Experimentelle Studie zur Reduzierung der Aktivität des NF-κB-Signalwegs durch Muscone durch gezieltes Targeting von IL-1R1 zur Abschwächung oxidativer Stressschäden in Schwann-Zellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird die Wirkung von Muscone, dem Hauptbestandteil von Moschus, auf die Proliferation und Apoptose von Schwann-Zellen untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen zunächst den potenziellen Mechanismus, dass Moschus die Aktivität des NF-κB-Signalwegs reduziert, indem IL-1R1 gehemmt wird, um die oxidative Stressschädigung bei Morbus Bell-Lähmung abzuschwächen.

Zusammenfassung

Der zugrunde liegende Mechanismus, wie natürlicher Moschus die Bell-Lähmung behandelt, ist nicht klar. Diese Studie zielt darauf ab, den potenziellen Mechanismus von Moschus bei der Behandlung von peripheren Nervenverletzungen in vitro aufzudecken. Um dies zu erreichen, wurde ein Modell für oxidative Stressschädigung in Schwann-Zellen (SCs) unter Verwendung von Kobaltchlorid (CoCl₂) etabliert. Um die schützende Wirkung von Muscone (Mus) auf diese Verletzung zu bewerten und seinen Mechanismus zu erforschen, wurden Zellviabilitätsassays, siRNA-Transfektion, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), Western Blotting, Immunfluoreszenzfärbung und Ultrastrukturanalyse von Zellen eingesetzt. Als Ergebnis wird darauf hingewiesen, dass die Mus-Intervention die SC-Proliferation und die S-100b-mRNA unter Hypoxie erhöhte, während sie gleichzeitig die reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) reduzierte und die Superoxiddismutase (SOD)-Spiegel erhöhte. Mus verbesserte oxidativen Stress und Entzündungen bei hypoxischen SCs durch Reduktion von IL-1β und TNF-α. Darüber hinaus modulierte Mus Schlüsselindikatoren, die am Sauerstoffstoffwechsel, der Zellreparatur und dem Neurometabolismus beteiligt sind, einschließlich C-JUN und GDNF. IL-1R1, lokalisiert an der SC-Membran, wurde durch Hypoxie hochreguliert, aber nach Mus-Intervention signifikant herunterreguliert. Mus hemmte auch die Expression von Komponenten des NF-κB-Signalwegs (IRAK1, IKK, p65, p50) und erhöhte die IκB-α. Entscheidend ist, dass die Abschaffung der IL-1R1-Expression durch siRNA-Knockdown einen konsistenten Effekt bei Mus zeigte. Es wird geschlussfolgert, dass Mus durch die Unterdrückung von IL-1R1 die Entzündung bei hypoxischen SCs durch Hemmung des NF-κB-Signalwegs abschwächte. Diese Studie zeigte die Rolle von IL-1R1 bei der Hypoxie-induzierten SC-Dysfunktion. Darüber hinaus könnte Mus ein potenziell wirksames Medikament zur Behandlung der Bell-Lähmung sein.

Einleitung

Muscone (Mus), 3-Methylcyclopentadecanon, wurde bereits 1906 aus dem natürlichen Extrakt des Hirschmoschus isoliert¹. Moschus, eine wertvolle und wirksame traditionelle chinesische Medizin (TCM), hat umfangreiche heilende Wirkungen wie Abschwellungen, entzündungshemmende Wirkungen, Wiederbelebung und Förderung der Durchblutung². Moschushaltige TCM wurde bei einer Vielzahl von Volkskrankheiten eingesetzt, darunter Erkrankungen des Zentralnervensystems³, Entgiftung⁴, Magen-Darm-Tumoren⁵, Virushepatitis⁶ und koronare Herzkrankheit⁷ usw. Als pharmazeutischer Wirkstoff von Moschus hat Mus hervorragende biologische Wirkungen gezeigt, darunter entzündungshemmend⁸, antioxidativ ^8,9, reparatur neuronaler Schäden und Myokardinfarkt^{lindernd 10} usw. Mechanistisch haben Studien gezeigt, dass Mus die Freisetzung von Entzündungszytokinen wie Interleukin (IL)-1β, IL-6, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, reaktive Sauerstoffspezies (ROS)^1,8 reduzieren und die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), den Kernfaktor Kappa-Leichtketten-Enhancer aktivierter B-Zellen (NF-κB), AKT/mechanistisches Ziel von Rapamycin (mTOR) und den CaN/Erk1/2-Signalweg¹ regulieren kann^{. 8, 11} usw.

