Methodenartikel

Ein optimierter LIVE/DEAD-Assay in Verbindung mit Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefezellen

DOI:

10.3791/69005

⸱

29. August 2025

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefeproben vor. Der Assay verwendet zwei Fluoreszenzfarbstoffe, SYTO 9 und Propidiumiodid (PI), um die Integrität der Plasmamembran zu quantifizieren. Es verwendet Durchflusszytometrie, um quantitative und reproduzierbare Schätzungen der lebenden, toten und geschädigten Zellfraktionen für Proben mit postoxidativem Stress zu liefern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Quantifizierung des Überlebens ist eine häufige und kritische Aufgabe in der Hefeforschung. LEBEN/TOT-Färbungen, die auf der Integrität der Plasmamembran basieren, bieten in Verbindung mit der Durchflusszytometrie einen schnellen und hohen Durchsatz-Assay für das Überleben von Hefen. Schwankungen des Färbepuffers, der Farbstoffkonzentration, der Inkubationszeit und der Durchflusszytometrie-Einstellungen können sich jedoch auf die Datenqualität und Reproduzierbarkeit auswirken. Dieses Protokoll stellt einen standardisierten LIVE/DEAD-Assay für die Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefe mittels Durchflusszytometrie dar. Nach der Behandlung von Candida glabrata, einem opportunistischen Hefeerreger, mit unterschiedlichen Dosen von Wasserstoffperoxid wurden die Post-Stress-Proben mit einem Zweikomponenten-LIVE/DEAD-Fleck bestehend aus SYTO 9 und Propidiumiodid (PI) gefärbt. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um lebende, beschädigte und tote Zellpopulationen zu unterscheiden und ihre Prozentsätze in jeder Probe zu quantifizieren. Überlebensschätzungen, die auf der Statistik des prozentualen Lebensunterhalts basieren, wurden mit dem Ergebnis der koloniebildenden Einheit (KBE) an derselben Stichprobe verglichen. Die beiden Methoden lieferten konsistente Ergebnisse für die mit Schein- und Letaldosis (1 M H, 2O2) behandelten Proben. Bei der subletalen Dosis von 100 mM H2O2 schätzte SYTO 9/PI eine höhere Überlebensrate als die KBE, was einen wesentlichen Unterschied zwischen den beiden widerspiegelt, wobei das hier vorgestellte Protokoll das Überleben der Zellen unmittelbar nach dem Stress bewertet, während die KBE den Prozentsatz der Zellen quantifiziert, die in der Lage sind, sich zu erholen und zu vermehren. Daher misst dieses Protokoll die Lebensfähigkeit in einem früheren Stadium des Zelltodprozesses. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll eine schnelle und skalierbare Alternative zu KBE für die Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefe darstellt. Die Ergebnisse liefern ergänzende Informationen zur KBE, indem sie das Überleben in einem früheren Stadium bewerten und zwischen toten und geschädigten Zellen unterscheiden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der knospende Hefe-Unterstamm enthält viele wichtige biologische und biotechnologische Modelle. Eine häufige und kritische Aufgabe in der Hefeforschung ist die Quantifizierung der Auswirkungen genetischer oder umweltbedingter Störungen, zu denen auch Stress- oder medikamentöse Behandlungen gehören. Bei der industriellen Fermentation beispielsweise müssen die Erzeuger die Lebensfähigkeit der Hefekulturen überwachen, um die Effizienz und Qualität des Fermentationsprozesses zu gewährleisten 1,2. Bei der Untersuchung pathogener Hefearten ist die Messung ihres Überlebens nach Stress oder antimykotischer Behandlung von entscheidender Bedeutung, um die genetischen und mechanistischen Grundlagen für infektionsbezogene Merkmale wie die Antimykotikaresistenz zu verstehen. Die Messung des Überlebens an Kathetern und Oberflächen ist auch im klinischen Umfeld eine wichtige Aufgabe3. Diese unterschiedlichen Szenarien erfordern quantitative Ansätze, die das Ergebnis von Medikamenten- und Stressbehandlungen schnell und genau messen können.

