Methodenartikel

Erstellung und Evaluierung des Modells der vorzeitigen Ovarialinsuffizienz der Maus

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DOI:

10.3791/69000

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19. September 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Konstruktion eines Mausmodells für vorzeitige Ovarialinsuffizienz mittels Cyclophosphamid-Injektion. Das Modell repliziert effektiv, leicht und anpassungsfähig das pathologische Fortschreiten der vorzeitigen Ovarialinsuffizienz beim Menschen und zeigt damit eine hohe Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz.

Zusammenfassung

Die vorzeitige Ovarialinsuffizienz (POI) ist eine kritische Erkrankung, die zur weiblichen Unfruchtbarkeit führt und zuverlässige Tiermodelle für die mechanistische und therapeutische Forschung erfordert. In dieser Arbeit stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Etablierung und Evaluierung eines Cyclophosphamid (CTX)-induzierten POI-Mausmodells vor. Sechs bis acht Wochen alte weibliche Mäuse mit regelmäßigen Brunstzyklen wurden ausgewählt und intraperitonealen CTX-Injektionen unterzogen: eine Anfangsdosis von 100 mg/kg an Tag 1, gefolgt von täglichen Dosen von 20 mg/kg für die folgenden 14 Tage. Dynamische Veränderungen der Östruszyklen wurden mittels vaginaler Abstrichzytologie mit Wright-Färbung überwacht. Die Serumspiegel von Östradiol (E2), follikelstimulierendem Hormon (FSH) und Anti-Müller-Hormon (AMH) wurden mittels ELISA quantifiziert, um endokrine Veränderungen zu beurteilen. Die Histopathologie der Eierstöcke wurde durch Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung von Paraffin-eingebetteten Schnitten zur Quantifizierung der Follikelatresie untersucht, während die immunhistochemische Analyse der gespaltenen Caspase-3 zum Nachweis der Apoptose der Granulosazellen durchgeführt wurde. Die Ergebnisse zeigten eine gestörte Brunstzyklizität, signifikant reduzierte E2- und AMH-Spiegel, erhöhte FSH-Konzentrationen, erhöhte Follikelatresie und eine erhöhte Apoptose der Granulosazellen bei CTX-behandelten Mäusen, was die erfolgreiche POI-Modellierung bestätigt. Diese Modellbildungsmethode kann den Mechanismus der Chemotherapie-induzierten Ovarialschädigung stark nachahmen und weist typische pathologische Merkmale wie Follikelreservenmangel und Sexualhormonstörungen auf. Es bietet eine zuverlässige experimentelle Plattform für die Aufdeckung des Reproduktionstoxizitätsmechanismus von Chemotherapien, das Screening von Arzneimitteln, die Eierstöcke schützen, und die Optimierung von Strategien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Darüber hinaus ist dieses Modell relativ einfach zu bedienen, kostengünstig und hat einen kurzen Produktionszyklus, wodurch es leicht durchzuführen und zu popularisieren ist. Die Methodik orientiert sich an den Anforderungen von JoVE an visualisierbare, schrittweise experimentelle Demonstrationen.

Einleitung

Die vorzeitige Ovarialinsuffizienz (POI), die häufigste Form der weiblichen Fortpflanzungsstörung, beeinträchtigt nicht nur die körperliche und geistige Gesundheit der Patientinnen durch Östrogenmangelsymptome und Fortpflanzungsstörungen, sondern erhöht auch das Risiko für die Entwicklung von Komorbiditäten wie Frakturen, Autoimmunerkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes mellitus usw.1. Die Entwicklung effizienter und sicherer Therapiestrategien ist daher zu einer dringlichen Priorität in der modernen Medizin geworden. Angesichts der begrenzten Verfügbarkeit klinischer Proben, der multifaktoriellen Ätiologie und der hohen ethischen Risiken, die mit der POI-Forschung verbunden sind, ist die Etablierung zuverlässiger Tiermodelle, die eine systematische mechanistische Untersuchung und Sicherheitsvalidierung ermöglichen, unerlässlich geworden.