In China wurde berichtet, dass einige Ärzte die Bell-Lähmung erfolgreich mit natürlichem Moschus behandelt haben, wie aus früheren Literaturaufzeichnungen und klinischen Erfahrungen hervorgeht 12,13,14,15. Mus ist kein empfohlenes Medikament in den Diagnose- und Behandlungsrichtlinien, aber in unterentwickelten medizinischen Bereichen oder für einige Menschen, die keine Steroide oder antiviralen Medikamente verwenden können, kann Mus eine weitere bevorzugte Option sein. Die Literaturanalyse der letzten Jahre zeigt zudem, dass Moschus in den veröffentlichten Pflasterverordnungen der chinesischen Medizin und Akupunkturpunktstudien zur Behandlung der peripheren Fazialisparese das am häufigsten verwendete chinesische Arzneimittel ist¹⁶. Obwohl es viele pharmakologische und medizinische Studien zu Mus gibt, ist noch unbekannt, wie Moschus die Bell-Lähmung genau geheilt hat und welche neurochemischen und zellbiologischen Mechanismen zugrunde liegen.

Die Bell-Lähmung, eine akute idiopathische Gesichtslähmung, resultiert aus einer Funktionsstörung des peripheren Gesichtsnervs, der alle Gesichtsmuskeln innerviert. Das auffälligste Anzeichen für die Symptome der Bell-Lähmung ist die Schwäche und das Erschlaffen der Gesichtsmuskeln auf einer Seite. Obwohl die Bell-Gesichtslähmung nicht lebensbedrohlich ist, kann sie die Lebensqualität des Patienten beeinträchtigen und sogar Angstzustände und Depressionen verursachen. Besonders besorgniserregend ist, dass bis zu 30 % der Patienten selbst bei entsprechender Behandlung an Langzeitfolgen leiden, darunter Synkinese, Kontrakturen, dauerhafte Gesichtsparese und Gesichtsasymmetrie. Daher sind es unsere Hauptziele, die Lösung der Bell-Lähmung zu finden und das Risiko einer Lähmung zu verringern. Der derzeitige Kenntnisstand über den pathogenen Mechanismus der Bell-Lähmung ist noch unklar. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Reaktivierung von Viren die Hauptursache für die Bell-Lähmung sein kann, und diese Viren können ein neuronales Ödem und eine Entzündung verursachen, um den Anfall der Bell-Lähmung auszulösen.

Aufbauend auf neueren Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass Mus die Symptome der Bell-Lähmung lindert, indem es die Schädigung des Gesichtsnervs durch oxidativen Stress verbessert. Diese Studie zeigte experimentell die therapeutischen Wirkungen von Mus auf und zeigte, dass hochreguliertes IL-1R1 in SCs den NF-κB-Signalweg aktiviert und zelluläre Schäden verursacht. Entscheidend ist, dass wir gezeigt haben, dass Mus die NF-κB-Signalgebung hemmt, indem es IL-1R1 herunterreguliert. Unsere Ergebnisse identifizierten die Rolle der Hochregulierung von IL-1R1 bei SCs, die in vitro oxidativem Stress ausgesetzt waren, und positionierten die Mus-Verabreichung als neue therapeutische Strategie.

Protokoll

Diese experimentelle Forschung wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungsnummer: LL-240077) durchgeführt.

Zellkultivierung und medikamentöse Intervention
Ratten-Schwann-Zellen (SCs) wurden in Schwann-Zellmedium kultiviert, bestehend aus Basalmedium, 5 % fötalem Rinderserum, 1 % Schwann-Zellwachstumsergänzungsmittel, 1 % Penicillin und 1 % Streptomycin. Alle Zellen wurden in einer 5%igen CO₂ -Atmosphäre bei 37 °C gehalten. Wenn man sie bis zu einer Dichte von 70-80% wachsen ließ, wurden die SCs in vier Gruppen eingeteilt (n = 5 pro Gruppe): (1) NC-Gruppe; (2) NC+CoCl_2-Gruppe ; (3) NC+CoCl₂+Mus-Gruppe; (4) NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus-Gruppe.

