Präzise Induktion und Unterscheidung von Husten- und Niesreflexen bei Mäusen

Zusammenfassung

In dieser Studie wurden Husten- und Niesmodelle bei Mäusen etabliert, indem spezifische Reize auf die Luftröhre und die Nasenhöhle angewendet wurden, und es wurde eine audiobasierte Methode entwickelt, um zwischen Husten und Niesen von Mäusen zu unterscheiden, indem Unterschiede in ihren akustischen Signalen analysiert wurden.

Zusammenfassung

Husten und Niesen als lebenswichtige Abwehrreflexe der Atemwege haben dazu geführt, dass ihre Mechanismen durch die unspezifische Stimulation traditioneller Modelle eingeschränkt werden. Bestehende Methoden, wie die Vernebelung von Capsaicin oder Zitronensäure, können gleichzeitig Husten (vermittelt durch Tracheal-C-Fasern) und Niesen (vermittelt durch die Trigeminusnerven der Nase) aktivieren, was zu verwirrenden Verhaltensbeobachtungen führt. Obwohl frühere Studien versucht haben, Husten und Niesen durch die Analyse von Atemmustern oder akustischen Signaturen zu unterscheiden, fehlen diesen Studien Modelle, die die Luftröhre und die Nasenhöhle spezifisch stimulieren können. In dieser Arbeit haben wir ein Mausmodell entwickelt, das eine ortsspezifische Stimulation der Luftröhre (zur Induktion von Husten) und der Nasenhöhle (zum Auslösen des Nieseses) verwendet. Mit Hilfe von synchronisierten multimodalen Aufnahmen, Ganzkörperplethysmographie (WBP), Breitband-Ultraschallmikrofonen (0-250 kHz) und Hochgeschwindigkeitsvideografie (160 fps) quantifizierten wir unterschiedliche physiologische Signaturen von Husten und Niesen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl Husten als auch Niesen Atmungsmuster mit einem und zwei Spitzen aufweisen, mit signifikanten Unterschieden in der Zusammensetzung ihrer Audiofrequenzspektren. Durch die Konstruktion eines Koordinatensystems auf der Grundlage von Audiomerkmalen waren wir in der Lage, Husten und Niesen effektiv zu unterscheiden und sie verschiedenen Quadranten der Koordinatenachse zuzuordnen. Diese Studie etablierte durch anatomisch spezifische Stimulation und akustische Merkmalsanalyse ein Mausmodell, das in der Lage ist, quantitativ zwischen Husten und Niesen zu unterscheiden, und bietet damit eine hochpräzise experimentelle Methode zur Untersuchung der Abwehrreflexe der Atemwege und zur gezielten therapeutischen Entwicklung.

Einleitung

Husten und Niesen sind entscheidende Abwehrreflexe für den Körper, um Fremdstoffe aus den Atemwegen zu entfernen, und Anomalien in den damit verbundenen Nervenbahnen lösen oft chronische Krankheiten wie chronischen Husten und Rhinitis aus. Bei beiden Reflexen handelt es sich um eine inspiratorische Phase, eine kompressive Phase und eine exspiratorische Phase ^1,2. Der Hustenreflex wird hauptsächlich durch sensorische Neuronen der Atemwege vermittelt, die vom Vagusnerv innerviert werden ^3,4,5. Vagus-Neuronen erhalten mechanische, chemische oder elektrische Reize von den Atemwegen und leiten die Signale an den Nucleus tractus solitarius (NTS) in der Medulla oblongata^{weiter 6}. Das NTS integriert diese Informationen und projiziert sie anschließend an die Atemzentren in der Medulla und im Pons⁷. Diese Zentren koordinieren letztlich relevante Atemmuskelgruppen (wie das Zwerchfell, die Interkostalmuskulatur und die Kehlkopfmuskulatur), um die Hustenwirkung auszuführen und potenziell schädliche Reizstoffe und Schleim aus den Atemwegen durch die Mundhöhle auszustoßen ^8,9,10. Der Niesreflex wird hauptsächlich durch nasale sensorische Neuronen innerhalb des Trigeminusganglions^{vermittelt 11,12}. Ihre mechanischen oder chemischen Reize werden an den spinalen Trigeminuskern (SP5) weitergeleitet, der die Informationen dann an die Atmungszentren^weiterleitet 13,14,15,16. Diese Zentren regulieren relevante Muskeln (wie Atem-, Gaumen- und Gesichtsmuskeln), um ein Niesen einzuleiten¹⁷. Der starke exspiratorische Stoß des Niesens drückt den größten Teil der Luft durch die Nase aus, um die Reizstoffe auszustoßen ^9,18. Die Forschung zu Husten und Niesen hilft nicht nur bei der Aufklärung der neuronalen Mechanismen der Atemabwehr, sondern bietet auch therapeutische Angriffspunkte für chronischen Husten und Rhinitis. Zu diesem Zweck ist die Etablierung eines robusten und zuverlässigen Tiermodells von größter Bedeutung.

In den letzten Jahren haben sich Mäuse zu einem zentralen Modellorganismus für die Untersuchung der neuronalen Bahnen von Husten und Niesen entwickelt 19,20,21. Die vorherrschende derzeitige Methodik beinhaltet immer noch die Induktion dieses Reflexverhaltens durch Inhalation von aerosolisierten Stimulanzien ^8,20,22. Eine wesentliche Einschränkung dieses Inhalationsansatzes besteht darin, dass die Reize gleichzeitig auf die Nasenhöhle und die Luftröhre wirken und unspezifisch die unterschiedlichen sensorischen afferenten Systeme aktivieren, die Niesen (über den Trigeminusweg) und Husten (über den vagalen Weg) vermitteln. Dies stellt eine erhebliche Herausforderung für die präzise Differenzierung des in Experimenten erhobenen Verhaltenstyps dar. Diese Diskrepanz zeigt sich in der Literatur: Einige Studien definieren Capsaicin-induzierte Atemreflexe bei Mäusen als Niesen²¹, während andere berichten, dass diese Reflexe sowohl die Husten- als auch die Nieskomponente umfassen ^8,22.

Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurden fortschrittliche Methoden entwickelt, einschließlich der Analyse von Atemmustern und -trajektorien, um unterschiedliche Reflexverhaltensweisen zu klassifizieren⁸. Eine andere Studie zeigt, dass Husten und Niesen deutliche Unterschiede in den zeitlichen und spektralen Eigenschaften aufweisen, wie z. B. Dauer, Frequenzmodulation²². Ihre Arbeit zeigte, dass Husten eine Energiekonzentration in niedrigeren Spitzenfrequenzbereichen (20-80 kHz) aufweist, während Niesen Komponenten aufweist, die über 90 kHz hinausgehen²². Diese akustischen Divergenzen bieten einen neuartigen, nicht-invasiven Rahmen für die Verhaltensunterscheidung, der die traditionellen Analysen der Atemwellenformen ergänzt. Trotz dieser Innovationen besteht eine kritische Lücke: Bestehenden Modellen mangelt es an anatomischer Spezifität bei der Reizabgabe, was oft die trachealen und nasalen Reflexwege verwirrt. Diese Einschränkung zeigt, dass wir bessere Möglichkeiten brauchen, um Atemreflexe gezielt zu untersuchen und zu untersuchen.

Die Erforschung der Mechanismen, die Husten und Niesen zugrunde liegen, die durch mechanische und chemische Stimulation der Atemwege induziert werden, wurde ausgiebig an Großtiermodellen (z. B. Katzen) ^{durchgeführt17}. In Kleintiermodellen (z. B. Meerschweinchen, Ratten und Mäusen) haben technische Einschränkungen jedoch typischerweise das Vertrauen in aerosolisierte Verbindungen (wie Capsaicin oder Zitronensäure) erforderlich gemacht, um eine chemische Stimulation zu erreichen.

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode zur Induktion von husten- und niesähnlichen Verhaltensweisen bei Mäusen vor und etabliert eine neue Reihe von Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung dieser Atemreflexe. Dieser Ansatz etabliert eine Strategie zur Unterscheidung von husten- und nieseähnlichem Verhalten bei Mäusen, indem charakteristische Vokalisationen identifiziert und deren spektrale Merkmale und akustische Intensität analysiert werden. Diese neuartige Methodik hat das Potenzial, die Quantifizierung der Atemreflexe von Mäusen zu standardisieren, die experimentelle Reproduzierbarkeit zu verbessern und das mechanistische Verständnis der Neurophysiologie von Husten und Niesen zu vertiefen.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Use and Care Protocol des Labors Guangzhou (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10) durchgeführt. In dieser Studie wurden weibliche und männliche Mäuse im Alter von 8-10 Wochen verwendet, die spezifisch pathogenfrei sind und frei von C57BL/6 sind.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Aufbereitung von Versuchstieren
   1. Halten Sie Mäuse in Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser und halten Sie sie bei 22 ± 1 °C unter einem standardmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden.
2. Zubereitung der Capsaicin-Lösung
   1. 30,5 mg Capsaicin-Pulver in PBS mit 10 % Ethanol und 10 % Tween-80 auflösen, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen.
   2. Stammlösung 1:100 in physiologischer Kochsalzlösung verdünnen, um 100 μM Arbeitslösung herzustellen.
3. Zubereitung von Tribromethanol (Avertin)
   1. Wiegen Sie 0,5 g Tribromethanol in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie 1 ml 2-Methyl-2-butanol hinzu.
   2. Inkubieren Sie bei 55 °C unter Rühren (400-600 U/min) im Dunkeln, bis es sich vollständig aufgelöst hat (~20 min).
   3. 40 ml physiologische Kochsalzlösung in ein Becherglas geben. Unter Rühren die gelöste Tribromethanollösung tropfenweise hinzufügen. Rühren Sie weiter, bis sich die gelösten Kristalle vollständig aufgelöst haben (~40 min).
   4. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,0-7,3 ein.

