mit einem Papiertuch ein und stellen Sie ihn für 48 h in einen -80 °C Gefrierschrank.
  2. Nach der Lagerung die Deckgläser mit der Petrischale sofort für ~10 min in einen Exsikkator bei Raumtemperatur geben. Stellen Sie sicher, dass kondensierter Frost oder Wasser auf Deckgläsern vollständig verschwindet, bevor Sie sie aus dem Exsikkator nehmen.
    HINWEIS: Durch das schnelle Übertragen der Deckgläser in den Exsikkator wird die Kondensation minimiert. Bereits eine geringe Oberflächenbenetzung kann getrocknete Metaboliten auflösen.
  3. Teilen Sie die Proben nach dem AF-Waschen in zwei Gruppen (Gruppe 1 und Gruppe 2) ein. Wenden Sie die folgenden Verarbeitungsprotokolle an.
    Gruppe 1: LN2 Quench → Gefriertrocknung → SCMS-Analyse (keine Lagerung).
    Gruppe 2: LN2 Quench → Gefriertrocknung → -80 °C Lagerung 48 h → SCMS-Analyse.
  4. Fahren Sie mit der SCMS-Analyse wie unten beschrieben fort.
    HINWEIS: Unter verschiedenen Bedingungen können weitere Zellgruppen vorbereitet werden. Gruppe 1 und Gruppe 2 werden zur Veranschaulichung der allgemeinen Protokolle verwendet.

6. Herstellung von Einzelsonden und SCMS-Einrichtung

HINWEIS: Die Einzelsonde wird in Übereinstimmung mit den etablierten Verfahren 21,24,60,61 hergestellt, und hier werden nur kurze Protokolle bereitgestellt.

  1. Ziehen Sie die Quarznadel mit doppelter Bohrung mit einem Laserabzieher und erzeugen Sie eine ~10 μm Spitze. Bauen Sie eine Einzelsonde zusammen, indem Sie die Quarzglaskapillare und den Nano-ESI-Emitter in die Quarznadel mit zwei Bohrungen einführen. Befestigen Sie alle Komponenten mit schnell abbindendem Epoxidharz auf einem Objektträger.
  2. Montieren Sie die Einzelsonde auf dem XYZ-Tisch. Befestigen Sie die Einzelsonde an einem motorisierten XYZ-Manipulator, der unter einem Digitalmikroskop positioniert ist.
  3. Koppeln Sie das Setup an ein Massenspektrometer für die SCMS-Analyse.
  4. Verwenden Sie Acetonitril (≥99,9 %) mit 0,1 % Ameisensäure als Extraktionslösungsmittel bei einer Durchflussrate von 150 nL/min, die von einer Spritzenpumpe abgegeben wird.
  5. Stellen Sie die MS-Parameter ein.
    Positiver Ionenmodus: m/z 200-1500, +2,9 kV, Massenauflösung 120 k (bei m/z 200).
    Negativer Ionenmodus: m/z 70-900, −2,1 kV, Massenauflösung 120 k (bei m/z 200).
    HINWEIS: Da negative Ionen im Allgemeinen im unteren m/z-Bereich als positive Ionen detektiert werden, können für diese beiden Ionenmodi unterschiedliche m/z-Bereiche verwendet werden. Zu den zusätzlichen MS-Einstellungen gehören eine maximale Injektionszeit von 100 ms, ein Mikroscan, eine standardmäßige automatische Verstärkungsregelung (AGC), ein vollständiger Scan-Modus (für die MS-Analyse), eine Kollisionsdissoziation (HCD) mit höherer Energie (HCD) (für die MS/MS-Analyse) mit 10-35 normalisierter Kollisionsenergie (NCE) und 320 °C für die Temperatur der Ionentransferröhre. Zu jedem Scan/Zeitpunkt wurde ein Totalionenchromatogramm (TIC) erstellt, um die Signalstabilität und die Einzelzelldetektion zu überwachen.