Es ist bekannt, dass Kobaltchlorid (CoCl₂), ein häufig eingesetztes Mittel zur Nachahmung von Hypoxie, Reaktionen auslöst, die denen von Hypoxie ähneln, wie z. B. die Behinderung des Abbaus und der Stabilisierung von Hypoxie-induzierbaren Faktoren und die Akkumulation des HIF-1α-Proteins¹⁵. Gemäß der modifizierten Methode auf der Grundlage von Osuru et ^al.17 wurden in der NC+CoCl_2-Gruppe und der NC+CoCl₂+Mus-Gruppe SCs in Schwann-Zellmedium, ergänzt mit 240 μM CoCl₂ , für 8 h bei atmosphärischen Bedingungen von 95 % Luft und 5 % CO₂ bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator (21 %_O2) kultiviert. Dann wurde in den Mus-Gruppen die Intervention von 1,25 μg/ml Mus für weitere 24 h angewendet. In der NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus-Gruppe wurden die SCs zunächst mit einer 24-stündigen siRNA-Infektion behandelt, dann kontinuierlich mit 240 μM CoCl₂ für 8 Stunden kultiviert, gefolgt von der Intervention von 1,25 μg/mL Mus für weitere 24 Stunden, wie in den vorherigen Gruppen. Das Flussdiagramm des experimentellen Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

Assay zur Zellviabilität
Die Lebensfähigkeit von SCs wurde mit dem Assay-Reagenz des Zellzählkit-8 (CCK-8) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kultivierte SCs mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Well wurden in eine 96-Well-Zellkulturplatte mit 100 μl vollständigem Wachstumsmedium bei 37 °C in einer mit 5 % CO₂ befeuchteten Atmosphäre ausgesät. Als die Konfluenz 70-80 % erreichte, wurden 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die optische Dichte (OD) der 96-Well-Platten wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen und die Zellviabilität berechnet. Die Zellen wurden in vier Gruppen eingeteilt: NC-Gruppe, NC+CoCl_2-Gruppe , NC+CoCl₂+Mus-Gruppe und NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus-Gruppe. Die experimentellen Ergebnisse wurden mit Hilfe einer Blindvertiefung (Medium + CCK8-Lösung) korrigiert. Zellüberlebensrate = [(Experimentalgruppe - Blindvertiefung)/(NC-Gruppe - Blindvertiefung)] × 100%.

siRNA-Transfektion
Die Transfektion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers eines kommerziellen in vitro siRNA/miRNA-Transfektionsreagenzes unter Verwendung synthetischer siRNA-Duplexe von siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) mit einer Konzentration von 100 ng/μl für 24 h durchgeführt. Nach siIL-1R1-Transfektion wurden die siIL-1R1-Expressionen durch Durchführung einer RT-qPCR-Analyse nach 24 h Transfektion¹⁸ bewertet, und es muss sichergestellt werden, dass die Effizienz höher als 80 % ist

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Nachkultur-Überstände wurden gesammelt und unter gruppenspezifischen Bedingungen (2950 g, 20 min, 25 °C) zentrifugiert. Die extrazellulären Spiegel von IL-1β, TNF-α, ROS und SOD wurden gemäß den Anweisungen des Kits mittels ELISA untersucht. Die endgültigen Absorptionswerte bei 450 nm wurden mit einem Mikroplatten-Reader ermittelt.

