Diese Studie optimiert ein auf heißem Phenol basierendes Verfahren zur RNA-Extraktion aus Mycobacterium, das hochwertige RNA liefert, die für transkriptomische Analysen geeignet ist. Im Vergleich mit TRIzol und RNeasy unter identischen Bedingungen erbrachte die Methode eine höhere Ausbeute, eine vergleichbare Integrität und eine verbesserte Kosten-Effizienz und bietet somit eine praktische Alternative für groß angelegte Genexpressionsstudien.
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Methodenartikel
Optimierte RNA-Extraktion auf Basis von heißem Phenol aus Mykobakterien: Ein robuster Ansatz für eine zuverlässige Genexpressionsanalyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) bleibt eine bedeutende globale Gesundheitsbedrohung, was die Notwendigkeit zuverlässiger transkriptomischer Studien unterstreicht, um seine Biologie und Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu verstehen. Solche Analysen hängen davon ab, RNA von hoher Qualität und Ausbeute zu gewinnen. Obwohl mehrere Methoden zur RNA-Extraktion verfügbar sind, erfordern viele teure Reagenzien, große Kulturvolumina oder spezielle Geräte, was ihre Eignung für groß angelegte Studien, insbesondere in ressourcenarmen Umgebungen, einschränkt. Hier wird eine optimierte, auf heißem Phenol basierende Methode zur RNA-Extraktion vorgestellt, die speziell auf Mykobakterien zugeschnitten ist. Die Methode verwendet minimale Kulturvolumina und allgemein verfügbare Reagenzien, um konsistent hochwertige RNA zu liefern, die für hochdurchsatzfähige transkriptomische Anwendungen geeignet ist. Menge und Integrität der RNA wurden mittels Gelelektrophorese und RNA-Integritätsanalyse (RIN) bewertet, und ihre Eignung für nachgeschaltete Anwendungen wurde durch qPCR und Qubit 4 bestätigt. Um die Leistung der optimierten Methode zu bewerten, wurde eine parallele RNA-Extraktion unter identischen experimentellen Bedingungen – einschließlich derselben Mycobacterium-Arten, Kulturvolumina, Wachstumsphasen (logarithmisch und stationär) und Lysierungsbedingungen – mit TRIzol und RNeasy durchgeführt. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich hinsichtlich Ausbeute, Qualität, Durchführbarkeit und Kosten. Die optimierte Heiß-Phenol-Methode zeigte eine vergleichbare oder verbesserte RNA-Ausbeute und -qualität, während die Reagenzienkosten und die Abhängigkeit von Spezialgeräten deutlich reduziert wurden. Aufgrund ihrer Effizienz, Reproduzierbarkeit und Kostengünstigkeit bietet diese Anleitung eine praktikable Alternative für groß angelegte Genexpressions- und transkriptomische Studien an Mtb und anderen mykobakteriellen Arten.
Einleitung
M. tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), bleibt die häufigste Todesursache durch einen einzelnen infektiösen Erreger und übertrifft damit HIV/AIDS. Im Jahr 2024 waren weltweit etwa 1,3 Millionen Todesfälle auf TB zurückzuführen1. Diese Belastung wird durch die zunehmende Verbreitung multiresistenter (MDR) und extrem resistenter (XDR) Stämme verschärft. Daher besteht dringender Bedarf darin, die molekularen Grundlagen der TB-Pathogenese zu verstehen und neue therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren2.