Bestehende Methoden zur Erreichung des oben genannten Ziels lassen sich auf der Grundlage dessen, was sie messen, in drei Hauptkategorien einteilen. Die erste Kategorie misst die Klonogenität oder die Fähigkeit einzelner Hefezellen, nach dem Stress eine einzige Kolonie zu bilden. Die repräsentative Methode in dieser Kategorie ist der Colony Forming Unit (CFU)-Assay. Die zweite Kategorie misst die Vitalität, die auf dem Nachweis enzymatischer Aktivitäten in lebenden Zellen beruht. Beispiele hierfür sind chemische Sonden wie der FUN-1-Farbstoff4. Die dritte Kategorie von Methoden misst die Integrität der Plasmamembran - ein irreversibler Verlust der Integrität der Plasmamembran gilt als "Point of no Return" für den Zelltod5. Beispiele für diese Kategorie sind Fluoreszenzfarbstoffe wie Propidiumiodid (PI).

In dieser Arbeit wird ein optimierter LIVE/DEAD-Assay in Verbindung mit Durchflusszytometrie vorgestellt, um eine schnelle und skalierbare Quantifizierung des Überlebens von Hefen nach Stressbehandlung zu erreichen. Dieser auf Membranpermeabilität basierende Assay ist schneller als KBE und benötigt 15-30 Minuten Färbezeit im Vergleich zu 24-48 Stunden Inkubation für die Bildung von Kolonien. Auch Proben, die mit einem LIVE/DEAD-Farbstoff gefärbt wurden, können neben der Mikroskopie, die Zehntausende von Zellen in wenigen Sekunden misst und 96-Well-Proben problemlos für Hochdurchsatz-Assays verarbeiten kann, problemlos mit Durchflusszytometrie untersucht werden. Dadurch ist dieser Assay schnell, quantitativ und skalierbar. In diesem Protokoll wird ein Zweikomponenten-LIVE/DEAD-Fleck bestehend aus SYTO 9 und PI verwendet, um ein erhöhtes Auflösungsvermögen zu erreichen. SYTO 9 markiert alle Zellen, ob lebend oder tot, während PI nur in Zellen mit kompromittierten Plasmamembranen eindringt 6,7. Daher akkumulieren lebende Zellen nur SYTO 9, während tote Zellen sowohl SYTO 9 als auch PI akkumulieren. Da PI eine höhere Affinität als SYTO 9 zur Nukleinsäure hat, schließt es letztere in der Zelle8 kompetitiv aus. Außerdem bilden die beiden Farbstoffe ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer-Paar (FRET), bei dem die SYTO 9-Emission von PI als Anregung absorbiert wird. Infolgedessen weisen abgestorbene Zellen eine gedämpfte grüne und eine stark rote Fluoreszenz auf. Im Gegensatz dazu zeigen lebende Zellen eine hellgrüne Fluoreszenz8. Dieser Unterschied ermöglicht eine bessere Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen bei Schwankungen der Fluoreszenzintensität innerhalb jeder Gruppe.

Seit einem ersten Bericht über seine Anwendung bei Hefe im Jahr 2004 ist die Verwendung von SYTO 9/PI in Hefestudien lückenhaft und weitgehend auf qualitative Auswertungen mit Hilfe der Mikroskopie 7,9,10,11,12,13,14,15 beschränkt. Eine wesentliche Einschränkung bei der Einführung als quantitativer Assay für das Überleben von Hefen ist das Fehlen einer systematischen Charakterisierung und eines Vergleichs mit weit verbreiteten Methoden wie der KBE. Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Assay, der den Färbepuffer, die Farbstoffkonzentration, die Färbezeit und die Durchflusszytometrie-Einstellungen umfasst, von denen festgestellt wurde, dass sie Artefakte minimieren und reproduzierbare Ergebnisse liefern, wenn sie auf C. glabrata und zwei weitere Hefeartenangewendet werden 16. Da die SYTO 9/PI-Färbung eine intermediäre "geschädigte" Zellpopulation aufdeckt, die sich in ihrem Färbemuster sowohl von den lebenden als auch von den toten Zellen unterscheidet, kann sie die KBE ergänzen, indem sie nuanciertere Informationen über die Auswirkungen der Stressbehandlung auf Hefezellen liefert, was möglicherweise neue Anwendungen ermöglicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Anwendung von Wasserstoffperoxid-Stress