RNA-Isolierung und quantitative real-time PCR (RT-qPCR)
Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde die Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen mit dem TRizol-Reagenz extrahiert. Zielgene (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) wurden in 20 μl SYBR qPCR-Mixreaktionen für 40 Zyklen auf einem PCR-Instrument amplifiziert. Die β-Aktin verwendete Datennormalisierung, wobei die PCR-Spezifität durch Schmelzkurvenanalyse überprüft wurde. Die ^{2-ΔΔCt-Methode} quantifizierte die relative Expression von fünf unabhängigen Proben, die in dreifacher Ausfertigung untersucht wurden. Die Grundierungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Western-Blot
Nach der Behandlung wurden SCs aus allen Versuchsgruppen 24 Stunden lang inkubiert und geerntet. Das Gesamtprotein wurde mit einem Gesamtprotein-Extraktionskit extrahiert. Proteinlysate wurden mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ladepuffer (SDS-PAGE) kombiniert, der 5 min lang bei 98 °C denaturiert und auf 10-12 % SDS-Polyacrylamid-Gelen abgetrennt wurde (20 μg pro Spur). Aufgelöste Proteine wurden elektrophoretisch auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Trockenmilch blockiert und dann über Nacht bei 4 °C in einem Volumen von 6 ml mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: Anti-HIF-1α-Antikörper (1:1000), Anti-GAPDH-Antikörper (1:1000), Anti-IL-1R1-Antikörper (1:1000), Anti-C-JUN-Antikörper (1:1000), Anti-GDNF-Antikörper (1:1000), Anti-IRAK1-Antikörper (1:1000), Anti-IKK-Antikörper (1:1000), Anti-p65-Antikörper (1:800), Anti-p50-Antikörper (1:900), anti-IκB-α-Antikörper (1:900) und anti-β-Aktin-Antikörper (1:1000). Nach dem Waschen wurden die Membranen 60 min lang bei 25 °C mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern untersucht. Proteinsignale wurden mit Image Studio Digits Ver 4.0 detektiert. Die Bandenintensitäten wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert und auf β-Aktin- und GAPDH-Expression normiert. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Immunfluoreszenz
Die IL-1R1-Lokalisation in SCs wurde in Anlehnung an Zhao et ^al.19 untersucht. Ernten Sie Zellen während der logarithmischen Wachstumsphase durch Trypsinisierung, resuspendieren Sie sie in frischem vollständigem Medium und zerkleinern Sie gründlich, um eine einheitliche einzellige Suspension zu erhalten. Aussaat der Zellen auf Kulturplatten mit sterilen Deckgläsern. Sobald die Zellen die volle Konfluenz erreicht haben, spülen Sie sie 1-2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser und fixieren Sie die adhärenten Zellen 10 min lang mit 4 % Paraformaldehyd in PBS, permeabilisieren Sie mit 0,05 % Triton X-100 (10 min) und blockieren Sie mit 5 % Ziegenserum (1 h). In der primären Inkubation wurde Kaninchen-Anti-Ratten-IL-1R1 mAb verwendet. Nach PBS-Waschungen wurden die Proben 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert. Geben Sie für die Montage wasserlösliche Eindeckmittel in den Deckglas. Immunmarkierte Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit der Anregungswellenlänge 492 nm und der Emissionswellenlänge 520 nm sichtbar gemacht und quantifiziert.

Ultrastruktur-Analyse
Gemäß dem Protokoll¹⁹ von Zhao et al. wurden SCs in 2,5 % Glutaraldehyd fixiert und über Nacht bei 4 °C in 1 % Osmiumtetroxid nachfixiert. Die Proben wurden einer Ethanol/Aceton-Dehydratisierungsreihe unterzogen. Ultradünnschnitte (80 nm) wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt, bevor sie mit einem Transmissionselektronenmikroskop ultrastrukturell untersucht wurden.

Entsorgung von gefährlichen chemischen Reagenzien
Das Medium und die CoCl_2-haltigen Lösungen werden in einem dafür vorgesehenen Schwermetallabfallbehälter gesammelt. Alle Einwegmaterialien, die mit den oben genannten Flüssigkeiten in Berührung gekommen sind, einschließlich Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen und Handschuhe, werden als Schwermetall-Sonderabfall eingestuft und zur ordnungsgemäßen Entsorgung an ein lizenziertes Entsorgungsunternehmen für gefährliche Abfälle übergeben, das von den zuständigen Behörden zugelassen ist. Entsorgen Sie die abgefallene Paraformaldehydlösung in einen speziellen Behälter für Aldehydabfälle. Gebrauchte Verbrauchsmaterialien sollten als Aldehydabfall gesammelt und von demselben lizenzierten Entsorgungsunternehmen für gefährliche Abfälle verarbeitet werden.