Die transkriptionelle Profilierung von Mtb ist zu einem wichtigen Werkzeug zur Aufklärung funktioneller Elemente geworden, die an Wirt-Pathogen-Interaktionen3, der Anpassung an Umweltstress4 und den Mechanismen der Arzneimittelresistenz5 beteiligt sind. Fortschrittliche Methoden wie Echtzeit-PCR, Mikroarrays und RNA-Sequenzierung (RNA-seq) haben die Fähigkeit zur Analyse des mykobakteriellen Transkriptoms erheblich verbessert6. Der Erfolg dieser Methoden hängt jedoch stark von der Verfügbarkeit hochwertiger RNA ab, was wiederum von einer effizienten Zelllyse während der Extraktion abhängt. Die komplexe Mycolyl–Arabinogalactan–Peptidoglycan-Zellwand von Mtb macht die RNA-Extraktion besonders schwierig7. Bestehende Lysismethoden wie enzymatische Hydrolyse8, Beschallung9 und Kugelmahlung10 erfordern oft kostspielige Geräte und große Kulturvolumina, was ihre Anwendbarkeit in vielen BSL-3-Laboren einschränkt. Zudem erfordert das langsame Wachstum von Mtb verlängerte Kultivierungszeiten, um ausreichende Biomasse zu erhalten11.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde eine optimierte, schnelle und kostengünstige RNA-Extraktionsmethode auf Basis von heißem Phenol entwickelt. Aus lediglich 3 mL einer Kultur in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase ergibt die Methode 45–60 µg hochwertige RNA, die für nachgeschaltete transkriptomische Analysen geeignet ist. Die Zelllyse wird mithilfe eines kompakten, handgehaltenen Gewebemühlers und leicht verfügbaren Reagenzien erreicht, wodurch der Bedarf an teuren Geräten entfällt. Obwohl die Heiß-Phenol-Methode bereits früher beschrieben wurde11,12, verbessert die optimierte Heiß-Phenol-Methode die Handhabung, Kosteneffizienz und die RNA-Ausbeute. Die Optimierung erfolgte unter Verwendung von M. smegmatis mc2155 (Msmeg) und wurde erfolgreich mit Mtb H37Rv validiert.
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Protokoll
Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
1. Kultivierung von Mycobacterium
- Inokulieren Sie 1 mL aus dem Glycerin-Bestand von Msmeg oder Mtb in 10 mL Middlebrook 7H9-Medium, das mit 0,2 % Glycerin, 0,05 % Tween 80 und 10 % ADC ergänzt wurde, bei 37 °C unter Schütteln mit 150 U/min, bis die OD 1–1,5 erreicht.
- Züchten Sie die Sekundärkultur, indem Sie 1 % der Primärkultur in 10 mL 7H9-Medium geben, bis die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht ist (OD600nm = 0,6–0,7).
- Teilen Sie die Kultur in 3-mL-Aliquote auf und zentrifugieren Sie sie bei 2000 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (23–25 °C).
- Lagern Sie die Pellets bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion.
ACHTUNG: Bei Mtb-Kulturen sind die entsprechenden BSL3-Richtlinien einzuhalten; inaktivieren Sie die Pellets durch Erhitzen auf 95 °C für 20–25 Minuten.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt das Flussdiagramm der grundlegenden Schritte, die bei der RNA-Extraktion nach der Hot-Phenol-Methode befolgt werden.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Hot-Phenol-Methode und der Analyse. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.
2. RNA-Extraktion
- Heiß-Phenol-Methode (HP-Methode)
- Fügen Sie 200 µL TES-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1 % β-Mercaptoethanol) zum Zellpellet hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Vortexen.
- Fügen Sie etwa 0,1 g 0,1 mm große Silikabeads zur Probe hinzu. Verwenden Sie einen handgeführten Gewebemörser für 10–15 s, bis das Pellet vollständig auf Eis aufgetaut ist. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, jeweils gefolgt von einer schnellen Einfrierung in flüssigem Stickstoff.
- ODER verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Tischtop-Bead-Ruptor für 1 Minute bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 5 (5,0 m/s) bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und inkubieren Sie die Probe nach jedem Zyklus auf Eis, um eine Erwärmung zu verhindern.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Mtb-Zelllyse für 6–8 Zyklen (jeweils 1 Minute) entweder mit einem handgeführten Gewebemörser oder einem Bead-Ruptor und kühlen Sie die Probe zwischen den Zyklen intermittierend auf Eis ab. Verwenden Sie für die Zubereitung aller Puffer und Reagenzien, die für die RNA-Extraktion benötigt werden, mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltes Wasser. - Fügen Sie jeder Probe zusätzlich 200 µL TES-Puffer (vorher auf 65 °C vorgewärmt) hinzu, um das Gesamtvolumen auf 400 µL aufzufüllen. Geben Sie jeweils 200 µL sauren Phenol (Phenol, equilibriert mit 100 mM Citratpuffer, pH 4,5) und 200 µL Chloroform hinzu (mischen Sie sauren Phenol und Chloroform im Verhältnis 1:1, bevor Sie es zur Probe hinzufügen).
- Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten bei 65 °C in einem Heizblock unter Schütteln bei 900 U/min und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Stellen Sie nach der Zentrifugation eine klare Phasentrennung sicher (eine klare obere wässrige Phase mit RNA, eine deutliche Interphase mit DNA sowie eine untere organische Phase mit Proteinen und Lipiden sollten sichtbar sein).
- Entfernen Sie die obere wässrige Phase und überführen Sie sie in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie erneut ein gleiches Volumen an saurem Phenol:Chloroform hinzu. Zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Stellen Sie eine klare Phasentrennung sicher.
- Überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 30 µL 3 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3, und 240 µL gekühltes Isopropanol hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten bis 1 Stunde bei −80 °C.
HINWEIS: Das Mikrozentrifugenröhrchen kann an dieser Stelle über Nacht bei −80 °C gelagert werden. Versiegeln Sie das Röhrchen mit mehreren Schichten Parafilm, um ein Öffnen während der Inkubation bei 65 °C zu verhindern.
ACHTUNG: Phenol und Chloroform sind gefährliche Chemikalien; daher sind geeignete persönliche Schutzausrüstungen (PSA), technische Schutzmaßnahmen wie Abzüge und spezifische Entsorgungsverfahren einzuhalten. - Zentrifugieren Sie 1 Stunde bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Bildung eines Pellets sicher und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL 75 %igem Ethanol und zentrifugieren Sie 1 Minute bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Führen Sie diesen Schritt zweimal durch und trocknen Sie das Pellet lufttrocken.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 50 µL nukleasefreiem Wasser.
HINWEIS: Um die RNA aufzulösen, inkubieren Sie sie 10–30 Minuten bei Raumtemperatur in RNase-freiem Wasser.
- TRIzol-Methode
- Fügen Sie 200 µL TRIzol-Reagenz zum Zellpellet hinzu.
ACHTUNG: TRIzol ist eine gefährliche Chemikalie; daher sind geeignete persönliche Schutzausrüstungen (PSA), technische Schutzmaßnahmen wie Abzüge und spezifische Entsorgungsverfahren einzuhalten. - Befolgen Sie die Zelllysemethode gemäß den Schritten 2.1.2–2.1.3.
- Fügen Sie weitere 200 µL TRIzol-Reagenz hinzu, gefolgt von 200 µL Chloroform, und vortexen Sie 1 Minute. Zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 13.400 x g bei 4 °C. Stellen Sie nach der Zentrifugation eine klare Phasentrennung sicher.
- Überführen Sie vorsichtig die wässrige Phase in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fällen Sie die RNA aus, indem Sie 500 µL Isopropanol zur wässrigen Phase hinzufügen und 30 Minuten bis 1 Stunde bei −80 °C inkubieren.
- Legen Sie die RNA durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C als Pellet ab. Beobachten Sie das Pellet sorgfältig und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL 75 %igem Ethanol und zentrifugieren Sie 1 Minute bei 13.400 x g bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, trocknen Sie das Pellet 30 Minuten bei Raumtemperatur lufttrocken und resuspendieren Sie es in 50 µL nukleasefreiem Wasser.
- Fügen Sie 200 µL TRIzol-Reagenz zum Zellpellet hinzu.
- Methode mit kommerziell erhältlichem RNA-Extraktionskit
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 µL Resuspendierpuffer (im Kit enthalten).
- Befolgen Sie die Zelllysemethode gemäß den Schritten 2.1.2–2.1.3.
- Führen Sie das anschließende Experiment gemäß den Herstelleranweisungen durch.