Derzeit werden Chemotherapie-induzierte Modelle für Eierstockschäden in großem Umfang für POI-Studien verwendet. Cyclophosphamid (CTX), ein Alkylierungsmittel mit immunsuppressiven Eigenschaften, wurde als potente gonadotoxische Verbindung identifiziert. Sein Mechanismus beinhaltet DNA-Vernetzungsschäden, um die zelluläre Proliferation zu unterdrücken2, was zur Apoptose der ovariellen Reservezellen führt 3,4. CTX-basierte Modelle rekapitulieren effektiv klinische Kennzeichen von POI, einschließlich primordialer Follikeldepletion, Hypoöstrogenämie und erhöhter follikelstimulierender Hormonspiegel (FSH). Die intraperitoneale CTX-Injektion bei Mäusen bietet deutliche Vorteile: hohe Bioverfügbarkeit durch schnelle peritoneale Resorption, standardisierte Operabilität mit minimaler technischer Variabilität und Kosteneffizienz für groß angelegte Studien. Bemerkenswert ist, dass die Struktur der Eierstöcke von Mäusen der des Menschen sehr ähnlich ist, was die dynamische Beobachtung des Follikelmangels und der hormonellen Veränderungen erleichtert. Darüber hinaus sind Mäuse kostengünstig und haben eine schnelle Reproduktionsrate, was die Anforderungen für groß angelegte Stichprobenstudien erfüllt.

Trotz dieser Vorteile hat die Heterogenität der CTX-Dosierungsschemata (z. B. Einzelbolus versus fraktionierte Injektionen) und der zeitlichen Verabreichungsfenster zu inkonsistenten Modellierungsergebnissen in allen Studien geführt. Um diese Lücke zu schließen, stellen wir ein systematisches Protokoll vor, das die CTX-Dosierung und die Verabreichungshäufigkeit für die POI-Induktion bei Mäusen optimiert. Diese Studie zielt darauf ab, ein reproduzierbares Modell durch quantitative Bewertung der Erschöpfung der ovariellen Reserve, der hormonellen Dysregulation und der histopathologischen Korrelate zu etablieren und damit eine robuste Plattform für die mechanistische Exploration und das therapeutische Screening zu bieten.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission von Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. geprüft und genehmigt (Ethiknummer: SDLL202502281). Diese Studie hält sich an die Richtlinien der National Institutes of Health zur Pflege und Verwendung von Labornagetieren in allen Tierversuchsverfahren. Die weiblichen C57BL/6-Mäuse, die in diesem Experiment verwendet wurden, waren 6-8 Wochen alt und wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten. Als Inzuchtstamm und Unterstamm der C57-Linie zeichnen sich C57BL/6-Mäuse durch ihr schwarzes Fell aus. Vor den Experimenten wurden die Mäuse eine Woche lang im Tierlabor unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen akklimatisiert, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, um den natürlichen zirkadianen Rhythmus nachzuahmen. Während der gesamten Akklimatisierungsphase erhielten die Mäuse ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser.

1. Vorbereitung der Tiere

HINWEIS: Wählen Sie 24 weibliche C57BL/6-Mäuse mit Lichtschutzfaktor im Alter von 6-8 Wochen mit normalen Brunstzyklen. Sammeln Sie an 10 aufeinanderfolgenden Tagen um 9:00 Uhr Vaginalspülflüssigkeit von den Mäusen, um Abstriche von abgeblätterten Vaginalzellen vorzubereiten. Beobachten Sie die Brunstzyklen und wählen Sie die Mäuse aus, die mindestens einen kontinuierlichen und vollständigen Zyklus haben.

