Schneller Nachweis von Staphylococcus aureus und Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus mittels Multiplex-Real-Time-Fluoreszenz-PCR

Summary

Dieses Protokoll verwendet Multiplex-Real-Time-PCR mit Primern/Sonden, die auf SA-spezifische NUC- und MRSA-mecA-Gene abzielen. Es ermöglicht einen schnellen (<1 h), qualitativen Nachweis von SA/MRSA-Nukleinsäuren in humanen Sputumproben und überwindet die Einschränkungen kulturbasierter Methoden.

Abstract

Staphylococcus aureus (S.aureus) ist ein häufiger grampositiver humanpathogener Erreger, der ambulant erworbene und nosokomiale Infektionen verursacht, mit vielfältigen klinischen Manifestationen, die von lokalen oberflächlichen Läsionen und Lebensmittelvergiftungen bis hin zu tödlichen systemischen Infektionen reichen. Die Entdeckung von Antibiotika senkte die Sterblichkeitsrate erheblich, aber das Problem der Arzneimittelresistenz ist seitdem immer mehr in den Vordergrund gerückt. Seit der ersten Identifizierung von MRSA im Jahr 1960 hat sich dieser Stamm zu einer globalen Bedrohung für die öffentliche Gesundheit entwickelt. MRSA ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen, der verschiedene schwere Krankheiten wie Endokarditis, chronische Osteomyelitis, Lungenentzündung, pyogene Arthritis und Bakteriämie verursachen kann. Daher ist ein schneller und genauer Nachweis von S. aureus und seiner Arzneimittelresistenz entscheidend für die klinische Behandlung.

Die derzeitigen routinemäßigen Nachweismethoden für S.aureus und MRSA weisen erhebliche Einschränkungen auf. Die traditionelle Bakterienkulturmethode, die jahrzehntelang als "Goldstandard" diente, kann definitive Ergebnisse zur Identifizierung von Spezies und zur Arzneimittelempfindlichkeit liefern, aber der Prozess ist zeitaufwändig und dauert 48 bis 72 Stunden. Darüber hinaus ist diese Methode anfällig für Kontaminationen und ist auf spezialisierte Laboreinrichtungen und qualifizierte Techniker angewiesen. Die serologische Testung ermöglicht eine nicht-invasive Diagnose, indem sie S.aureus-Antikörper im Serum des Patienten nachweist, aber weder zwischen aktiven Infektionen und früheren Infektionen noch zwischen arzneimittelresistenten Stämmen (wie MRSA) unterscheiden kann.

Diese Studie konzentriert sich auf die Entwicklung einer neuartigen Multiplex-Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Detektionsmethode, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Diese Methode entwickelt spezifische Primer und TaqMan-Fluoreszenzsonden, die auf das speziesspezifische NUC-Gen von S.aureus und das mecA-Gen, das die Methicillinresistenz vermittelt, abzielen und so die gleichzeitige Amplifikation und den Nachweis von S.aureus und MRSA in einem einzigen Reaktionssystem ermöglichen. Diese Technologie reduziert die Nachweiszeit erheblich und bietet eine schnelle, genaue und kostengünstige Lösung für den Nachweis von S.aureus und MRSA. Dieser innovative Ansatz verbessert die Effizienz der klinischen Diagnostik erheblich und ermöglicht die frühzeitige Umsetzung einer gezielten Antibiotikatherapie, wodurch er einen wichtigen Beitrag zur Kontrolle arzneimittelresistenter bakterieller Infektionen leistet.