  1. Mindestens einen Tag vor dem Experiment wird eine Übernachtkultur von C. glabrata aus einer einzelnen Kolonie auf einer frisch gestreiften Platte in 3 ml synthetisches vollständiges (SC) Medium (1,7 g/l Hefestickstoffbase, vollständige Aminosäuremischung, 2 % w/v Glukose, Wasser) innokuliert und kultiviert, indem das Glasröhrchen in eine Rolltrommel gelegt und bei 30 °C angebaut wird. Alternativ kann ein Orbitalschüttler verwendet werden, indem das Glasrohr in einem schrägen Winkel platziert und die Kultur mit 200 U/min geschüttelt wird.
    1. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte (OD600) der Übernachtkultur und verdünnen Sie sie mit frischem SC-Medium auf OD600 ~0,2 in einem Gesamtvolumen von 10 ml. Lassen Sie es zwei Verdopplungen lang wachsen, was etwa 4 Stunden dauert, um die mittlere logarithmus (OD600 ~1) Phase zu erreichen.
      BEISPIEL: Wenn eine Übernachtkultur einen OD600 = 10 hat, fügen Sie 200 μl dieser Kultur zu einem 9,8 mL SC-Medium hinzu.
  2. Bereiten Sie innerhalb von 30 Minuten vor der Stressbehandlung das Wasserstoffperoxid-Stressmedium vor. Verdünnen Sie Wasserstoffperoxid aus dem 30%-Stamm (9,798 M) seriell in synthetische Komplettmedien (SC) auf die gewünschte Konzentration. Umfassen Sie eine Scheinbehandlung (SC ohne Zusatz von Wasserstoffperoxid) und eine letale Dosis (1 M ist für C. glabrata geeignet).
    BEISPIEL: Um ein 100 mM Wasserstoffperoxid-Stressmedium herzustellen, fügen Sie 10,3 μl des 9,798 M Wasserstoffperoxid-Stoffes zu 1 mL SC hinzu. Um ein 10 mM Wasserstoffperoxid-Stressmedium herzustellen, verdünnen Sie 500 μl des 100 mM Wasserstoffperoxid-Stressmediums in 4,5 mL SC.
  3. Messen Sie den OD600 der Mid-Log-Kultur und standardisieren Sie ihn durch Zugabe von SC-Medien auf z. B. OD600 = 1.
    BEISPIEL: Die Mid-Log-Kultur liegt bei OD600 = 1,2. Fügen Sie 0,2 mL SC-Medien pro 1 mL Kultur hinzu.
  4. Übertragen Sie 600 μl Mid-Log-Kultur pro Testbedingung in eine 96-Deep-Well-Platte. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Der Überstand wird vorsichtig durch Aspiration entfernt, ohne das Küvettenpellet zu stören.
  5. Geben Sie 600 μl Schein- oder Wasserstoffperoxid-Stressmedien, das in Schritt 1.2 hergestellt wurde, in jede Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellen wieder zu resuspendieren.
  6. Die Platte 120 min bei 30 °C inkubieren und bei 300 U/min schütteln.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der biologischen Fragestellung ab, die von Interesse ist.