2. Etablierung und Aufzeichnung eines hustenähnlichen Verhaltensmodells

1. Vorbereitung der Implantationskanüle
   1. Schneiden Sie eine 28 G Nadel (ID: 0.19 mm, OD: 0.35 mm) in eine ~5 mm Kanüle. Beide Enden mit einer Pinzette mit Schleifpapier glatt streichen. Befestigen Sie ein Ende an einem Silikonschlauch (ID: 0,3 mm, AD: 0,8 mm). Schließen Sie sie an eine 1-ml-Spritze an und spülen Sie die Kanüle mit Wasser, um die Durchgängigkeit zu überprüfen.
   2. Kanüle um 90° biegen mit Armverhältnis 2:3. Den längeren Arm in den Silikonschlauch einführen (ID: 0,3 mm, AD: 0,8 mm, 5 cm Länge; Abbildung 1A). Bestimmen Sie das gebogene Ende für die Trachealimplantation. Verlängern Sie den Silikonschlauch zur Fixierung von der Luftröhre bis zum Schädel (Abbildung 1B).
2. Vorbereitung der Einrichtung des Kontrollgeräts
   1. Bereiten Sie ein Ganzkörper-Plethysmographie-System (WBP) vor, einen Ultraschallrekorder, eine Hochgeschwindigkeitskamera, eine Mikroinjektionspumpe.
3. Zuweisung von Mausgruppen
   1. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip drei Gruppen zu (n = 6/Gruppe): i) Kontrollgruppe: Behalten Sie den normalen unbehandelten Status bei. ii) Scheingruppe: Implantieren Sie die Trachealkanüle ohne Stimulation. iii) Stimulationsgruppe: Implantieren Sie die Trachealkanüle und verabreichen Sie Capsaicin, um Husten auszulösen.
4. Chirurgischer Eingriff
   1. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (125-250 mg/kg) und bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie nicht auf ein Zehenklemmen ansprechen.
   2. Befestigen Sie die betäubte Maus in Rückenlage. Schädel- und Gebärmutterhalshaare rasieren. Mit Iodophor desinfizieren. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere einen kreisförmigen Abschnitt der Kopfhaut mit einem Durchmesser von etwa 5 mm ab, um den Schädel freizulegen.
   3. Unter dem Mikroskop: Zervixhaut ca. 1 cm einschneiden. Präparieren Sie Gewebe und Muskeln stumpf, um die Luftröhre freizulegen. Weichgewebe zwischen dem Krikoid- und dem Trachealknorpel mit einer 32-G-Nadel punktieren. Schaffen Sie mit einer Augenschere eine minimale Trachealöffnung.
      HINWEIS: Halten Sie die Öffnungsgröße gerade groß genug für den Kanülendurchmesser, um Gewebeschäden zu vermeiden.
   4. Führen Sie eine Metallkanüle (silikonummantelt) ~1 mm in das Tracheallumen ein. Sichern Sie den Kanülen-Luftröhren-Übergang mit einer 7-0-Naht.
      HINWEIS: Begrenzen Sie die Einführtiefe auf 1 mm, um eine Beeinträchtigung der Atemwege zu vermeiden.
   5. Stumpf subkutan vom Hals bis zum Schädel tunneln. Verlege den Silikonschlauch zum Schädel und fixiere ihn mit Zahnzement.
   6. Naht zervikaler Schnitt. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis sie bei Bewusstsein ist. Haltung in einem Käfig für 5 Tage.
   7. Spülen Sie die Trachealkanüle/den Trachealschlauch täglich mit einer 1 ml-Luftspritze.
      HINWEIS: Unterlassen Sie die Rötung innerhalb von 24 Stunden vor der Husteneinleitung.
5. Husten-Aufnahme
   1. Statten Sie die Ultraschallsonde mit einem anschlusskompatiblen Dichtring aus. Führen Sie die Sonde in den WBP-Kammeranschluss ein, um einen luftdichten Kontakt zu gewährleisten.
   2. Schließen Sie die WBP-Kammer, den Durchflusssensor und den Bias-Durchfluss an. Kalibrieren Sie per Software.
   3. Befestigen Sie einen am Schädel befestigten Silikonschlauch an einem 30 cm langen Verlängerungsschlauch. Platzieren Sie die Maus in der WBP-Kammer. Verlängern Sie den Schlauch durch den oberen Anschluss. Verschließen Sie den Port mit Modelliermasse. Überprüfen Sie die Luftdichtheit der Kammer, indem Sie bestätigen, dass die Spitzen der Atemwellenform innerhalb von 4 ± 2 liegen.
   4. Laden Sie 1 ml Spritze mit 5 ml Capsaicin-Lösung. Beseitigen Sie Luftblasen. An das Verlängerungsrohr anschließen. Montieren Sie die Spritze auf die Mikroinjektionspumpe und stellen Sie den Durchfluss auf 10 μl ^min-1 ein.
      HINWEIS: Übermäßiger Fluss kann Capsaicin in die Nasenhöhle transportieren.
   5. Positionieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera in Richtung der Kammer. Passen Sie die Entfernung und den Fokus an. Stellen Sie die Abtastrate auf maximal 160 fps ein.
   6. Starten Sie gleichzeitig die WBP-, Ultraschall- und Kamerasoftware. Lösen Sie die Pumpe aus, um das Capsaicin zu infundieren. Erfassen Sie die Hustenzahlen für 10 Minuten.