7. SCMS-Experimente mit einer Sonde

  1. Platzieren Sie die beiden Deckgläser (Gruppe 1 und Gruppe 2) zusammen auf dem motorisierten XYZ-Tisch des Einzelsonden-SCMS-Aufbaus 21,24,61.
  2. Um Batch-Effekte zu minimieren, wählen Sie die Zellen nach dem Zufallsprinzip unter dem Mikroskop aus.
  3. Erfassen Sie positive und negative Ionenmoden-Massenspektren. Analysieren Sie mehrere (z. B. ~30) Zellen pro Gruppe mit der gleichen Einzelsonde, der gleichen Lösungsmittelflussrate und der gleichen Ionisationsspannung.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Experiment die gleiche Einzelsonde, die gleiche Lösungsmittelflussrate und die gleichen Ionisationsspannungen, um die Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten. Kalibrieren Sie den Orbitrap täglich vor der Anschaffung. Sowohl MS- als auch MS/MS-Analysen können auf Einzelzellebene durchgeführt werden. Sammeln Sie MS-Daten, um genaue m/z-Werte für Studien von Metabolitenprofilen und vorläufigen Markierungen in nicht zielgerichteten Analysen zu erhalten. Durchführung von MS/MS-Analysen ausgewählter Ionen zur molekularen Identifizierung in der gezielten Analyse. Die Daten wurden mit einer kompatiblen Datenerfassungs- und Interpretationssoftware erfasst.

8. Datenanalyse

  1. Verarbeiten Sie die SCMS-Rohdaten mit einem benutzerdefinierten R-Skript vor. Zu den Vorverarbeitungsschritten gehören die Entfernung von Hintergrund- und Rauschen sowie die Normalisierung der Ionenintensität auf TIC 11,12,23.
  2. Deisotopieren Sie die SCMS-Daten mit dem Python-Paket ms_deisotope.
  3. Führen Sie die Peak-Ausrichtung mit einem internen Python-Skript60 durch. Verwenden Sie eine Bin-Breite von 0,01 m/z für das Binning. Verwenden Sie eine Massentoleranz von 0,01 m/z oder 5 ppm für die Peakausrichtung.
  4. Führen Sie statistische Datenanalysen mit MetaboAnalyst 6.062 durch. Führen Sie einen t-Test durch und erstellen Sie eine Heatmap (für die relativen Metabolitenwerte). Wählen Sie Top 100 im T-Test/ANOVA verwenden, um die Top 100 Metaboliten zu generieren, geordnet nach p-Werten von niedrig nach hoch, mit einer signifikanten Differenz (p < 0,05) zum Vergleich. Erstellen Sie eine Heatmap mit diesen 100 wichtigsten Metaboliten.
  5. Durchsuchen Sie genaue m/z-Werte und MS/MS-Spektren mit der Human Metabolome Database (HMDB63). Verwenden Sie eine Massentoleranz von 10 ppm bei der Suche in MS-Datenbanken.
    HINWEIS: Andere Datenbanken, wie z. B. LipidMaps64, können für die Datenbanksuche verwendet werden.

Ergebnisse

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Dieser Bericht beschreibt eine Methodik, die Zellwäsche, schnelles Abschrecken der Zellen, Vakuumtrocknung und Lagerung bei -80 °C integriert (Abbildung 1). Konkret ist dieser Ansatz darauf ausgelegt, den metabolomischen Zustand von Zellen vor der SCMS-Analyse zu erhalten. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wurde getestet, indem Zellen unter zwei verschiedenen Bedingungen vorbereitet wurden: frisch abgeschreckte und getrocknete Zellen (Gruppe 1, die als Kontrolle diente) und abgeschreckte, getrocknete und bei -80 °C gelagerte Zellen (Gruppe 2). Jede Gruppe wurde mit der Einzelsonden-SCMS-Methode sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus analysiert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Visualisierung von Heatmaps wurden verwendet, um die Unterschiede in den metabolomischen Profilen zwischen den Gruppen zu bewerten.

