Methodenartikel

Bewertung von Blattantworten auf mikrobielle Sekundärmetabolite mittels eines Hochdurchsatzformats

DOI:

10.3791/69026

⸱

5. Dezember 2025

 ,  ,  , 
1Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2The Boyce Thompson Institute for Plant Research, 3Department of Biology, University of Ottawa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatzansatz zur Bewertung von Pflanzenionenleck, Peroxidaseaktivität und Callose-Produktion in derselben Probe.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroben sekretieren während einer Pflanzeninfektion strukturell vielfältige sekundäre Metaboliten, von denen einige von Pflanzenzellen nachgewiesen werden und Stressreaktionen auslösen. Bei dieser Methode wird die Induktion von Ionenleck, Peroxidaseaktivität und Calloseproduktion in derselben Blattscheibenprobe gemessen. Erstens werden Arabidopsis- oder Gerstenblattscheiben vakuuminfiltriert in einer 96-Well-Platte. Nach 4–6 Stunden wird die Leitfähigkeit gemessen, gefolgt von Peroxidase-Aktivität und Callose-Ablagerung nach 24 Stunden. Das flg22-Peptid induziert alle drei Reaktionen und ist eine erschwingliche positive Kontrolle. Surfactin und Gramillin zyklische Lipopeptide induzieren die Peroxidase-Aktivität bzw. Ionenleck, während das phytotoxische T-2-Trichothecen die Peroxidase-Aktivität unterdrückt. Insgesamt ermöglicht dieser Ansatz mehrere Vergleiche zwischen Pflanzengenotypen oder Metabolitenbehandlungen. Dieser Ansatz kann auf chemische Genetik oder Bioprotektion angewendet werden, um stressmodulierende Verbindungen für weitere Untersuchungen zu identifizieren. In der Pflanzengenetik kann dieser Ansatz verwendet werden, um Reaktionen zwischen Pflanzenpopulationen für genetische Kartierung zu vergleichen und unser Verständnis der Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroben zu verbessern.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanzen reagieren auf verschiedene mikrobielle Moleküle, um zelluläre Stressreaktionen zu aktivieren, die zu Krankheitsresistenz führen können. Mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs), wie das flg22-Peptid aus bakteriellem Flagellin, werden von pflanzlichen Rezeptorproteinen nachgewiesen, um eine Reihe zellulärer Signalantworten auszulösen. Dazu gehören frühe Reaktionen wie Kinase-Kaskaden, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Calcium-Spiking, Membrandepolarisation und späte Reaktionen wie Callose-Ablagerung und Peroxidase-Aktivitätsinduktion1. Mikrobielle Sekundärmetabolite (MSMs) sind kleine (50–1.500 Dalton), strukturell vielfältige Moleküle, die für Wachstum und Entwicklung entbehrlich sind, aber das Überleben des Mikroorganismus fördern. Einige MSM induzieren zelluläre Stressreaktionen bei Pflanzen, wobei die Mechanismen, die diese Reaktionen auslösen, noch ungeklärtsind 2,3. Vorgeschlagene Mechanismen zur Pflanzenerkennung von MSM umfassen Mechanosensing, Redox-induzierte Proteinmodifikationen oder lipidbasierte Signalgebung 4,5. In einigen Fällen löst MSM Stressreaktionen aus oder verursacht je nach Konzentration Zellschäden. Zum Beispiel induziert das T-2-Toxin die Produktion von Callose und ROS bei 1 μM und verursacht Zelltod bei 10 μM, und wird typischerweise als Phytotoxin4 beschrieben. MSMs beeinflussen die Pathogenese in einigen Pflanzen-Mikroben-Interaktionen und können entweder Pflanzenanfälligkeit oder Resistenz auslösen. Zum Beispiel induziert das Gramillin-Cyclic-Lipopeptid die ROS-Produktion, Ionenleckage und Callose-Produktion, während es die Gerstenanfälligkeit für Fusarium graminearum2 erhöht. Die zyklischen Lipopeptide von Syringomycin und Syringopeptin induzieren die Produktion von pflanzlicher ROS und fördern die Wirtsresistenz gegen die Pseudomonas-Fluorescens-Bakterien 3. Andere MSM, wie Surfactin und Iturin, werden von nicht-pathogenen Mikroben produziert und fördern die Resistenz gegen nachfolgende Krankheitserreger-Infektionen, indem sie Pflanzenstressreaktionenauslösen 6,7. Diese bioprotektiven MSM induzieren zelluläre Antworten, darunter Ionenflüsse, ROS-Produktion, transkriptionelle Veränderungen und Callose-Produktion8. Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen MSM und Pflanzen könnte helfen, die Rolle von MSM bei der Krankheitsresistenz zu bestimmen und Wirtsgene zu identifizieren, die zur Verbesserung der Pflanzenresistenz genutzt werden können.