3. Etablierung und Aufzeichnung eines niesähnlichen Verhaltensmodells

1. Vorbereitung der Versuchsausrüstung
   1. Bereiten Sie ein steriles PE-Rohr (ID: 0,5 mm, OD: 1 mm) für die Fixierung als Stimulationskanüle auf dem Nasenknochen der Maus vor.
   2. Bereiten Sie ein sterilisiertes Nylonfilament mit einem Durchmesser von 0,25 mm für die Nasenstimulation mit Transkanülen vor. Greifen Sie auf die Vonfrey-Kalibrierungsmethode zurück, wenn das 5 cm lange Filament vertikal auf eine Waage gedrückt wird, bis es sich auf etwa 45° biegt, beträgt die gemessene Kraft 0,6 g.
2. Einrichtung des Kontrollgeräts
   1. Bereit: ein Ganzkörper-Plethysmographie-System (WBP), ein Ultraschallrekorder und eine Hochgeschwindigkeitskamera.
3. Zuweisung von Mausgruppen
   1. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip drei Gruppen zu (n = 6/Gruppe): i) Kontrollgruppe: Behalten Sie den unbehandelten Ausgangsstatus bei. ii) Scheingruppe: Fixieren Sie die Nasenkanüle ohne Stimulation. iii) Stimulationsgruppe: Nasenkanüle fixieren + Niesen durch Filamentstimulation hervorrufen.
4. Chirurgischer Eingriff
   1. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (125-250 mg/kg) und bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie nicht auf ein Zehenklemmen ansprechen.
   2. Rasieren Sie die Haare am Schädel und Nasenrücken.
   3. Befestigen Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen. Mit Iodophor desinfizieren. Schneiden Sie die Haut über dem Schädel und dem Nasenbein ein. Lege das Nasenbein frei.
   4. Schaffen Sie mit einem Mikrobohrer ein 0,5 mm großes Loch in den Übergang zwischen dem Nasenbein und dem lateralen Fortsatz des Nasenseptumknorpels. Legen Sie die Nasenschleimhaut frei.
      HINWEIS: Begrenzen Sie die Lochgröße auf 0,5 mm, um Gewebeschäden zu vermeiden.
   5. Heben Sie die Nasenschleimhaut vorsichtig mit einer 32 G Nadel an. Legen Sie die Nasenhöhle frei.
   6. Montieren Sie das PE-Rohr in den stereotaktischen Arm. Positionieren Sie die Rohrspitze bündig mit dem Fräsloch. Befestigen Sie den Schlauch mit Zahnzement am Nasenknochen.
   7. Lege die Maus auf ein Heizkissen, bis das Bewusstsein zurückkehrt.
5. Nies-Aufnahme
   1. Schließen Sie die WBP-Kammer, den Durchflusssensor und den Bias-Durchfluss gemäß dem Handbuch an. Kalibrieren Sie mit Software.
   2. Montieren Sie die Ultraschallsonde mit einer an den Anschluss angepassten Dichtung. Führen Sie die Sonde in die Kammer ein. Überprüfen Sie einen luftdichten Verschluss.
   3. Übertragen Sie die Maus in die WBP-Kammer. Ziehen Sie das PE-Rohr durch die obere Öffnung. Verschließen Sie die Öffnung mit Modelliermasse um das Rohr herum. Überprüfen Sie die Luftdichtheit der Kammer, indem Sie bestätigen, dass die Spitzen der Atemwellenform innerhalb von 4 ± 2 liegen.
   4. Positionieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera in Richtung der Kammer. Passen Sie die Entfernung und den Fokus an. Stellen Sie die Abtastrate auf maximal 160 fps ein.
   5. Schieben Sie ein Nylonfilament mit einem Durchmesser von 0,25 mm durch einen weichen Schlauch in die Nasenhöhle bis zu einer Tiefe von 0-3 mm. Der Teil des Filaments, der aus dem Handrohr herausragt, ist 5 cm lang. Drücken Sie während der Stimulation auf dieses freie Ende, bis es sich auf 45° biegt, und geben Sie ~0,6 g Kraft für 1 s an die Nasenschleimhaut ab, wiederholen Sie dies einmal alle 30 s. Notieren Sie die Niesreaktionen 10 Minuten lang.

4. Capsaicin-induzierter Husten und Niesen bei Mäusen

1. Gruppen-Zuweisung
   1. Unterteilen Sie die Mäuse in Scheinchirurgie und Operationsgruppen (n = 5/Gruppe). Scheingruppe: Bilaterale anteriore Siebboidal- und Infraorbitalnerven freilegen. Chirurgische Gruppe: Transektieren Sie bilaterale Nervus themoidales und Nervus infraorbitalis.
2. Ultraschall-Vernebelung
   1. Bereiten Sie die Verhaltenskammer vor (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Positionieren Sie den Ultraschallrekorder und die Kamera für eine optimale Überwachung.
   3. Beladen Sie den Vernebler mit 100 μM Capsaicin-Lösung. Geben Sie 10 Minuten lang alle 2 min 30 s Aerosolimpulse ab.
   4. Zeichnen Sie Verhaltensweisen kontinuierlich mit dem Ultraschallrecorder und der Kamera auf.

5. Prozess der Datenanalyse

1. Ganzkörperplethysmographie (WBP) Analyse der Atemwegsverfolgung
   1. Importieren Sie die von WBP aufgenommenen Textdateien in die Spike2-Software und synchronisieren Sie sie mit Audiosignalen.
   2. Analysieren Sie die Audiosignale, die den Atemmustern mit Einzel- und Doppelspitze entsprechen, und zeichnen Sie die Dauer der Kompressionsphase für jedes Muster auf.
   3. Wählen Sie den tiefsten Punkt der exspiratorischen Phase als Mittelpunkt und nehmen Sie die Daten von einer halben Sekunde vorher und nachher für die Berechnung des Durchschnittswertes.
2. Audio-Wellenform-Analyse
   1. Importieren Sie Audiodateien in die Spike2-Software, wählen Sie einzelne Husten- oder Niesgeräusche aus und exportieren Sie sie im TXT-Format (mit einer Abtastrate von 100 kHz und einer Dauer von 0,1 s).
   2. Importieren Sie die TXT-Dateien in Excel und konvertieren Sie sie in die absoluten Werte der Audiosignale.
   3. Verwenden Sie die GraphPad Prism Software, um die absoluten Werte der Audiowellenformen mit einem Glättungsspline mit 50 Punkten zu glätten.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Kurve den Originaldaten sehr nahe kommt und gleichzeitig übermäßige Wendepunkte vermieden werden, ist die Auswahl eines Glättungs-Splines von 50 Punkten optimal. Kurven, die mit Werten über 50 Punkten erstellt wurden, weisen eine vernachlässigbare Abweichung von der Kurve mit 50 Parametern auf.
   4. Berechnen Sie basierend auf den geglätteten Audiowellenformen die Steigung k vom Startpunkt bis zum höchsten Punkt.
3. Audio-Spektralanalyse
   1. Importieren Sie Audiodateien in die Spike2-Software.
   2. Wählen Sie den Start- und Endpunkt einzelner Husten- oder Niesgeräusche für die Spektralanalyse aus und exportieren Sie die Ergebnisse der Spektralanalyse.
   3. Verwenden Sie GraphPad Prism, um Spektralanalysekurven zu generieren und die Fläche unter den Kurven zu berechnen.
   4. Berechnen Sie das Verhältnis der Fläche unter der Kurve zwischen den Frequenzbändern 30-60 kHz und 0-30 kHz, um zwischen Husten und Niesen zu unterscheiden.
4. Berechnung des zusammengesetzten Index
   1. Führen Sie eine natürliche Logarithmustransformation (ln) für die Steigung k und das Verhältnis der Fläche unter der Spektralanalysekurve durch, um die Unterscheidbarkeit der Daten zu verbessern.