  1. Lassen Sie die Mäuse sich vor den Experimenten 1 Woche lang an die Umgebung gewöhnen. Markieren Sie Mäuse nach der Anpassungsphase mit einem Ohrlocher. Erfassen Sie die Körpergewichtsmessungen sofort nach der Markierung.
  2. Halten Sie Mäuse fest, bis es zu natürlichem, stressbedingtem Wasserlassen kommt. Ruhigstellung durch Einklemmen der dorsalen Halshaut zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Positionieren Sie den Mauskopf nach unten, um die Bauchregion vollständig freizulegen.
  3. Legen Sie eine sterile Pipettenspitze auf eine Mikropipette. 10 μl sterile physiologische Kochsalzlösung aspirieren. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Spülzyklen durch den Vaginalkanal durch. Halten Sie die Spülflüssigkeit in der Pipettenspitze zurück.
  4. Verteilen Sie die Spülflüssigkeit gleichmäßig auf dem Objektträger des Glasmikroskops. Lufttrocknende Objektträger vollständig bei Raumtemperatur. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie zur Konservierung in 95%iges Ethanol tauchen. Beschriften Sie Objektträger umfassend mit experimentellen Parametern und bewahren Sie sie geschützt in lichtdichten Objektträgerboxen bei 4 °C auf, wenn sie nicht verarbeitet werden.
  5. Wrights Färbeprotokoll
    1. Tauchen Sie die Objektträger in 95%iges Ethanol (für 3-10 min). Spülen Sie es gründlich unter dem Strahl des destillierten Wassers ab.
    2. Übertragen Sie die Objektträger durch ein 95%iges Ethanolbad (1 min Dauer).
    3. Kratzen Sie den oxidierten Film mit sauberem Filterpapier von der Oberfläche der Hämatoxylinlösung ab. Tauchen Sie die Objektträger in gefiltertes Hämatoxylin (5 Minuten lang).
    4. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab. Kurz (<1 s) in 1%ige HCl-Lösung tauchen. Komplett mit einer erweiterten Spülung mit destilliertem Wasser.
    5. Bereiten Sie die gemischte Beize mit den Lösungen Orange G und EA50 vor. Fleck gleitet in die Mischung (für 3 min).
    6. Führen Sie die Objektträger durch drei aufeinanderfolgende 95%ige Ethanolbäder (5-s-Intervalle).
    7. In zwei Stufen (je 2 min) mit Xylol behandeln.
      HINWEIS: In einem Abzug arbeiten, um das Einatmen von Xyloldampf zu vermeiden. Verschließen Sie die Behälter sofort nach Gebrauch.
    8. Dauerhafte Konservierung von Proben mit neutralem Einbettmedium aus Harz
  6. Wenn Sie den Objektträger unter dem Mikroskop lesen, identifizieren Sie die Zellen mit blassrosa Zytoplasma und dunkelvioletten Kernen als kernhaltige Epithelzellen, unregelmäßige schuppige, nicht kernhaltige blassrosa Zellen als keratinisierte Epithelzellen und kleine runde blaue Zellen als weiße Blutkörperchen.
    HINWEIS: Bestimmen Sie das Stadium des Brunstzyklus anhand der folgenden zytologischen Merkmale: (1) Proöstrusphase: Vorherrschende kernhaltige Epithelzellen. Sie werden sowohl als einzelne Zellen als auch als gruppierte Blätter angezeigt. Spärliches Vorhandensein von Leukozyten (<5 % Sichtfeld); (2) Brunstphase: Reichlich entkernte keratinisierte Epithelzellen. Merkmale: große, abgeflachte Morphologie mit unregelmäßigen Rändern. Nahezu keine Leukozyten und kernhaltigen Zellen (<2% kombiniert); (3) Metestrus-Phase: Abnahme der keratinisierten Zellpopulation. Aufkommende Leukozyteninfiltration. Wiederauftauchende kernhaltige Epithelzellen (Zusammensetzung 20%-40%); (4) Diestrusphase: Dominante Leukozyten und kernhaltige Zellen (>80%). Praktisch keine keratinisierten Zellen (<1 %)5. Beziehen Sie sich zur Musterverifizierung auf den standardisierten zytologischen Atlas in Abbildung 1 .
  7. Organisieren und analysieren Sie die Daten und wählen Sie 24 Mäuse mit normalen Östruszyklen aus.