Introduction

S. aureus ist ein weit verbreiteter grampositiver bedingter Erreger, der die Nasenschleimhaut gesunder Personen besiedelt ^1,2. Wenn die Immunität des Wirts beeinträchtigt ist, kann dies zu lokalen Hautinfektionen, einer tiefen Gewebeinvasion oder systemischen Erkrankungen (^{z. B}. Lungenentzündung, Endokarditis, Osteomyelitis und Bakteriämie) führen3. Methicillin, ein halbsynthetisches Penicillin, wurde 1959 klinisch bei S. aureus-Infektionen eingesetzt, und zwei Jahre später trat MRSA in Großbritannien auf und breitete sich schnell in europäischen Ländern wie Dänemark, Frankreich und der Schweiz aus⁴. Eine MRSA-Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika erschwert nicht nur das klinische Management, sondern erhöht auch das Infektionsrisiko erheblich⁵. Mehrere Faktoren - darunter unkontrollierbare Besiedlung/Ausbreitung, hohe Präventionskosten und übermäßiger Einsatz von Antibiotika - haben zusammen die MRSA-Infektionsraten in die Höhe getrieben⁶. Aufgrund der schnellen Übertragung und der komplexen Resistenzmechanismen sind MRSA-Infektionen mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden, mit fast 150.000 gemeldeten Fällen und >7.000 Todesfällen pro Jahr in den EU-Ländern⁷. Laut CHINET-Überwachungsdaten sind die MRSA-Infektionsraten in China in den letzten fünf Jahren über 30 % geblieben⁸. Das hohe Risiko nosokomialer Kreuzinfektionen verschärft die Belastung der öffentlichen Gesundheit weiter und belastet die Gesundheitssysteme ^9,10. Daher ist die Entwicklung effizienter und präziser MRSA-Schnellnachweistechnologien klinisch dringend erforderlich, um eine frühzeitige Diagnose und eine personalisierte Therapie zu erreichen, die Mortalität zu senken und Übertragungsketten zu unterbrechen.

Die aktuellen Nachweistechnologien für S.aureus und MRSA erstrecken sich über mehrere Bereiche, darunter phänotypische Nachweise, genomische Nachweise, transkriptomische Nachweise, proteomische Nachweise, Massenspektrometrie-Technologie und bioinformatikbasierte Analysen¹¹.

Phänotypische Nachweismethoden, wie z. B. die Scheibendiffusionsmethode (KB-Methode) und die Methode der minimalen Hemmkonzentration (MHK-Methode), werden vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) und dem Europäischen Komitee für antimikrobielle Empfindlichkeitstests (EUCAST) als "Goldstandards" empfohlen. Diese Methoden haben den Vorteil, dass keine speziellen Instrumente erforderlich sind, da sie häufig für die Überwachung des Resistenzspektrums und epidemiologische Untersuchungen eingesetzt werden. Ihre Nachteile sind jedoch auch offensichtlich: Lange Kulturperioden (über 24 h) und die Ergebnisse der KB-Methode für einige neue Antibiotika erfordern eine Validierung durch MHK-Werte, wobei die Ergebnisse für Breakpoint-Stämme anfällig für humane Faktoren sind^12,13.

Unter den Nachweismethoden auf genomischer Ebene zeichnet sich die konventionelle PCR durch eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aus, die eine vorläufige Beurteilung der Resistenz ermöglichen und die experimentelle Zeit bei geringen Kosten und hoher Effizienz verkürzen. Seine Grenzen liegen jedoch darin, dass nur bekannte Resistenzgene nachgewiesen werden können und auf spezialisierte Instrumente zurückgegriffen^{werden kann 14}. Der Mechanismus der mikrobiellen Resistenz ist hochkomplex, so dass es von entscheidender Bedeutung ist, technische Methoden zu entwickeln, die unbekannte resistente Phänotypen abdecken und eine schnelle Identifizierung ermöglichen können. Die aufstrebende GoPhAST-R-Technologie (Combined genotypic and phenotypic AST through RNA detection) bestimmt Resistenzphänotypen durch den Nachweis von mRNA-Expressionsniveaus, ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis verschiedener resistenzbezogener Gene über mehrere Krankheitserreger hinweg, verkürzt die experimentelle Durchlaufzeit und erreicht in Kombination mit maschinellem Lernen eine Genauigkeit von 94-99 %¹⁵.