6. Statistische Analyse

1. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit dem t-Test und der Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, wobei ein P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Alle Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism durchgeführt.

Ergebnisse

In dieser Studie führten wir eine detaillierte Analyse der Atemmuster des Husten- und Niesverhaltens von Mäusen mit Hilfe von Ganzkörperplethysmographie (WBP) und Ultraschallaufzeichnungstechniken durch. Die Ergebnisse zeigten, dass Mäuse, die einer Tracheal- oder Nasenoperation unterzogen wurden, eine vergleichbare Husten- und Niesempfindlichkeit zeigten wie naive Kontrollen. Die (chemische) und mechanische Stimulation von Capsaicin löst bei diesen chirurgisch präparierten Tieren jedoch effektiv Husten- und Niesreflexe aus (Abbildung 2A,B). Die WBP-Ergebnisse zeigten, dass beide Verhaltensweisen Einzel- und Doppelspitzenmuster aufwiesen, wobei ihre Schallsignale während der Austreibungsphase des Atmungsmusters auftraten (Abbildung 3A,C,E,G). Weitere Ultraschalluntersuchungen zeigten unterschiedliche akustische Profile: Die Hustengeräusche zeigten einen abrupten Beginn, wobei die Spitzenintensität sofort auftrat, überwiegend im Frequenzbereich von 0-30 kHz, und eine kürzere Dauer (Abbildung 3B,D; Unterstützendes Video S1). Niesgeräusche zeigten einen progressiven Intensitätsaufbau bis zur maximalen Amplitude, eine breitbandige Frequenzverteilung (0-80 kHz) und eine verlängerte Dauer (Abbildung 3F,H; Unterstützendes Video S2). Die statistische Analyse ergab, dass die durchschnittliche Kompressionsphase des Hustenverhaltens mit einem Spitzenwert von 32,39 ± 0,73 ms signifikant kürzer war als die des Hustenverhaltens mit Doppelspitzen von 53,17 ± 2,29 ms (Abbildung 4A,B,C). Die durchschnittliche Kompressionsphase des One-Peak-Niesverhaltens lag bei 44,03 ± 1,84 ms und damit unter dem Durchschnittswert des Double-Peak-Hustenverhaltens, während die durchschnittliche Kompressionsphase des Double-Peak-Niesverhaltens bei 74,24 ± 1,29 ms lag und damit signifikant länger war als die des Single-Peak-Niesverhaltens (Abbildung 4E,F,G). Darüber hinaus betrug das Vorkommensverhältnis eines Single-Peak-Musters im Hustenverhalten 77,55 ± 2,10 % (Abbildung 4D), während im Niesverhalten das Single-Peak-Muster nur 32,42 ± 5,88 % ausmachte, wobei das Double-Peak-Muster 67,58 % ± 5,88 % ausmachte (Abbildung 4H). Die statistische Analyse der Audiodauer zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Audiozeiten beim Husten und Niesen, aber es gab erhebliche Überschneidungen zwischen den beiden (Abbildung 5A). Durch die spektrale Analyse des Ultraschalltons von Husten und Niesen fanden wir heraus, dass das Frequenzspektrum des Hustengeräuschs hauptsächlich im Bereich von 0-30 kHz konzentriert war, während das Niesgeräusch einen höheren Anteil im Bereich von 0-60 kHz hatte (Abbildung 5B). Obwohl Hustenaudio auch Frequenzen im Bereich von 30-120 kHz aufwies, war der Anteil der tiefen Frequenzen immer höher als der der hohen Frequenzen. Daher haben wir die Steigung der Schallintensität vom Startpunkt bis zum Maximalwert (Abbildung 5C) als vertikale Koordinate und das Energieverhältnis von 30-60 kHz zu 0-30 kHz (Abbildung 5D) als horizontale Koordinate verwendet, um ein Koordinatensystem zu erstellen, das Husten- und Niesgeräusch effektiv unterscheiden kann. Darüber hinaus gab es in diesem Koordinatensystem keine signifikanten Unterschiede zwischen Single- und Double-Peak-Husten sowie Single- und Double-Peak-Niesen (Abbildung 5E).