2. Vorbereitung der Cyclophosphamid-Injektion

HINWEIS: Cyclophosphamid ist instabil gegenüber Licht und sollte während des gesamten Prozesses im Dunkeln gehandhabt werden. Cyclophosphamid ist giftig, daher sollten während der Operation Schutzkleidung, doppellagige Nitrilhandschuhe und Masken getragen werden.

  1. Fügen Sie 200 mg steriles Cyclophosphamidpulver in pharmazeutischer Qualität zu 10 ml steriler Kochsalzlösung hinzu. Gründlich mischen, um eine Cyclophosphamidlösung von 20 mg/ml zu erhalten. Reservieren Sie eine Portion für den sofortigen Gebrauch; Mit dem Rest werden zusätzliche Konzentrationen hergestellt.
  2. Übertragen Sie 200 μl 20 mg/ml-Stammmaterial in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, das in Aluminiumfolie eingewickelt ist. Fügen Sie 800 μl sterile Kochsalzlösung hinzu, um 1 mL Gesamtvolumen zu erreichen. Vortex-Mischung für 30 s, um 4 mg/ml Lösung zu erhalten. Bereiten Sie 14 identische Aliquots (je 1 ml) vor. Lagern Sie alle Aliquote bei -20 °C in einem vertikalen Rack.

3. Injektion der Cyclophosphamid-Lösung

HINWEIS: Randomisieren Sie 24 Mäuse mit einem computergestützten System in drei Kohorten: (1) BLANK: Keine Behandlung (n = 8); (2) NS: Kontrollen der Kochsalzlösung (n = 8); (3) POI: Cyclophosphamid-Gruppe (n = 8). Injizieren Sie die Mäuse jeden Morgen um 9:00 Uhr. Für die POI-Gruppe wird am ersten Tag intraperitoneal 100 mg/kg Cyclophosphamidlösung injiziert und dann in den nächsten 14 Tagen kontinuierlich 20 mg/kg Cyclophosphamidlösung injiziert. Intraperitoneal injizieren Sie ein gleiches Volumen normaler Kochsalzlösung in die NS-Gruppe und lassen Sie die BALNK-Gruppe unbehandelt. Wiegen Sie jeden Tag alle Mäuse vor jeder Injektion und sammeln Sie vaginal abgeblätterte Zellen, um sie nach der Injektion zu verschmieren.

  1. Legen Sie einen mit Isofluran getränkten Wattebausch mit Pinzette in einen verschließbaren Behälter. Positionieren Sie die Maus im Behälter für eine 10-s-Inhalationsanästhesie.
    HINWEIS: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum mit einer gewissen Toxizität und Reizung. Die Operationen sollten in einer gut belüfteten Umgebung nach institutionell anerkannten Protokollen durchgeführt werden.
  2. Berechnen Sie das Injektionsvolumen: Körpergewicht (g) × 5 = μl. Desinfizieren Sie den rechten unteren Quadranten mit einem 75%igen Ethanoltupfer. Eine 26 G Nadel in einem Winkel von 30-45° einführen (Ausrichtung nach oben). Schieben Sie 5 mm durch die Bauchdecke, bis Sie das "Pop"-Gefühl haben. Liefern Sie die Lösung mit einer Rate von 50 μl/s.
  3. Füllen Sie Restflüssigkeiten und kontaminierte Geräte in lichtdichte Abfallbehälter mit der Aufschrift "PHOTOSENSITIVE WASTE". Entsorgen Sie mit Isofluran getränkte Wattebällchen in dafür vorgesehenen versiegelten Behältern, die mit durchsichtigen HAZARDOUS WASTE-Etiketten versehen sind.
  4. Tauen Sie gefrorene 4 mg/ml-Aliquots in einem 37 °C warmen Wasserbad auf (3 min). Berechnen Sie die Tagesdosis neu: Körpergewicht (g) × 5 = μl. Überprüfen Sie die Klarheit der Lösung, bevor Sie die Spritze laden.