2. Auftragen der SYTO 9/PI Beize

  1. Bereiten Sie vor dem Experiment mindestens 10 ml sterilen 0,85%igen Kochsalzpuffer vor.
    HINWEIS: Wir fanden 0,85 % Kochsalzpuffer, um im Vergleich zu deionisiertem Wasser oder Wachstumsmedien minimale Färbeartefakte zu erzeugen, d. h. ungefärbte und totähnliche Zellen in simuliert behandelten Proben16.
  2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von PI bei 0,2 mM unter Verwendung von sterilem, entionisiertem Wasser vor.
    HINWEIS: Dieser PI-Vorrat kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
  3. Unmittelbar vor dem Experiment ist eine SYTO 9-Stammlösung bei 33,4 μM mit sterilem, entionisiertem Wasser herzustellen.
    HINWEIS: Bereiten Sie das Arbeitsmaterial des SYTO 9 für jedes Experiment frisch vor. Nicht lagern und wiederverwenden.
  4. Pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellen in jeder Vertiefung von der Behandlungsplatte zu mischen. Messen Sie OD600 jeder Behandlungsbedingung und berechnen Sie die Menge an Puffer, die zur Resuspendierung der Zellen benötigt wird, auf einen OD600 von 1.
    HINWEIS: Mehrkanalpipetten können für ein effizientes und gleichmäßiges Mischen verwendet werden. Vermeiden Sie ein Übermischen der Proben.
  5. Sammeln Sie Hefezellen nach der Schein- oder Stressbehandlung durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min. Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernen. Die Zellen werden in sterilem 0,85%igem Kochsalzpuffer auf OD600 = 1 resuspendiert (berechnet in Schritt 2.4).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zellen wieder zu suspendieren. Gehen Sie vorsichtig mit allen Kulturen nach der Behandlung um und vermeiden Sie eine Übermischung.
  6. Reservieren Sie 50 μl jeder Probe als Kontrollen für ungefärbte und Einzelfarbstoff-Färbevorgänge.
    HINWEIS: Für Wildtyp-C. glabrata wurde in beiden Kanälen für SYTO 9 und PI eine minimale Autofluoreszenz festgestellt. Überprüfen Sie jedoch immer ungefärbte Proben auf Autofluoreszenz und führen Sie eine ordnungsgemäße Hintergrundsubtraktion durch oder verwenden Sie Wachstumsmedien mit geringer Autofluoreszenz.
  7. Aliquot 16 μl der Nachbehandlungsprobe, resuspendiert in 0,85 % Kochsalzpuffer in ein 50 μl PCR-Röhrchen. Geben Sie 2 μl des 0,2 mM Arbeitsstocks PI in die Zellsuspension. Geben Sie dann 2 μl des 33,4 μM Arbeitsmaterials von SYTO 9 in dasselbe Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 20 μl.
    1. Die Endkonzentrationen von PI und SYTO 9 betragen 20 μM bzw. 3,34 μM. Zum Mischen vorsichtig pipettieren und 30 Minuten im Dunkeln (eine Blackbox kann verwendet werden) bei Raumtemperatur inkubieren.

3. Einrichten und Kalibrieren des Durchflusszytometers

HINWEIS: Dies sollte bei jedem neuen Instrument und auch bei neuen Anwendungen der SYTO 9/PI-Färbung erfolgen, einschließlich für eine andere Spezies/einen anderen Stamm, einen neuen Stressor oder ein neues Wachstumsprotokoll usw. Die folgenden Einstellungen wurden auf einem Attune NxT Durchflusszytometer entwickelt. Spezifische Anweisungen finden Sie in der Bedienungsanleitung des verwendeten Geräts.