Als nächstes verwendeten wir die oben genannten Klassifikationsmethoden, um das Husten- und Niesverhalten zu kategorisieren, das durch die Capsaicin-Vernebelung bei Mäusen induziert wurde. Wir fanden heraus, dass sich das Husten- und Niesverhalten, das durch die Capsaicin-Vernebelung induziert wird, mit dem überschneidet, das durch spezifische Stimulation an denselben Koordinatenpositionen hervorgerufen wird (Abbildung 5F,G). Nach Durchtrennung der nasalen sensorischen afferenten Nerven (Nervus ethmoidalis anterior und Nervus infraorbitalis) reduzierte die Capsaicin-Vernebelung signifikant die niesassoziierten akustischen Signale, während die hustenbezogenen Audioprofile nicht beeinflusst blieben (Abbildung 5H,I).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Operation im Modell der stimulierten Luftröhre und Nasenhöhle. (A) Schematische Darstellung des in die Luftröhre implantierten Katheters. (B) Die frontale (links) und koronale (rechts) Ebene zeigen die Position des Katheters, der in die Luftröhre der Maus implantiert wurde. (C) Die sagittale Ebene zeigt die Position der Katheterimplantation in der Nasenhöhle und die Position der Filamentfaserstimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Quantifizierung von husten- und niesähnlichen Verhaltensweisen, die durch ortsspezifische Stimulation hervorgerufen werden. (A) Niesquantifizierung der normalen Kontrollgruppe, der Scheingruppe und der Gruppe mit mechanischer Nasenstimulation. Die Scheingruppe wies eine vergleichbare Niesfrequenz auf wie Kontrollen. Die mechanische Nasenstimulation führte zu einer signifikanten Zunahme von Niesereignissen. (B) Quantifizierung des Hustens der normalen Kontrollgruppe, der Scheingruppe und der Capsaicin-Tracheal-Provokationsgruppe. Die Scheingruppe zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Hustenhäufigkeit im Vergleich zu den Kontrollen. Die Trachealstimulation von Capsaicin erhöhte die Hustenzahlen signifikant. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die respiratorischen Spuren und das Tonoszillogramm von Husten und Niesen. (A) Repräsentative Bilder, die die einzelne Peak-Atmungsspur und Audioaufzeichnung während eines durch Capsaicin induzierten Hustens zeigen. (B) Das Tonoszillogramm (oben) und das Spektrogramm (unten) der Husten-Audioaufnahme in A. (C) Repräsentative Bilder, die die Doppelpeaks, die Atmungsspur und die Audioaufzeichnung während eines durch Capsaicin induzierten Hustens zeigen. (D) Das Tonoszillogramm (oben) und das Spektrogramm (unten) der Husten-Audioaufnahme in C. (E) Repräsentative Bilder, die die einzelne Peak-Atmungsspur und die Audioaufzeichnung während eines durch mechanische Stimulation induzierten Niesens zeigen. (F) Das Tonoszillogramm (oben) und das Spektrogramm (unten) der Niesaudioaufnahme in E. (G) Repräsentative Bilder, die die Doppelpeaks, die Atmungsspur und die Audioaufzeichnung während eines durch mechanische Stimulation induzierten Niesens zeigen. (H) Das Tonoszillogramm (oben) und das Spektrogramm (unten) der Nies-Audioaufnahme in G. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die einzelnen und doppelten Peaks der respiratorischen Spuren von husten- und niesähnlichen Verhaltensweisen. (A) Durchschnittliche (rot) und einzelne (grau) und durchschnittliche (rot) respiratorische Spuren von hustenähnlichem Verhalten mit einem einzigen respiratorischen Peak (n = 52). (B) Durchschnittliche (rot) und individuelle (grau) und durchschnittliche (rot) respiratorische Spuren hustenähnlichen Verhaltens mit doppelten Atemspitzen (n = 29). (C) Dauer der Kompressionsphasen einzelner und doppelter respiratorischer Peaks bei Husten, der durch Capsaicin induziert wird (Single Peaks n = 52, Double Peaks n = 29). (D) Das durchschnittliche Verhältnis von einfachen und doppelten respiratorischen Peakspuren bei Husten (n = 6 Mäuse). (E) Durchschnittliche (rot) und individuelle (grau) und durchschnittliche (rot) respiratorische Spuren von niesähnlichen Verhaltensweisen mit einzelnen Atemspitzen (n = 40). (F) Durchschnittliche (rot) und individuelle (grau) und durchschnittliche (rot) respiratorische Spuren von niesähnlichen Verhaltensweisen mit doppelten Atemspitzen (n = 74). (G) Dauer der Kompressionsphasen für Niesvorgänge, die durch mechanische Stimulation induziert werden (Einzelspitze n = 40, Doppelspitze n = 74). (H) Das durchschnittliche Verhältnis von einfachen und doppelten respiratorischen Spitzenspuren beim Niesen (n = 6 Mäuse). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, ****P < 0,0001 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die Klassifizierung der Frequenz und Wellenform des Oszillogramms von Husten- und Niesgeräuschen. (A) Quantifizierung der Sonogrammdauer von Husten und Niesen. (B) Die durchschnittliche Spektrogrammanalyse von mechanisch stimulationsinduziertem Niesen (n = 69, schwarz) und Capsaicin-induziertem Husten (n = 140, rot). (C) Ein repräsentatives schematisches Diagramm zur Berechnung der Steigung eines Schalloszillogramms. Eine vergleichende Analyse des Glättungs-Splines zeigt, dass bei 25 Punkten eine übermäßige Glättung die ursprünglichen Daten-Features verdeckt, während Werte über 50 Punkte (z. B. 75 Punkte) eine erhebliche Überlappung mit der 50-Spline-Kurve aufweisen, aber zusätzliche Wendepunkte einführen. (D) Ein repräsentatives schematisches Diagramm der Berechnung des Flächenverhältnisses, bei dem die Ergebnisse der Spektralanalyse verwendet werden, um die Fläche unter verschiedenen Frequenzkurven in GraphPad Prism zu berechnen. Das Flächenverhältnis entspricht der Fläche unter der 30-60 kHz-Kurve und der Fläche unter der 0-30 kHz-Kurve. (E) Die Frequenz- und Wellenformklassifizierung von mechanisch stimulationsinduziertem Niesen und Capsaicin-induziertem Husten-Sound-Oszillogramm, wobei die y-Achse den Exponenten der Steigung der Schallwellenform von der Grundlinie bis zur Spitze darstellt und die x-Achse den Exponenten des Verhältnisses von Schallwellen zwischen 30-60 kHz und 0-30 kHz darstellt. (F) Die durchschnittliche Spektrogrammanalyse von Capsaicin-Vernebelungs-induziertem Niesen (n = 36, schwarz) und Capsaicin-Vernebelungs-induziertem Husten (n = 42, rot). (G) Die Häufigkeit und Wellenformklassifizierung von durch Capsaicin-Vernebelung induziertem Niesen (n = 36, schwarz) und Capsaicin-vernebelungsinduziertem Husten (n = 42, rot), wobei die y-Achse den Exponenten der Steigung der Schallwellenform von der Grundlinie bis zur Spitze darstellt und die x-Achse den Exponenten des Verhältnisses von Schallwellen zwischen 30-60 kHz und 0-30 kHz darstellt. (H) Statistische Daten zum Capsaicin-induzierten Niesreflex in Gruppen mit durchtrennten Nervus anterior ethmoidalis und infraorbitalis im Vergleich zur Scheinchirurgie-Gruppe. (I) Statistische Daten zum Capsaicin-induzierten Hustenreflex in Gruppen mit durchtrennten anterioren ethmoidalen und infraorbitalen Nerven im Vergleich zur Scheinchirurgie-Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Video des hustenähnlichen Verhaltens, synchronisiert mit dem Audiospektrogramm, das bei normaler und 0,1-facher Geschwindigkeit angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Video des niesähnlichen Verhaltens, synchronisiert mit dem Audiospektrogramm, das bei normaler und 0,1-facher Geschwindigkeit angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie konnten wir das Husten- und Niesverhalten bei Mäusen erfolgreich induzieren, indem wir die Luftröhre spezifisch mit Capsaicin stimulierten und die Nasenhöhle mechanisch stimulierten ^8,17. Wir sammelten synchron Daten aus Ganzkörperplethysmographie (WBP), Audio- und Videoaufnahmen und fanden heraus, dass Audiofrequenzverhältnisse und Schallintensitätssteigungen bei Mäusen effektiv zwischen Husten- und Niesverhalten unterscheiden konnten ^8,23.