4. Serum-Kollektion

HINWEIS: Nach 15 Tagen Injektion der Cyclophosphamidlösung entnehmen Sie bei allen Mäusen Blut aus der Herzscheitel. Zentrifuge, um das Serum zu erhalten. Mäuse der Kontrollgruppe und der NS-Gruppe sollten während der Diöstrusphase beprobt werden. Mäuse der POI-Gruppe wurden einer zeitlich angepassten Probenahme unterzogen, gepaart mit Mäusen der Kontroll-/NS-Gruppe, die sich nachweislich in Diöstrus befanden.

  1. Betäubung der Maus
    1. Legen Sie die Maus in eine transparente, luftdichte Kammer, in der sich ein mit Isofluran getränkter Wattebausch befindet.
    2. Beobachten Sie das Verhalten der Maus. Der Verlust des Aufrichtreflexes (Versagen der Selbstkorrektur bei sanfter Rückenlage) deutet auf eine adäquate Anästhesieeinleitung hin. Dieser Vorgang dauert in der Regel 2-3 Minuten.
    3. Entfernen Sie die Maus aus dem Behälter. Fixieren Sie seinen Kopf mit der linken Hand und drücken Sie vorsichtig mit dem Zeigefinger auf das obere Augenlid. Halten Sie ein steriles Wattestäbchen in der rechten Hand und tauchen Sie es in Erythromycin-Augensalbe, um eine Menge von 1-2 mm Durchmesser zu sammeln.
      1. Tragen Sie die Salbe gleichmäßig auf die Augapfeloberfläche und das innere Augenlid auf. Schließen Sie das Augenlid und massieren Sie es dann 10 s lang sanft mit der Fingerspitze, um die Salbe gleichmäßig zu verteilen. Wischen Sie überschüssige Salbe um das Auge mit einem trockenen Wattestäbchen ab.
  2. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer Schaumstoffplatte. Schneiden Sie die Brusthaare mit einer chirurgischen Schere. Desinfizieren Sie den Brust- und Bauchbereich mit 75% Ethanol.
    1. Inzidieren Sie die Haut und das Unterhautgewebe entlang der Mittellinie. Schneiden Sie die Interkostalmuskulatur in Längsrichtung entlang der linken Seite des Brustbeins durch. Entblöße das Herz.
  3. Führen Sie eine Spritze (mit der Nadelschräge nach oben) in einem Winkel von etwa 30° in die Herzspitze ein. Schieben Sie die Nadel langsam vor und ziehen Sie sie sanft an. Injizieren Sie das gewonnene Blut in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
  4. Geben Sie das gewonnene Blut in eine Zentrifuge. Die Zentrifuge wird auf 850 × g für 10 min bei 4 °C eingestellt. Nehmen Sie mit einer Pipette das Serum der oberen Schicht heraus und geben Sie es in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie es bei -80 °C.

5. Nachweis von Serumöstrogen, FSH und AMH

  1. Legen Sie das gefrorene Serum über Nacht in einen 4 °C Kühlschrank, um es langsam aufzutauen.
  2. Nehmen Sie das ELISA-Kit 30 Minuten vorher aus dem Kühlschrank, damit die darin befindlichen Reagenzien wieder Raumtemperatur annehmen können.
  3. Führen Sie gemäß den Anweisungen des Kits serielle Verdünnungen des Standards mit dem Standardverdünnungsmittel durch. Stellen Sie im Allgemeinen mehrere Konzentrationsgradienten ein, z. B. 0, 10, 20, 40, 80, 160 pg/ml usw.
  4. Geben Sie den verdünnten Standard und die zu testenden Serumproben in die entsprechenden Vertiefungen der ELISA-Platte, 100 μl pro Vertiefung. Richten Sie gleichzeitig blinde Kontrollvertiefungen ein und fügen Sie 100 μl des Probenverdünnungsmittels hinzu.
  5. Legen Sie die ELISA-Platte für 1-2 h in einen 37 °C heißen Inkubator, damit das Antigen und der Antikörper vollständig binden können.
  6. Nachdem die Inkubation beendet ist, saugen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in den Vertiefungen an. Waschen Sie die ELISA-Platte 3-5 Mal mit der Waschlösung. Tupfen Sie die ELISA-Platte nach jedem Waschen vorsichtig trocken, um die restliche Waschlösung zu entfernen.
  7. Fügen Sie die enzymmarkierte Antikörper-Arbeitslösung mit 100 μl pro Vertiefung hinzu. Inkubation in einem 37 °C heißen Inkubator für 1 h fortsetzen.
  8. Wiederholen Sie die obigen Waschschritte, waschen Sie 3-5 Mal und tupfen Sie die ELISA-Platte trocken.
  9. Geben Sie 100 μl Substratlösung in jede Vertiefung. Vorsichtig durch Schütteln mischen. Im Dunkeln bei 37 °C 15-30 min inkubieren, bis sich eine klare blaue Farbe bildet.
  10. Geben Sie 100 μl Terminationslösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Beobachten Sie den Farbwechsel von Blau zu Gelb.
  11. Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die Absorptionswerte (A-Werte) jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 450 nm abzulesen und die Daten aufzuzeichnen.
  12. Nehmen Sie die Konzentration des Standards als Abszisse und den entsprechenden Absorptionswert als Ordinate, um eine Standardkurve zu zeichnen. Verwenden Sie im Allgemeinen die polynomiale Anpassung, um sicherzustellen, dass der Korrelationskoeffizient r² der Standardkurve größer als 0,99 ist.
    1. Setzen Sie gemäß der Standardkurve den Absorptionswert der zu testenden Serumprobe in die Standardkurvengleichung ein, um die Hormonkonzentration in der Probe zu berechnen.