Unter den Nachweismethoden auf proteomischer Ebene basiert die PBP2a-Latexagglutinationsmethode auf der Antigen-Antikörper-spezifischen Bindung, mit einfacher Bedienung und schnellen Ergebnissen, mit hoher Spezifität und Sensitivität für MRSA. Es kann jedoch nicht zwischen verschiedenen Spezies von Staphylokokken unterscheiden, und die Nachweisempfindlichkeit kommerzieller Kits hat etwas abgenommen, so dass nach der Induktion mit Oxacillin⁸ ein erneuter Test erforderlich ist.

MALDI-TOF MS-basierte Nachweismethoden, wie z. B. die DOT-MGA-Methode (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), erreichen eine optimale analytische Leistung nach 6-8 Stunden Inkubation mit einer Nachweisrate von bis zu 96,4 %, und sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität liegen bei 100 %. Aber die Kosten sind hoch, und die begrenzten Positionen auf der Zielplatte machen es schwierig, gleichzeitig Hunderte von Proben zu detektieren^16,17.

Unter den bioinformatischen Analysetechnologien, die mit Omics-Daten zur Vorhersage von Resistenzen kombiniert werden, sticht die Ganzgenomsequenzierungstechnologie durch ihre hohe Auflösung und ihre umfassenden Möglichkeiten zur Informationsanalyse hervor. In Kombination mit Datenbanken zur Analyse von Resistenzgenen wie Resfinder kann analysiert werden, ob Stämme spezifische Resistenzgene tragen, das Resistenzpotenzial vorhersagen, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und resistenzassoziierte Genmutanten nachweisen und gleichzeitig die Speicherung und Reanalyse von Gesamtgenomdaten unterstützen¹⁸. Diese Methode erfordert jedoch die Bedienung durch Fachleute mit bioinformatischem Hintergrund, wird selten in täglichen Tests eingesetzt und wird häufig für die epidemiologische Analyse oder die molekulare Überwachung von Krankheitserregern eingesetzt¹⁹.

Die oben genannten Methoden sind entweder kostenintensiv, zeitaufwändig oder befinden sich noch in der Forschungs- und Entwicklungsphase. Klinisch besteht ein dringender Bedarf an einer Lösung, die "Unmittelbarkeit" und "Genauigkeit" in Einklang bringt - eine neuartige Multiplex-Fluoreszenz-PCR-Technologie füllt diese Lücke, indem sie gleichzeitig nuc/mecA-Gene in einem einzigen Röhrchen amplifiziert und den Nachweiszyklus auf 1 h verkürzt. Es überbrückt präzise die Zeitfensterlücke im traditionellen Prozess des "Notfall-Screenings - Resistenztypisierung" und bietet ein zeiteffizienteres molekulares Diagnosewerkzeug für die Prävention und Kontrolle nosokomialer Infektionen. Dieser spezifische PCR-Assay wird hauptsächlich für den Nachweis von Atemwegsproben verwendet, wobei Sputumproben ein typisches Beispiel sind. Es weist eine Sensitivität von 500 Kopien/ml und eine hohe Spezifität auf, während es von antibakteriellen Wirkstoffen nicht beeinflusst wird. Aufgrund dieser günstigen Leistungsmerkmale hat dieser PCR-Assay einen erheblichen Anwendungswert für die Diagnose von Atemwegsinfektionen und die Überwachung von nosokomialen Infektionen, die durch MRSA verursacht werden.

Protocol

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong genehmigt (Ethik-Nr.: KY2025-510-01). Detaillierte Informationen zu den in dieser Forschung verwendeten Materialien (Reagenzien, Chemikalien, Geräte und Software) finden Sie in der Materialtabelle.