Angesichts der heiklen Natur der chirurgischen Eingriffe muss einigen kritischen Schritten besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Zunächst muss die implantierte intratracheale Kanüle bei der Trachealoperation so dünn wie möglich sein und in geringer Tiefe eingeführt werden, um eine Obstruktion der Atemwege zu vermeiden, die zu Atemnot oder sogar zum Tod führen könnte. Da Sekrete in der Luftröhre den Katheter leicht verstopfen können, ist eine tägliche Katheterreinigung von entscheidender Bedeutung. Bei der Verabreichung von Capsaicin muss die Injektionsgeschwindigkeit sorgfältig kontrolliert werden, um einen retrograden Fluss in die Nasenhöhle zu verhindern, der Niesreflexe auslösen könnte. Zweitens ist bei der Nasenknochenimplantation die Größe des gebohrten Lochs entscheidend, um eine übermäßige Schädigung der Maus zu vermeiden. Der Katheter sollte auf Höhe des Nasenknochens platziert werden, ohne zu tief eingeführt zu werden, um eine übermäßige Reizung der Nasenhöhle oder eine Beeinträchtigung der normalen Atmung zu vermeiden. Letztlich ist die Umsetzung präziser chirurgischer Eingriffe essentiell für das Experiment. Durch die Minimierung von Verletzungen der Maus kann nicht nur die Genesung beschleunigt werden, sondern auch genauere experimentelle Verhaltensreaktionen aufgezeichnet werden. Solche chirurgischen Methoden tragen dazu bei, die Zuverlässigkeit des Modells zu erhöhen und qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten, wodurch eine solide experimentelle Grundlage für die Untersuchung von Atemreflexverhaltensweisen wie Husten und Niesen geschaffen wird.

Traditionell stützt sich die Modellierung des Hustenverhaltens auf die Vernebelung von Verbindungen wie Capsaicin und Zitronensäure, um Husten auszulösen^24,25. Dieser Ansatz hat jedoch bemerkenswerte Einschränkungen: Er löst nicht nur Husten aus, sondern kann gleichzeitig Niesreflexe auslösen ^8,22. Darüber hinaus wurde eine signifikante interindividuelle Variabilität in der Empfindlichkeit gegenüber aerosolisierten Reizen beobachtet²⁶, und eine Untergruppe der Mäuse zeigte überhaupt keine Hustenreaktion. Im Gegensatz dazu erreicht das in dieser Studie entwickelte neuartige mechanische Stimulationsparadigma stabile hustenähnliche Verhaltensweisen und ermöglicht gleichzeitig eine flexible Anpassung der Reize durch austauschbare Aktuatoren. In ähnlicher Weise leiden herkömmliche Niesmodelle, die aerosolisierte Wirkstoffe verwenden, unter einer schlechten Verhaltensspezifität, da sie häufig kollateralen Husten hervorrufen²², wodurch die Differenzierung zwischen diesen unterschiedlichen Atemreflexen erschwert wird.