6. Entnahme von Eierstockgewebe

  1. Euthanasieren Sie die noch anästhesierte Maus durch Zervixluxation (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) und verwenden Sie dann eine chirurgische Schere, um den Bauch der Maus zu öffnen.
  2. Die Eierstöcke befinden sich unterhalb der Nieren und sind mit weißen Fettpolstern umwickelt. Heben Sie die Fettpolster vorsichtig mit einer Pinzette an, um die Eierstöcke und Eileiter freizulegen. Trennen Sie die Eierstöcke mit einer Schere vom umgebenden Bindegewebe.
  3. Legen Sie das entnommene Eierstockgewebe zur Fixierung für 24 h in 4%iges Paraformaldehyd.

7. Vorbereitung der Paraffinschnitte

  1. Dehydratisierung: Nehmen Sie die Eierstöcke heraus und passieren Sie sie nacheinander durch Ethanollösungen unterschiedlicher Konzentrationen (75%, 85%, 95%, 100%), wobei jeder Schritt 1 Stunde dauert.
  2. Transparenzbehandlung: Behandeln Sie zunächst die Eierstöcke 15 Minuten lang in einer Mischung aus Xylol und Ethanol. Tauchen Sie sie dann jeweils 15 Minuten lang in Xylol I und Xylol II.
  3. Wachsimprägnierung: Tauchen Sie die Eierstöcke in eine Mischung aus Xylol und Paraffin. Übertragen Sie sie dann für jeweils 0,5 h in Paraffin I, Paraffin II und Paraffin III.
  4. Einbetten: Legen Sie die mit Wachs imprägnierten Eierstöcke in eine Einbettform. Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes an (mit der Schnittfläche nach unten). Gießen Sie geschmolzenes Paraffin in die Form und lassen Sie es abkühlen und erstarren.
  5. Schneiden: Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Mikrotom in 5 μm dicke Abschnitte. Führen Sie das serielle Schneiden durch und übertragen Sie das Band vorsichtig mit einer Bürste, um sicherzustellen, dass es ein gleichmäßiges, durchscheinendes Band bildet, das flach und ohne Verzerrung aufliegt, wenn es auf einem Wasserbad schwimmt