1. Protokoll zur Probenentnahme und Konservierung

1. Einschlusskriterien: Mit Ausnahme von Qualitätskontrollmaterialien sind alle entnommenen Proben als positive Proben nach der Goldstandardmethode (kulturbasierter Assay) zu identifizieren.
2. Sammlung von menschlichem Sputum
   1. Sammeln Sie 1-3 ml tief hustenden Auswurf aus den unteren Atemwegen der Probanden mit sterilen Probenahmeröhrchen. Röhrchen sofort verschließen und zur Analyse transportieren. Verarbeiten Sie die Proben sofort für die Prüfung.
3. Lagerung von Proben:
   1. Analysieren Sie die Proben, die mit der oben genannten Methode entnommen wurden, umgehend. Eine kurzfristige Lagerung ist unter folgenden Voraussetzungen zulässig:
      2-8 °C: ≤7 Tage
      -20 °C ± 5 °C: ≤6 Monate
      -70 °C ± 5 °C: ≤24 Monate
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Sputumproben nicht mit Konservierungsstoffen (wie BHI-Brühe + Glycerin usw.) behandelt. Nach der Entnahme wurden sie unter den oben beschriebenen Bedingungen gelagert, wobei ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen strikt vermieden wurde. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Maximal zulässige Gefrier-Tau-Zyklen: ≤3.

2. Nukleinsäure-Extraktion

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination zu vermeiden.

1. Für die Vorbehandlung der Sputumprobe die Probe mit 4 % NaOH-Lösung im Verhältnis 1:4 (Sputumprobe: 4 % NaOH-Lösung) mischen, um viskose Sputumproben zu verflüssigen und störende Verunreinigungen zu entfernen, dann gründlich (30 s) vortexen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22-25 °C) inkubieren, um eine Verflüssigung zu erreichen.
2. Herstellung von Reagenzien für die Nukleinsäureextraktion
   1. Nehmen Sie die vorverpackte 96-Well-Platte aus dem Kit. Bewegen Sie die 96-Well-Platte leicht, um die Reagenzien und magnetischen Kügelchen auf den Boden der 96-Well-Platte zu konzentrieren.
   2. Reißen Sie die Siegelfolie der Aluminiumfolie vorsichtig ab und vermeiden Sie ein Vibrieren der 96-Well-Platte, um ein Herausspritzen von Flüssigkeit zu verhindern.
   3. In den Lösungen von Spalte 1 und Spalte 7 der 96-Well-Platte: Fügen Sie zuerst 20 μl Proteinase K hinzu, dann fügen Sie 200-300 μl Probe hinzu, die extrahiert werden soll.
3. Automatisierte Nukleinsäure-Extraktion (Magnetic bead-based method)
   1. Setzen Sie die vorverpackte 96-Well-Platte mit den hinzugefügten Proben in den entsprechenden Schlitz des automatischen Nukleinsäure-Extraktionsgeräts ein.
   2. Befolgen Sie den Nukleinsäure-Extraktionsprozess wie unten beschrieben.
      1. Übertragen Sie die mit Nukleinsäure adsorbierten Magnetkügelchen mit dem Magnetstab an der Laborkammer in verschiedene Reagenzienlöcher.
      2. Verwenden Sie das Rührset, um die Flüssigkeit schnell und wiederholt zu mischen, so dass sich die Flüssigkeit und die magnetischen Kügelchen gleichmäßig vermischen.
      3. Während sich die flüssigen und magnetischen Kügelchen harmonisch verbinden, durchläuft die automatisierte Nukleinsäure-Extraktionsmaschine die aufeinanderfolgenden Stadien der Zelllyse, der Nukleinsäureadsorption (70 °C, 15 min, 3-fache magnetische Adsorption), des Waschens (3 mal, jeweils 2 Minuten mischen, dann zweimal (jeweils 15 s) und der Elution (2 mal, jeweils 5 Minuten mischen, 3-fache magnetische Adsorption), schließlich erhält es Nukleinsäuren von hoher Reinheit.
      4. Validieren Sie die Nukleinsäurekonzentration und -reinheit mit einem Spektralphotometer. Das Volumen der Nukleinsäureprobe betrug 50 μl, wobei die Konzentration zwischen 50 und 100 ng/μl lag und das Verhältnis A260/A280 1,8 ± 0,2 betrug.
   3. Nachdem das Programm beendet ist, saugen Sie die Elutionslösung, die Nukleinsäure enthält, direkt aus Säule 6 und Säule 12 für nachfolgende Tests. Lagern Sie die verbleibenden extrahierten Nukleinsäureproben bei -20 °C für die Langzeitkonservierung und zukünftige Verwendung.