  1. Wählen Sie die richtigen Fluoreszenzkanäle/-filter für das Durchflusszytometer: Ein 530 nm ± 30 nm Bandpassfilter (BL1) und ein 600 nm Langpassfilter (> 600 nm, BL3) wurden verwendet, um Signale in den grünen (SYTO 9) und roten (PI und SYTO 9) Kanälen zu sammeln. Beide wurden mit einem 488 nm blauen Laser angeregt.
  2. Stellen Sie die Durchflussrate auf 200 μL/min ein und stoppen Sie, wenn mindestens 30.000 Ereignisse erfasst wurden.
    HINWEIS: Die Anzahl der Ereignisse pro Stichprobe kann angepasst werden, um robuste Schätzungen der Prozentsätze zu erreichen. Stichproben mit zu wenigen Ereignissen (Zellen) sollten ausgeschlossen werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Spannungen auf den FSC- und SSC-Kanälen während der Ersteinrichtung anzupassen.
  3. Verdünnen Sie 16 μl mock-behandelte, ungefärbte Probe in 200 μl sterilen 0,85%igen Kochsalzpuffer. Unmittelbar vor der Durchflusszytometrie vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Führen Sie dieses Beispiel aus, und passen Sie die Spannungen der FSC- und SSC-Kanäle so an, dass die Grundgesamtheit im Zentrum des FSC vs. SSC-Dichtediagramm.
    HINWEIS: Für den FSC bzw. den SSC wurde eine Spannung von 345 mV bzw. 399 mV verwendet. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Spannungen auf den Sammelkanälen (BL1 und BL3) während der Ersteinrichtung anzupassen.
  4. Mischen Sie 24 μl mock behandelte Probe mit 24 μl 1000 mM wasserstoffperoxidbehandelter oder hitzeabgetöteter Probe.
  5. Die gemischte lebende und tote Zellprobe wird in drei Röhrchen à 16 μl aufgeteilt. Färben Sie die drei Röhrchen mit (1) 2 μl SYTO 9 und 2 μl Wasser für 30 min; (2) 2 μl PI und 2 μl Wasser für 30 min; (3) 2 μL SYTO 9 und 2 μL PI für 30 min. Befolgen Sie das Färbeprotokoll aus dem vorherigen Abschnitt.
    1. Nach der Inkubation geben Sie 200 μl sterilen 0,85%igen Kochsalzpuffer in jedes Röhrchen. Sie sind nun bereit für die Durchflusszytometrie.
  6. Führen Sie die Röhre (1) aus, um die Spannung des grünen Fluoreszenzkanals (BL1) einzustellen; Führen Sie dann die Röhre (2) aus, um die Spannung der roten Fluoreszenz (BL3) einzustellen. Das Ziel ist es, den Modus der Intensitätsverteilung jedes Kanals auf ~104-10 5 zu setzen, um den vollen Dynamikbereich des Instruments zu nutzen.
    HINWEIS: Bitte befolgen Sie bei der Einstellung der Spannungen die Anweisungen Ihres spezifischen Durchflusszytometers. Einige Durchflusszytometer haben feste Spannungen, und dieser Schritt entfällt.
  7. Führen Sie das Rohr (3) aus, um zu überprüfen, ob lebende und tote Zellpopulationen gut voneinander getrennt sind. Passen Sie bei Bedarf die Kanalspannungen des BL1- oder BL3-Kanals an.
    HINWEIS: Sowohl für den BL1- als auch für den BL3-Kanal des Attune NxT wurde eine Spannung von 200 mV verwendet.
  8. Lassen Sie die mock-behandelte, ungefärbte Probe unter den festgelegten Spannungseinstellungen laufen, um sicherzustellen, dass die Probe eine minimale Autofluoreszenz in den interessierenden Kanälen aufweist (<102).

4. Durchführen von Proben auf dem Durchflusszytometer

  1. Wenden Sie die oben festgelegten Einstellungen des Durchflusszytometers an und führen Sie zuerst die ungefärbte Probe durch, um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenzsignale sowohl in den BL1- als auch in den BL3-Kanälen unter 102 liegen.
  2. Geben Sie 200 μl 0,85 % Kochsalzpuffer zu jeder gefärbten Probe und lassen Sie sie auf dem Durchflusszytometer laufen.
    HINWEIS: Wenn mehrere Proben untersucht werden, staffeln Sie den Färbeschritt so, dass jede Probe 30 Minuten lang gefärbt wird, bevor sie auf dem Durchflusszytometer ausgeführt wird.
  3. Exportieren Sie die Ausgabe der Durchflusszytometrie als .fcs-Dateien (FCS 3.0 oder 3.1 Standard).

5. Datenanalyse in R

HINWEIS: Ein Beispielanalyseskript wird als Zusatzdatei 1 bereitgestellt. Beispiele für Gating-Strategien finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.