Die PCA-Ergebnisse im positiven Ionenmodus (Abbildung 2A) zeigten, dass die Gruppen 1 und 2 insgesamt ähnliche Metabolitenprofile aufwiesen. Die nahezu identischen Profile von Gruppe 1 und Gruppe 2 zeigen, dass eine Lagerung von -80 °C für 48 h das Metabolom nicht signifikant verändert, wenn die Zellen vor dem Trocknen richtig abgeschreckt werden. Im negativen Ionenmodus (Abbildung 2B) wird ein vergleichbares Muster beobachtet, obwohl Gruppe 2 etwas deutlicher zu sein scheint - möglicherweise aufgrund von Ionisationsunterschieden zwischen bestimmten Metabolitenklassen, z. B. werden Phosphatidylcholine im positiven Modus besser nachgewiesen, während Fettsäuren im negativen Modus effizienter ionisieren60. Trotz dieser Variation stützt die konsistente Clusterbildung zwischen den Gruppen 1 und 2 über beide Modi hinweg die Schlussfolgerung, dass das integrierte Abschreck-Trocknungs-Speicherprotokoll die metabolische Integrität aufrechterhält.

Die Heatmap-Analyse validierte die PCA-Ergebnisse weiter, indem sie die relativen Häufigkeiten der 100 wichtigsten Metaboliten in zwei Gruppen darstellte. Wie in Abbildung 3 gezeigt, weisen die Top-100-Metaboliten in beiden Ionenmodi sehr konsistente Abundanzmuster zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 auf. Es werden keine größeren Verschiebungen oder gruppenspezifische Clusterbildung beobachtet, obwohl geringfügige Variationen in einigen Metabolitenclustern Unterschiede in der Ionisationseffizienz oder Metabolitenstabilität widerspiegeln können. Diese Ergebnisse zeigen zusammengenommen, dass der Workflow des Abschreckens, Trocknens und Lagerns zelluläre metabolomische Profile mit hoher Genauigkeit bewahrt und sich daher gut für SCMS-Anwendungen in der Umgebungsumgebung eignet.

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Abbildung 1: Allgemeiner Arbeitsablauf für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS)-Analyse, bei der untersucht wird, wie sich LN 2-Quenching und 48-stündige Lagerung bei -80 °C auf die Metabolitenprofile in Einzelzellen auswirken. (A) Die Zellen wurden ausgesät, inkubiert und mit Ammoniumformat-Lösung (AF) gespült. (B) Zwei Zellgruppen wurden vorbereitet - Gruppe 1: Die Zellen wurden gewaschen, abgeschreckt und gefriergetrocknet für sofortige SCMS-Experimente ohne Lagerung; Gruppe 2: Die Zellen wurden gewaschen, abgeschreckt, gefriergetrocknet und bei -80 °C gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Hauptkomponentenanalyse (PCA) von SCMS-Daten von HCT-116-Zellen in Versuchsgruppen im (A) positiven Ionenmodus und (B) im negativen Ionenmodus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Heatmaps, die die relativen Konzentrationen der 100 wichtigsten Metaboliten zeigen, die in einzelnen HCT-116-Zellen nachgewiesen wurden, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt wurden, dargestellt für (A) den positiven Ionenmodus und (B) den negativen Ionenmodus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist das sofortige Abschrecken lebender Zellen mit LN2 nach dem Waschen mit Vorhofflimmern, wodurch die enzymatische Aktivität erheblich reduziert und laufende Stoffwechselprozesse gestoppt werden. Darüber hinaus erhöhte das Waschen von Zellen mit Vorhofflimmern vor dem Abschrecken die Ionenintensität und reduzierte Matrixeffekte, was die Einbeziehung als vorbereitenden Schritt zur Verbesserung der SCMS-Empfindlichkeit unterstützt. In den aktuellen Studien wurden Zellen in verschiedenen Gruppen (d. h. Gruppe 1 und Gruppe 2) mit der gleichen Anfangscharge kultiviert, um ihre biologische Varianz zu minimieren. Die Lagerzeit von 48 Stunden wurde gewählt, da Zellen mit zusätzlicher Wachstumszeit (Gruppe 1) immer noch geeignete Zelldichten (z. B. zur Vermeidung von Zellaggregaten) für eine vergleichende SCMS-Analyse mit gelagerten Zellen (Gruppe 2) beibehalten können. Bei einer Kühllagerung, auch für 48 h, ist jedoch Vorsicht geboten, da bei Vergleichen zwischen frisch getrockneten und gelagerten Proben immer noch signifikante metabolische Veränderungen beobachtet wurden (Gruppe 1 vs. Gruppe 2). Obwohl in aktuellen Studien Zell- und Gewebeproben üblicherweise über längere Zeiträume (z. B. Wochen und Monate) in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden, wird empfohlen, die Lagerzeit zu verkürzen, um Veränderungen der Metaboliten zu minimieren.