3. qPCR Nachweis von S. aureus-Nukleinsäuren und MRSA-Nukleinsäuren

1. Vorbereitung von Amplifikationsreagenzien
   1. Nehmen Sie die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionslösung und die nuc/mecA-Reaktionslösung aus dem Kit (nuc-Gen-spezifische Primer/Sonde für S. aureus und mecA für MRSA). Nach dem Auftauen bei 22-25 °C vollständig oszillieren und gleichmäßig mischen, dann eine sofortige Zentrifugation durchführen (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
   2. Entsprechend der Anzahl der zu testenden Proben, N, bereiten Sie Reagenzien basierend auf der Gesamtmenge von N+2 vor (N ist die Anzahl der Proben und 2 sind die negativen und positiven Qualitätskontrollen). Die einzelnen Schritte lauten wie folgt:
      1. Bereiten Sie die Reaktionssystemmischung vor (16 μl Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionslösung (Puffer, dNTPs, DNA-Polymerase, UDG-Enzym) + 4 μl nuc/mecA-Reaktionslösung (Primer und Sonden für die Zielnachweisgene nuc, mecA und die interne GAPDH-Referenz).
      2. Geben Sie es in ein Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe, oszillieren Sie vollständig und mischen Sie gleichmäßig und führen Sie eine sofortige Zentrifugation durch (~6000 g, 15 s, 22 °C-25 °C). Geben Sie dann 20 μl pro Röhrchen in PCR-Reaktionsröhrchen ab.
2. Nukleinsäure- und Qualitätskontrollproben hinzufügen:
   1. In die oben vorbereiteten PCR-Reaktionsröhrchen (20 μl) geben Sie jeweils 5 μl Nukleinsäure aus den getesteten Proben, der Positivkontrolle und der Negativkontrolle, um ein Endvolumen von 25 μl pro Röhrchen zu erreichen.
   2. Verschließen Sie die Röhrchen fest und führen Sie eine sofortige Zentrifugation durch (~6000 × g, 15 s, 22-25 °C) und setzen Sie die Röhrchen dann in das PCR-Gerät ein.
3. PCR-Amplifikation:
   1. Stellen Sie das Fahrprogramm wie folgt ein: Vordenaturierung: 97 °C, 90 s, 1 Zyklus; die folgenden 2 Stufen für 42 Zyklen: 97 °C Denaturierung für 2 s und 55 °C Glühen für 15 s.
   2. Stellen Sie die Parameter für die Detektion von Fluoreszenzsignalen wie folgt ein: Verwenden Sie die FAM-Fluoreszenzmarkierung von NUC-Genen ; VIC-Fluoreszenzmarkierung von mecA-Genen ; und CY5-Fluoreszenzmarkierung des GAPDH-Gens als interne Kontrolle des Kits. Erfassen Sie Daten bei 55 °C. Stellen Sie nach Abschluss der Reaktion sicher, dass die Daten für zukünftige Analysen gespeichert werden.
   3. Analysieren Sie Daten mit qPCR-spezifischer Software (SLAN 96P):
      1. Probeninformationen: Beschriften Sie im Layoutdiagramm der Well-Platte der Software die Probentypen (z. B. Positivkontrolle, Negativkontrolle, unbekannte Probe, internes Referenzgen usw.), die den Probenladepositionen entsprechen.
      2. Platzieren der Reaktionsgefäße: Öffnen Sie den Deckel des Heizmoduls des Geräts, platzieren Sie die versiegelte PCR-Platte/-Röhrchen fest im Inneren, stellen Sie sicher, dass sie eng mit dem Heizmodul verbunden sind, und schließen Sie den Moduldeckel fest (um Temperaturunebenheiten zu vermeiden)
      3. Starten der Reaktion: Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Programmeinstellungen in der Software korrekt sind, klicken Sie auf Ausführung starten und notieren Sie sich die Experiment-ID zum späteren Nachschlagen.
      4. Anhalten des Laufs und Entfernen der Röhrchen: Warten Sie nach Beendigung der Programmausführung, bis die Temperatur des Heizmoduls unter 50 °C gefallen ist, öffnen Sie dann den Deckel, um die PCR-Platte/-Röhrchen zu entfernen, und behandeln Sie die Proben ordnungsgemäß.
4. Datenanalyse
   1. Bestätigen Sie vor der Datenanalyse drei visuelle Ergebnisse: 1) Die Amplifikationskurven aller Proben (einschließlich der internen Kontrolle) zeigen eine typische S-Form ohne flache oder ungewöhnlich verzögerte Anstiegskurven; 2) Die Fluoreszenzschwellenlinie kreuzt die Exponentialphase der Kurven und die Ct-Werte der internen Kontrolle (z. B. GAPDH) liegen innerhalb von ≤ 38 Zyklen (Variationskoeffizient < 5%); 3) Während des gesamten Versuchs werden Negativ-/Positivkontrollen durchgeführt, um die Möglichkeit einer Kontamination zu überwachen.
      1. Wenn das Experiment außer Kontrolle geraten ist, überprüfen Sie den gesamten Stapel erneut. Wenn eine Probe eine abnormale Amplifikation aufweist (z. B. eine atypische S-Kurve oder einen Ct-Wert innerhalb des kritischen Bereichs), überprüfen Sie diese Probe erneut.
   2. Rufen Sie die experimentellen Daten in der Software ab, stellen Sie den Schwellenwert und die Basislinie ein und berechnen Sie die Ct-Werte automatisch oder manuell, da das Gerät automatisch den Basisschwellenwert wählt. Legen Sie den endgültigen positiven Bestimmungswert auf Ct ≤ 36 fest. Der Referenzbereich für das interne Referenzgen erfordert Ct ≤ 38. Vergewissern Sie sich, dass ihre Verstärkungskurven charakteristische S-förmige Profile aufweisen.