Aktuelle Methoden zur Bewertung von MSM-induzierten Anlagenstressreaktionen beinhalten typischerweise das Testen einer Stressreaktion zur gleichen Zeit8. Da sekundäres MSM schwer zu extrahieren sein kann und nur eine begrenzte Menge Metaboliten verfügbar ist, kann das Testen mehrerer Antworten innerhalb derselben Probe die Gewissheit geben, dass das MSM eine Wirkung auf Pflanzenzellen hat. Eine Hochdurchsatzmethode zur Bewertung apoplastischer ROS-Ausbrüche ist die Erkennung von Lumineszenz, die durch oxidiertes Luminol in Anwesenheit von Meerrettichperoxidase9 erzeugt wird. Leider wird die luminolbasierte Lumineszenz durch Kationen und einige Lösungsmittel gedämpft, was die Verwendung dieses Tests für Extrakte mit Salzen oder für unpolare Moleküle, die in DMSO gelöst werden müssen, einschränkt und eine Methode erforderlich macht, die mit diesen Schadstoffen9 arbeitet. Um diese Probleme anzugehen, haben wir die aktuellen Methoden erweitert, um drei Stressreaktionen (Ionenleck, Peroxidaseaktivität und Hornhaute) aus derselben Blattprobe in einem Hochdurchsatz-Test zu bewerten (Abbildung 1)10,11,12. Unser Ansatz besteht darin, Blattscheiben mit MSMs mittels Vakuuminfiltration in einer 96-Well-Platte zu behandeln. Anschließend werden Leitfähigkeitsmessungen 4–6 Stunden nach der Behandlung durchgeführt, um Ionenlecks zu bewerten, gefolgt von Peroxidase-Aktivitäts- und Callose-Abscheidungsmessungen bei 24 Stunden. Unser Ansatz wurde für Arabidopsis und Gerste optimiert, könnte aber mit experimenteller Validierung auch auf andere Pflanzenarten ausgeweitet werden. So ist beispielsweise die induzierte Gerstenperoxidase-Aktivität mit dieser Methode nicht nachweisbar, aber die Unterdrückung der Aktivität durch toxische Verbindungen kann nachgewiesen werden. Daher variieren die Blattmerkmale oder die Amplitude der induzierten Reaktion von Art zu Art, was die Anwendbarkeit dieses Ansatzes auf einige Pflanzenarten einschränkt.