Frühere Studien haben Husten- und Niesmodelle für Mäuse mit Capsaicin etabliert und die beiden auf der Grundlage der Merkmale von Atmungsmustern (Einzel- oder Doppelpeaks) unterschieden, die durch Ganzkörperplethysmographie (WBP) aufgezeichnet ^wurden8. Unsere Forschungsdaten zeigen, dass beim induzierten Hustenverhalten das Single-Peak-Atemmuster 77,55 ± 2,10 % der Fälle ausmachte, während beim Niesverhalten das Single-Peak-Muster 32,42 ± 5,88 % ausmachte. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Klassifikationsmethode auf der Grundlage von WBP-Atmungsmustern in den meisten Fällen effektiv ist, aber Einschränkungen aufweist und keine perfekte Unterscheidung zwischen den beiden Verhaltensweisen zulässt. Darüber hinaus haben einige Studien versucht, Husten von Niesen anhand der Dauer und Frequenz von Audiosignalen zu unterscheiden²². Obwohl die durchschnittliche Dauer von Audiosignalen für das Niesverhalten typischerweise länger ist als für das Husten, gibt es eine erhebliche Überlappung zwischen den Dauern einzelner Ereignisse. Daher kann es sein, dass die Abhängigkeit von der Audiodauer als Unterscheidungsmerkmal nicht ausreichend ausgeprägt ist. Darüber hinaus hat die spektrale Analyse von Husten und Niesen keine klare Abgrenzung ergeben: Leichter Husten kann sich nur als niederfrequente Signale manifestieren, während heftiger Husten Geräusche erzeugen kann, die signifikante hochfrequente Komponenten enthalten, mit spektralen Eigenschaften, die denen des Niesens ähneln. Bemerkenswert ist, dass Hustenereignisse durchweg einen höheren Anteil an niederfrequenter Energie aufweisen. Im Gegensatz dazu kann das Verhältnis von hochfrequenter zu niederfrequenter Energie (High-to-Low Frequency Energy Ratio) ein differenzierteres akustisches Merkmal zur Unterscheidung zwischen Husten- und Niesverhalten darstellen.

Unsere Innovation adressiert diese Einschränkungen durch räumlich begrenzte mechanische Stimulation. Das verfeinerte Verhaltensmodell zeigt doppelte Vorteile: (1) Präzision im Millimeterbereich bei stabilisierten Sonden und (2) verbesserte Verhaltensspezifität. Darüber hinaus zeigt unsere umfangreiche Analyse der Husten- und Niesakustik, dass diese Verhaltensweisen unterschiedliche Schallintensitätsprofile aufweisen, mit statistisch signifikanten Unterschieden in ihren hoch- und niederfrequenten Energieverhältnissen. Darüber hinaus zeigt unsere umfassende akustische Analyse von Husten- und Niesereignissen unterschiedliche Schallintensitätsprofile zwischen diesen Verhaltensweisen, begleitet von statistisch signifikanten Unterschieden in ihren hoch- und niederfrequenten Energieverhältnissen. Darüber hinaus ist diese Klassifikationsmethode auch bei der akustischen Aufzeichnung von Husten- und Niesverhalten, das durch Capsaicin-Vernebelung induziert wird, praktikabel. Zusammengenommen ermöglichten diese akustischen Parameter die Entwicklung eines mehrdimensionalen Merkmalsraums, der einen objektiven, quantifizierbaren Standard für die Unterscheidung von Husten und Niesen etabliert. Das Ergebnis etabliert einen guten Standard für die Untersuchung von Abwehrmechanismen der Atemwege mit reduzierten Störfaktoren und verbesserter Reproduzierbarkeit. Dies löst nicht nur langjährige Herausforderungen in der Atemreflexforschung, sondern eröffnet auch Wege für präzise Neuromodulationsstudien von neuronalen Schaltkreisen beim Husten und Niesen.

Obwohl diese Methode bei Mäusen effektiv Husten- und Niesverhalten hervorruft, hat sie immer noch einige Einschränkungen. Im Vergleich zur Vernebelungsinduktion kann eine Operation bei Mäusen zu einem gewissen Grad an Verletzungen führen, auch wenn wir uns bemühen, den Schaden während des Eingriffs zu minimieren. Nichtsdestotrotz kann die Operation immer noch stabil Husten- und Niesverhalten hervorrufen, was darauf hindeutet, dass die Operation selbst die Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber diesen Reizen nicht verringert. Technische Herausforderungen ergaben sich auch bei der Verhaltensphänotypisierung. Die akustische Signaltreue erforderte eine präzise Kalibrierung der Mikrofonplatzierung des Probanden, um das Signal-Rausch-Verhältnis auszugleichen und gleichzeitig eine Amplitudensättigung zu vermeiden. Darüber hinaus erforderte die Integration von Stimuluskathetern mit Ganzkörperplethysmographie-Kammern (WBP) spezielle Designs: Der Katheter musste von der Oberseite der Kammer ausgehen, ohne die natürlichen Bewegungen der Maus oder die Abgabe des Stimulus zu behindern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es trotz der Einschränkungen der chirurgischen Methode ein wirksames Mittel zur stabilen Induktion von Husten- und Niesverhalten bei Mäusen bietet, und mit einem sorgfältig konzipierten experimentellen Verfahren können Verletzungen der Maus minimiert werden, um eine genaue Verhaltensdatenerfassung zu gewährleisten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir durch diese heiklen chirurgischen Manipulationen und das rigorose Versuchsdesign ein Modell etabliert haben, das das Husten- und Niesverhalten bei Mäusen stabil induziert und eine zuverlässige experimentelle Grundlage für die weitere Untersuchung dieser beiden Atemreflexverhaltensweisen bietet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

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Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
WBP-Admiad-Software	TOW-INT-TECH		Verwendung für WBP-Aufnahmen
WBP-Körperplethysmographiesystem	TOW-INT-TECH	2403-3204