Results

Nachweis von S. aureus und MRSA mittels qPCR
Basierend auf dem speziesspezifischen NUC-Gen von S. aureus und dem mecA-Arzneimittelresistenzgen von MRSA haben wir Primer und Sonden entwickelt, die mit unterschiedlichen Fluorophoren für den qPCR-Nachweis markiert sind. Alle Ergebnisse der Qualitätskontrolle während der qPCR-Experimente lagen durchweg innerhalb der empfohlenen Schwellenwerte, was die Zuverlässigkeit der Nachweisergebnisse bestätigt (

Discussion

Die genaue und frühzeitige Erkennung von Methicillin-Resistenzen ist entscheidend für die Prognose von Infektionen, die durch S. aureus verursacht werden. Die frühzeitige Identifizierung von S. aureus und MRSA kann den Missbrauch von Breitbandantibiotika verringern und den Selektionsdruck verringern, der zur Entstehung und Ausbreitung von bakteriellen Resistenzen führt.

Traditionelle phänotypische Nachweismethoden, wie z. B. die Cefoxitin-Sch...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatisierter Nukleinsäure-Extraktor	DAAN	Smart 32	Für die DNA-Extraktion
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosicherheitswerkbank
E-Zentrifuge	WEALTEC		Zentrifugieren Sie die Restflüssigkeit von der Wand des Rohrs
Methicillin-resistentes Staphylococcus aureus-Gen-Nachweiskit für Arzneimittelresistenz	BOJIE	ZC-HX-38-2	Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Resistenzgenen
Nukleinsäure-Extraktionskit	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Nukleinsäure extrahieren
SLAN Vollautomatisches medizinisches PCR-Analysesystem	HONGSHI		Datenanalyse
SLAN-96S Real-Time PCR-Gerät	HONGSHI	SLAN-96S	Fluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation
Thermo Scientific NanoTropfen	Thermo Scientific	NanoDrop Eins	Quantitative Analyse von DNA, RNA und Proteinen
Ultratiefkühlschränke (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &Grad; C für die Lagerung von Reagenzien
Vortex-5	Kylin-Glocke		Zum Mischen von Reagenz