Statistische Analyse
Multi-Gruppen-Vergleiche wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey in GraphPad Prism 8.0 analysiert. Die statistische Signifikanz wurde mit P < 0,05 definiert. Die Daten werden als Mittelwert ±± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Ergebnisse

Schützende Wirkung von Mus auf oxidative Stressschädigung von Schwann-Zellen in vitro
Die Expression von HIF-1α zeigte Veränderungen als Reaktion auf Variationen der hypoxischen Umstände²⁰. Um Hypoxie zu modellieren, wurden SCs CoCl₂ ausgesetzt, das erfolgreich Hypoxie induzierte, was durch erhöhte HIF-1α-Proteinspiegel, einen kanonischen Hypoxiemarker, durch Western Blotting bestätigt wurde (Abbildung 2A). Nach...

Diskussion

Die Bell-Lähmung ist eine idiopathische periphere Fazialisparese, die durch einseitige Gesichtsschwäche gekennzeichnet ist. Die Myelinscheide erfüllt verschiedene entscheidende Funktionen für die effektive Funktion von Neuronen²³. Es sorgt für die reibungslose Weiterleitung von Nervenimpulsen, unterstützt Neuronen durch die Versorgung mit Nährstoffen und unterstützt den Prozess der Regeneration²⁴ . Daher kann der Verlust von Myelin im perip...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-Aufschlusslösung (ohne EDTA)	Servicebiografie	G4002
10x TBS	Eubiotech	Nr. BF0153
10-180 KDPrestained Color Protein Marker	Eubiotech	Nr. P0069
5 % fettfreie Trockenmilch	Beyotime Biotechnology, China	Nr. 0216-300g
anti-C-JUN Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#9165T
Anti-GAPDH-Antikörper	abcam, Großbritannien	Artikel-Nr.: ab245355
Anti-GDNF-Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#47808
anti-HIF-1α Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#14179
Anti-IKK-Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#2682
anti-IL-1R1-Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#6775	für WB
anti-IL-1R1-Antikörper	Proteintech	84094-6-RR	für Immunfluoreszenz
Anti-IRAK1-Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#4395
Anti-IchΚ B-& Alpha; Antikörper	Zellsignalisierung, USA	#8943
Anti-P50-Antikörper	abcam, Großbritannien	Artikel-Nr.: ab305263
Anti-P65-Antikörper	abcam, Großbritannien	Artikel-Nr.: ab16502
Anti-Ratten-IL-1R1 mAb	Beyotime Biotechnology, China	Nr. AF7212
Anti-Β-Aktin-Antikörper	ABCAM	Artikel-Nr.: ab179467
BCA-Protein-Quantifizierungskit	Eubiotech	WB2123
Reagenz für den Zellzählkit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	Nr. C0048M
Kobaltchlorid (CoCl2)	Macklin, China	C804815
EuECL Stern	Eubiotech	WB2131
Fötales Rinderserum (FBS)	Bergolin, China	PWL001
Fitc-gekennzeichnetes Anti-Kaninchen-IgG für Ziegen	Servicebiografie	GB22303
Fluoreszenzmikroskop	Nikon
Hieff Trans in vitro siRNA/miRNA-Transfektionsreagenz	YEASEN, China	Artikel-Nr.: 40806ES01
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Sekundärantikörper Hrp-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG	Servicebio, China	GB23301
IL-1β, TNF-α, ROS und SOD-ELISA-Kit	BOSTER, China	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
Muscone (Mus)	Aladdin, China	M141496
PBS-Puffer	Servicebiografie	Nr. G4202
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x	Procell	PB180120
Membranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF)	Millipore, USA	IPFL00010
Ratten-Schwann-Zellen (SCs)	Procell Life Science & Technologie China	CM-M111
RIPA Lyse Puffer	Eubiotech	WB2116
Schwann Zellmedium	ScienCell, Vereinigte Staaten von Amerika	1701
SDS-PAGE Ladepuffer	Beyotime Biotechnology, China	Nr. P0015
SDS-PAGE Protein l Ladepuffer, 5x	Eubiotech	WB2122
si-IL-1R1	Gen Universell	RX0114371
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Vorbereitungskit	Eubiotech	WB2118
SYBR qPCR-Mischung	Beyotime Biotechnology, China	Nr. D7260
Gesamtprotein-Extraktionskit	Beyotime Biotechnology, China	PP123-01
Transmissionselektronenmikroskop	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotechnology, China	Nr. R0011
Tween-20	Eubiotech	WB2114
Wasserlösliche Eindeckmittel	Absin, China	ABS9240
Westlicher Transferpuffer	Eubiotech	WB2129