Die Fehlerbehebung sollte sich daher auf die Minimierung der Zeit zwischen Trocknung und SCMS-Analyse konzentrieren und sicherstellen, dass bei Abtaubedingungen Kondensation oder teilweise Rehydrierung vermieden werden. Der Restwassergehalt und die Wasserkondensation während des Probenübergangs können Zellen teilweise rehydrieren und enzymatische und chemische Reaktionen wie Hydrolyse, Oxidation und Proteolyse ermöglichen, die die Metaboliten65 abbauen, was zu künstlichen Veränderungen in der Metabolitenzusammensetzung führt. Gründlich getrocknete Proben stoppen diese Prozesse effektiv und bewahren die molekulare Integrität66. Die Gewährleistung einer feuchtigkeitsfreien Austrocknungsumgebung und ein schneller Übergang zu SCMS sind der Schlüssel zur Vermeidung dieser Fallstricke.

Trotz des Erfolgs dieser Methode bei der Erhaltung von Metabolitenprofilen bestehen nach wie vor Einschränkungen. Das Verfahren erfordert den Zugang zu einem Vakuumtrocknungssystem und einem -80 °C-Gefrierschrank und ist für die Langzeitlagerung nicht voll wirksam. Darüber hinaus sind die Metaboliten durch die schnelle Trocknung bei Raumtemperatur zwar vorübergehend erhalten, aber kein Ersatz für die LN2-Trocknung . Lagerungsbedingte Veränderungen können aufgrund einer unvollständigen Wasserentnahme und des Risikos einer Rehydrierung während der Probenhandhabung weiterhin auftreten. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit einer Methodenverfeinerung, wenn eine längere Lagerung oder ein höherer Durchsatz gewünscht wird.

Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle bieten einen vereinfachten und effektiven Ansatz zur Konservierung des einzelligen Metaboloms für SCMS in der Umgebung. Im Gegensatz zu Methoden, die aufwendige Kryoprotektiva oder In-situ-Gefrieren erfordern, ist unser Arbeitsablauf problemlos mit bestehenden Umgebungsionisationstechniken kompatibel und ermöglicht flexible Zeitpläne für die Probenahme und Analyse. Die Integration von Zellwäsche, Quenching, Trocknung und Kurzzeitlagerung ohne wesentlichen Verlust der Metabolomiktreue bietet eine praktische Lösung für Labore, die keinen On-Demand-Zugang zu Massenspektrometern haben. Dieser Ansatz birgt ein großes Potenzial für die Weiterentwicklung der Forschung in der Einzelzell-Systembiologie, dem Krebsstoffwechsel, der Heterogenität des Arzneimittelansprechens und der metabolischen Phänotypisierung seltener Zellpopulationen. Die breite Anwendbarkeit dieser Protokolle, insbesondere für umgebungsionisationsbasierte SCMS-Plattformen, macht sie zu einem wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der Einzelzell-Analysetechniken. In zukünftigen Studien können diese Protokolle angepasst und verfeinert werden, um eine größere Vielfalt von Zelltypen zu berücksichtigen. Mit zusätzlichen Schritten zur Probenvorbereitung (z. B. Matrixanwendung) können die prozessierten Zellen potenziell mit anderen SCMS-Techniken (z. B. MALDI und SIMS) analysiert werden, was eine höhere räumliche Auflösung und einen höheren Durchsatz für die Analyse einer größeren Anzahl von Zellen (z. B. hochkonfluente Zellen) bietet. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass diese Abschreck-Trocknungs-Lager-Protokolle möglicherweise verwendet werden können, um Zellen für den Versand vorzubereiten (z. B. in Trockeneisbehältern), was kollaborative SCMS-Studien an verschiedenen Standorten ermöglicht.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Science Foundation (2305182), den National Institutes of Health (1R01AI177469) und der Chan Zuckerberg Initiative unterstützt. Abbildung 1 wurde in BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk) erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
-80 Grad C GefrierschrankEppendorf, New BrunswickU700Probenvorbereitung
AcetontrilThermoFisher Scientific240744Aufbau des SCMS-Experiments
Ammoniumformiat ThermoFisher Scientific401152500Probenvorbereitung
Deckglas 18 mmVMR Mikro-Deckglas48380046Zellkultur
Digitales StereomikroskopShenzhen D& F Co.Superaugen T004Analyse
Quarzrohr mit doppelter Bohrung, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QHerstellung mit einer Sonde
EpoxydharzDevcon (Englisch)Art.-Nr. 20945Herstellung mit einer Sonde
AmeisensäureWards Wissenschaft 470301-120 500 mlAufbau des SCMS-Experiments
Quarzglas-Kapillare, ID: 40 µ m, AD: 100 µ mPolymicro TechnologiesTSP040105Herstellung mit einer Sonde
Quarzglas-Kapillare, ID: 50 µ m, OD: 150 µ mPolymicro Technologies1068150015Aufbau des SCMS-Experiments
Abdeckgläser aus Glas, 18mmVWR 48380046Zellkultur
HyClone Synthetisches Serum (FBS)HyklonSH3006603Zellkultur
Brutkasten HeraCell (Heraeus)Zellkultur
Laser-AbzieherSutter Instrument Co.Modell P-2000Herstellung mit einer Sonde
LED-UV-LampeFoshan Liang Ya DentalgeräteLY-C240Herstellung mit einer Sonde
McCoy's 5A Gibco 2537128Zellkultur
MikrounionIDEX Gesundheit & Gesundheit Wissenschaft GmbHM-539Aufbau des SCMS-Experiments
Modifizierte FAIMS pro-Schnittstelle Thermo Fischer 98100-20046Analyse
MycoAlert PLUS Mykoplasmen-NachweiskitLonzaNr. LT07-703Zellkultur
Optische Platine Thorlabs Inc., NewtonAnalyse
Optima Wasser in LC/MS-Qualität (Fisher Chemical, USA)ThermoFisher ScientificW6500Probenvorbereitung
Orbitrap Exploris 240 Massenspektrometer ThermoFisher ScientificAufbau des SCMS-Experiments
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Zellkultur
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)VWR0780-50LZellkultur
SpeedVac Konzentrator (Savant)ThermoFisher Scientific SPD111 VProbenvorbereitung
Spritzenpumpe (SKE10)Chemyx Inc.80561Aufbau des SCMS-Experiments
Spritze, 250 & Mikro; LHamiltonArtikel-Nr.: 1725LTN250ULAufbau des SCMS-Experiments
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-Rad Laboratorien Artikel-Nr.: 1450102EDUZellzahl
Gewebekulturschale, 100mmFischer wissenschaftlich FB012924Zellkultur
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific25200-072Zellkultur
USB-Digitalmikroskop ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion, Großhandel Ltd.Analyse
UV-härtendes HarzPrime DentalArtikel-Nr. 006.030Herstellung mit einer Sonde
Xcalibur-SoftwareThermoFisher Scientific
XYZ-Tisch (CONEX- MFACC)Newport Corp.Analyse

Referenzen

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