8. H&E-Färbung

  1. Entparaffinierung: Tauchen Sie die in Paraffin eingebetteten Abschnitte für 10 min in Xylol I. Dann die Abschnitte auf Xylol II übertragen und weitere 10 min einweichen.
  2. Rehydratisierung: Die Abschnitte durchlaufen nacheinander eine Reihe von Ethanollösungen unterschiedlicher Konzentrationen: 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 85 % Ethanol und 75 % Ethanol mit einer Eintauchzeit von jeweils 5 Minuten. Zum Schluss die Abschnitte 1 min lang mit destilliertem Wasser abspülen.
  3. Hämatoxylin-Färbung: Tauchen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Hämatoxylin-Färbelösung. Spülen Sie die Abschnitte 30 s lang unter fließendem Wasser ab.
  4. Unterscheidung: Tauchen Sie die Schnitte 1-3 s in 1%ige Salzsäure-Ethanol-Lösung. Spülen Sie die Abschnitte 1-2 min unter fließendem Wasser ab.
  5. Zytoplasmatische Färbung: In Eosin-Y-Lösung eintauchen (1 min). Überschüssigen Fleck mit Filterpapier abtupfen.
  6. Dehydratisierung: Die Abschnitte werden durch eine Reihe von Ethanollösungen geführt: 85 % Ethanol, 95 % Ethanol und 100 % Ethanol (zweimal), mit einer Eintauchzeit von jeweils 5 s.
  7. Räumung: Tauchen Sie die Abschnitte 5 min in Xylol I. Dann die Abschnitte auf Xylol II übertragen und weitere 5 min einweichen.
  8. Montage: Tropfen Sie neutrales Harz auf die befleckte Stelle. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den Abschnitt.
  9. Follikelzählung: Betrachten Sie die gefärbten Schnitte unter dem Mikroskop. Zählen und notieren Sie die Anzahl der Follikel in verschiedenen Entwicklungsstadien.

9. Immunhistochemie für Caspase-3 im Ovarialgewebe

  1. Antigen-Rückgewinnung: Legen Sie die entwachsten und rehydrierten Abschnitte in Natriumcitratpuffer (pH 6,0). Die Abschnitte in der Mikrowelle bei hoher Leistung 5 Min. erhitzen. Dann herausnehmen und abkühlen lassen.
    1. Wiederholen Sie den Heizvorgang noch 2 Mal, für insgesamt 3 Heizzyklen. Nach dem natürlichen Abkühlen die Abschnitte 3 Mal mit PBS waschen, jeweils 5 Minuten lang.
  2. Eliminierung der endogenen Peroxidase: 3% H₂O₂ tropfenweise auf die Schnitte geben. Inkubieren Sie die Schnitte bei Raumtemperatur im Dunkeln für 10 min. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal mit PBS, jeweils 3 Minuten lang.
  3. Serumblockierung und Antikörperinkubation: Geben Sie den Kaninchen-Anti-Caspase-3-Primärantikörper tropfenweise auf die Schnitte. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht in einer Nassbox bei 4 °C. Lassen Sie die Abschnitte am nächsten Tag für 30 Minuten wieder auf Raumtemperatur kommen. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal mit PBS, jedes Mal für 5 Minuten.
  4. Farbentwicklung, Gegenfärbung und Montage: Verwenden Sie DAB für die Farbentwicklung, die in der Regel ca. 1-5 Minuten dauert. Färben Sie die Abschnitte 2 Minuten lang mit Hämatoxylin gegen. Nach dem Gegenfärben die Abschnitte 5 Minuten lang waschen.
    1. Legen Sie die Abschnitte dann 1 Minute lang in Ammoniakwasser, um sie blau zu färben. Führen Sie abschließend eine Dehydrierung durch einen Ethanolgradienten durch, räumen Sie die Abschnitte und montieren Sie sie.

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Ergebnisse

Der Prozess der Erstellung des POI-Mausmodells ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Körpergewicht und der Brunstzyklus der Mäuse wurden ab dem ersten Tag der Medikamenteninjektion aufgezeichnet. Nach 15 Tagen CTX-Injektion war die durchschnittliche Abnahmerate des Körpergewichts der Mäuse in der POI-Gruppe (3,717 % ± 1,463 %) signifikant höher als in der BLANK-Gruppe (0,2526 % ± 0,1469 %) und der NS-Gruppe (0,4305 % ± 0,2494 %) (p < 0,0001). Es gab keinen statistisch signifikanten...