3. DNase-Behandlung, Quantifizierung und Visualisierung
- Um genomische DNA-Kontamination zu entfernen, 1 µL DNase I (10 units) und 5 µL RDD-Puffer (1x) zu jeder RNA-Probe hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die RNA-Probe spektrophotometrisch mit Nanodrop quantifizieren und die RNA-Integrität mit einem Qubit4 bestimmen. Akzeptabler RIN-Wert liegt zwischen 7,5 und 10. Akzeptable Werte für A260/A280 und A260/A230 liegen im Bereich von 1,8–2,0 bzw. 2,0–2,2.
- RNA auf 1% Agarosegel unter Verwendung von 1X RNA-Ladefarbstoff sichtbar machen.
4. cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR
- Richten Sie eine 20 µL-Reaktion zur cDNA-Präparation mit dem cDNA Reverse Transcription Kit und 1 µg RNA gemäß den Herstelleranweisungen in einem Thermocycler ein.
- Richten Sie eine 10 µL Echtzeit-PCR-Reaktion mit 50 ng cDNA, jeweils 0,4 µM Primer und SYBR gemäß den Herstelleranweisungen ein. Führen Sie die Probe auf dem Echtzeit-PCR-Thermocycler durch.
HINWEIS: Für die qPCR-Analyse wurden die folgenden Primer verwendet:
Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'
5. Statistische Analyse
- Führen Sie den Student’schen t-Test mit allen biologischen Wiederholungen mithilfe von Graph Pad Prism durch; ein P-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler aus mindestens drei biologischen Wiederholungen dar.
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Ergebnisse
RNA-Qualität und -Ausbeute
Die Qualität und Menge der RNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bewertet (Abbildung 2). Für alle Extraktionsmethoden waren deutliche, scharfe Banden entsprechend der 23S- und 16S-rRNA zu beobachten, was eine erfolgreiche Isolierung der Gesamt-RNA bestätigt. Die Hot-Phenol- und die TRIzol-Methode zeigten jeweils drei klare Banden, die der 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) und 5S-rRNA (~120 bp) entspre...
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Diskussion
Um eine einfache und robuste RNA-Extraktionsmethode für Mycobacterium zu entwickeln, wurde die Hot-Phenol-Methode optimiert. Anschließend wurde die extrahierte RNA mit zwei weit verbreiteten Methoden verglichen: TRIzol und eine Säulen-basierte Kit-Methode12,13. Diese Techniken wurden hinsichtlich RNA-Ausbeute, Reinheit, Integrität, Kosten und Verarbeitungsdauer verglichen, um ihre Eignung für nachgeschaltete molekularbiologische Anwendungen zu bewerten. ...
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Offenlegungen
Es bestanden keine Interessenkonflikte zwischen den Autoren. Alle Autoren haben die Einreichung genehmigt.
Danksagungen
Ich möchte die Unterstützung durch das Department of Biotechnology (DBT), den Indian Council of Medical Research (ICMR) und den Science and Engineering Research Board (SERB) anerkennen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,1 mm Silikabeads | MP Biomedicals | MP116911050 | |
| 2-Propanol | Sigma | 278475 | |
| Bead Ruptor 4 | revvity | ||
| Chloroform | Sigma | 288306 | |
| Kaltzentrifuge | ThermoScientific | 42541217 | |
| DNase I | qiagen | 79254 | |
| EDTA | sigma | E02SS | |
| HCl | SRL | 62889 | |
| Heizblock | MIULAB | MU-E02-1049 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | 4368814 | |
| Motorbetriebener Gewebemörser G10 | Coron | G22616008 | |
| NaCl | sigma | S5886 | |
| Nanophotometer N50 | IMPLEM | T51601 | |
| Phenol, äquilibriert mit 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5 | Sigma | P4682 | |
| PowerUP SYBR | Applied Biosystems | A25742 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | 2.32262E+12 | |
| Echtzeit-PCR-Thermocycler | Analytik Jena AG | 844-00503-2 | |
| RNA easy Kit | Qiagen | 74104 | |
| SDS | Sigma | S9888 | |
| Natriumacetat | Sigma | S2889 | |
| Thermocycler | Biorad | 621BR29739 | |
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | |
| Tris-Basis | Himedia | MB029 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 516732 |
Referenzen
- Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
- Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
- Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
- Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
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- Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
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- Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