  1. Installieren und laden Sie die erforderlichen Pakete: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importieren Sie FCS-Dateien in die aktuelle R-Umgebung.
  3. Passen Sie die Dateinamen an und legen Sie die Behandlungsbedingungen fest.
  4. Erstellen Sie ein 2D-Dichtediagramm für alle Ereignisse auf FSC. H gegen SSC.H. Verwenden Sie ein Polygon-Gate, um Nicht-Zellen-Ereignisse auszuschließen. Nennen Sie dieses Tor "Zellen".
    HINWEIS: Bei bestimmten Durchflusszytometern wird der Parameter Fläche anstelle der Höhe empfohlen. Überprüfen Sie die gerätespezifischen Empfehlungen.
  5. Erstellen Sie für die geschlossene Population der "Zellen" ein 2D-Dichtediagramm auf FSC. H im Vergleich zu FSC.W. In der Regel sind zwei Cluster mit ähnlichen FSC-Bereichen sichtbar. H, aber anders FSC.W. Der Cluster mit einem niedrigeren mittleren FSC. Die W-Ebene enthält die einzelnen Zellen ("Singuletts"). Zeichnen Sie ein Polygon-Tor, um sie auszuwählen, und nennen Sie das Tor "Singuletts".
  6. Erstellen Sie für die "Singuletts"-Gated Population ein 2D-Dichtediagramm auf BL1. H gegen BL3.H. Zeichnen Sie Polygon-Gates für lebende, beschädigte und tote Populationen basierend auf Kontrollen für lebende und tote Zellen. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
  7. Bestimmen Sie das Überleben anhand der Prozentsätze der einzelnen Populationen und exportieren Sie die Statistiken.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die SYTO 9/PI-Färbung unterscheidet lebende Hefezellen von toten Zellen anhand ihrer Fluoreszenzsignale im grünen (500 nm-560 nm) und roten (>600 nm) Kanal. Lebende Zellen, die nur SYTO 9 akkumulieren, fluoreszieren stark im grünen Kanal, mit minimalen roten Signalen. Tote Zellen akkumulieren sowohl SYTO 9 als auch PI und es wird erwartet, dass sie stark im roten Kanal fluoreszieren, mit geringeren grünen Fluoreszenzsignalen im Vergleich zu lebenden Zelle...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen LIVE/DEAD-Assay unter Verwendung von zwei Fluoreszenzfarbstoffen, SYTO 9 und PI, und die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Überlebens nach Stress in Hefe. Obwohl diese beiden Färbungen in der Literatur zur Beurteilung des Überlebens bei verschiedenen Hefearten angewendet wurden und als kommerzielles Kit erhältlich sind, enthalten weder das Herstellerhandbuch noch die Literatur ausreichende Details zum Färbeprotokoll oder zu den ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir bedanken uns bei Dr. Michael Dailey und dem Carver Center for Imaging für die Ausbildung und Unterstützung der Mikroskopie. Wir möchten uns bei ehemaligen und aktuellen Mitgliedern des Gene Regulatory Lab für ihr unschätzbares Feedback zum Protokoll bedanken.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Bohrloch-TiefbrunnenplatteThermo Fisher278606NUNC 96
Attune NxT Durchflusszytometer mit PlattenleserThermo Fisher A24858A24858Autosampler (A42901)
Candida glabrataCG99, Laborstamm, abgeleitet aus klinischem Isolat (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Hefe-LEBEN/TOT-KitThermo Fisher A24858L34952Enthält SYTO 9 (3,34 mM) und Propidiumiodid (20 mM). Diese beiden Komponenten können auch separat bei verschiedenen Anbietern erworben werden.
WasserstoffperoxidSigma AldrichH1009
Leica Konfokales SP8-MikroskopLeicaTCS SP8 X
NatriumchloridSigma AldrichS9888Verwendet zur Herstellung sterilisierter 0,85%-NaCl-Lösung
Hefe-Stickstoffbasis ohne AminosäurenSigma AldrichY0626wurde verwendet, um das synthetische Komplettmedium mit einer Mischung von 2 % Glukose und Aminosäuren herzustellen

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Yeast SurvivalPlasma Membrane IntegrityCandida GlabrataHydrogen Peroxide StressSYTO 9 StainingPropidium IodideColony Forming Unit

Verwandte Artikel