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Diskussion

Die vorzeitige Ovarialinsuffizienz (POI) beeinträchtigt die körperliche Gesundheit und Lebensqualität von Frauen erheblich, und ihre weltweite Prävalenz nimmt von Jahr zu Jahr zu. Derzeit fehlt es jedoch noch an sicheren und effektiven Behandlungsmethoden für POI. Die Etablierung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Tiermodells ist entscheidend, um die Forschung an POI voranzutreiben. Klinisch sind die Ursachen für POI vielfältig, und Chemotherapeutika sind wichtige bekannte pathogen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung, die sie von der Wu Jieping Medical Foundation im Rahmen ihres Sonderfinanzierungsprogramms für klinische Forschung (Fördernummer 320.6750.17067) erhalten haben. Wir danken auch der Forschungsplattform und der technischen Unterstützung, die Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd zur Verfügung gestellt hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% ParaformaldehydSangon Bioengineering Co., LtdA500684-0500
75% AlkoholShandong Dexinkang Medical Technology Co., Ltd200603
Wasserfreies EthanolBengbu Fabrik für chemische Reagenzien
ZentrifugenröhrchenBioscharfBS-15-M
Kalter TischQuanlin MedizinQL-LT20230003
WattebällchenShandong Brilliance Co., Ltd20241008
DeckgläserJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd80312-3412
CyclophosphamidBaxter Oncology GmbH3K645A
DörrautomatHubei Xiaogan Haikuo Medizintechnik Co., LtdKH-TS
FärbemaschineHubei Xiaogan Haikuo Medizintechnik Co., LtdKH-S101 
EA50 FärbelösungHubei Taikang Medical Equipment Co., LtdJ7EC20
Zange für OhrmarkenShenzhen Ruiwode Biowissenschaften und TechnologieNr. C22002-10
Effizientes Trennen von ParaffinTongxiang Hualing Wax Industry Co., Ltd20241018
Elektrischer Hochtrocknungsofen (Ofen)Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdHCZF-11
Elektrisch beheizter thermostatischer WasserinkubatorShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdHSW-600
EinbettmaschinePrisstar Changzhou Medical Device Co., LtdPMB-A
Eosin-FleckSewell Biotechnology Co., LtdNr. G1005-2
Hämatoxylin-DifferenzierungslösungSewell Biotechnology Co., LtdNr. G1039-500ML
Hämatoxylin-FärbelösungSewell Biotechnology Co., LtdNr. G1005-1
IsofluranVerifizierter Lieferant - Shandong Ante Tierzucht Technologie Co., Ltd2024101501
MikroskopAnhui Jiashang Biotechnology Co., LtdSQS-12P
Maus Anti-Müller-Hormon (AMH) ELISA-KitHengyuan BiotechnologieHB1334-Mu
Enzymgebundenes Immunoassay-Kit für Estradiol (E2) für die MausHengyuan BiotechnologieHB975-Mu
ELISA Kit für follikelstimulierendes Hormon (FSH) bei MäusenHengyuan BiotechnologieHB967-Mu
Neutrales GummiNanchang Yulu Experimentelle Ausrüstung Co., Ltd240504
Pathologisches GewebebleichgerätPrisstar Changzhou Medical Device Co., LtdPHY-III
PBS-PufferBioscharfBL302A
PipettenspitzenBioscharfBS-10-T
PipettenDalong Medical Equipment Co., LtdYE213AT0257922
Schneller GewebeentwässererHubei Xiaogan Haikuo Medizintechnik Co., LtdKH-TS
SchneidemaschineGheddyYD-315
DiapositiveJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd80312-3161
SchmiermaschineHubei Taikang Medical Equipment Co., Ltd131001305
Natriumchlorid-InjektionWuhan Binhu Shuanghe Pharmaceutical Co., LtdArtikel-Nr.: 240525K04
SpritzeJiangsu Zhiyu Medical Device Co., Ltd
Vibrierender AllesschneiderShanghai Zhixin Instrument Co., LtdZQP-86
XylolVerifizierter Lieferant - Tianjin Kaitong Chemisches Reagenz Co., Ltd20240102

Referenzen

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