Das experimentelle Design mit dieser Methode sollte die Kontrollen, Replikation und Konzentration der verwendeten MSM berücksichtigen, um die besten Ergebnisse zu gewährleisten. Eine negative Kontrolle ist unerlässlich, um MSMs zu identifizieren, die statistisch unterschiedliche Stressreaktionsstufen auslösen als die Auswirkungen von Verletzungen. Idealerweise würde die negative Kontrolle dasselbe Lösungsmittel wie das MSM enthalten, aber ohne MSM. Typische Lösungsmittel für hydrophobe MSM sind DMSO und Methanol, die zelluläre Reaktionen wie die ROS-Produktion bei hohenKonzentrationen 13,14 induzieren. In diesem Test beobachten wir einen Einfluss auf die Peroxidase-Aktivität, bei der 10 % oder mehr DMSO und Methanol die durch flg22-induzierte Peroxidase-Aktivität blockieren (Abbildung 2). Im Fall komplexer Extrakte kann es schwierig sein, eine negative Kontrolle ohne MSM zu entwickeln, wenn die interessanten Metaboliten unbekannt sind. Stattdessen würde die Fraktionierung der Extrakte nach Größe, Polarität oder Ladung relative Vergleiche zwischen Fraktionen ermöglichen, um den spannungsverursachendsten Anteil für weitere Analysen zu identifizieren. Darüber hinaus stellt die Einbeziehung einer positiven Kontrolle sicher, wie etwa 1 μM flg22 oder 10 μM T-2-Toxin, dass der Forscher bewerten kann, ob der Test funktioniert. Wir empfehlen, pro Behandlung vier technische Replikaten einzubauen und bei jeder Platte bei mehreren Messplatten innerhalb eines Experiments positive und negative Kontrollen einzubeziehen.

Insgesamt erfasst dieser Ansatz drei MSM-induzierte Pflanzenstressreaktionen und bietet eine zugängliche und kosteneffiziente Methode, um Interaktionen zwischen Pflanze und MSM zu untersuchen. Das Hochdurchsatzformat ermöglicht es Forschern, subtile Unterschiede zwischen Pflanzengenotypen oder mikrobiellen Extrakten innerhalb derselben experimentellen Einheit zu erfassen. Dies ermöglicht systemweite Ansätze, um Pflanzengenfamilien zu verstehen oder Pflanzenpopulationen für genetische Kartierungen zu untersuchen. Auf der Mikrobenseite könnte dieser Ansatz verwendet werden, um potenzielle bioprotektive Verbindungen zu screenen oder in der chemischen Genomik, um Verbindungen zu identifizieren, die spezifische Stressreaktionen verstärken oder unterdrücken.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Probenvorbereitung und Behandlung

HINWEIS: Alle geeigneten Sicherheitsvorkehrungen und Entsorgungsmaßnahmen sollten getroffen werden, um das Risiko für den Experimentator und die Umwelt zu minimieren.

  1. Pflanzenkultivierung
    1. Wachsen Sie Arabidopsis bis zum 4-5 Wochen alten Stadium auf einer Cornell-Bodenmischung (300 Torfmoos: 630 Vermiculit: 1 langsam freisetzender Dünger: 4,2 Kalk) mit zwei Pflanzen pro Topf in 24 Töpfen pro Tablett. Gießen Sie die Pflanzen nach Bedarf von unten, indem Sie Wasser in die Schale geben. Stellen Sie die Wachstumskammerbedingungen kontinuierlich auf 21 °C ein, mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit und halten Sie die Luftfeuchtigkeit bei etwa 30-50 %. Verwenden Sie die 5.-9. vollständig expandierten Blätter morgens zum Experimentieren und zur Ernte.
    2. Gerste anbauen, bis das erste und zweite echte Blatt vollständig gewachsen sind, in 75 Blumenerde: 24 Erde: 1 Kalkbodenmischung. Pflanze pro Topf einen Samen in 24 Beete pro Tablett und gieße bei Bedarf. Stellen Sie die Wachstumskammerbedingungen auf 21 °C mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei etwa 30-50 % Luftfeuchtigkeit ein. Probiere die ersten und zweiten vollständig ausgeweiteten Blätter und ernte morgens.
  2. Sammeln Sie drei Blattscheiben pro Pflanze mit einem Korkbohrer mit 4 mm Durchmesser und vermeiden Sie dabei die Mittelvene. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu zerkleinern, indem Sie einen scharfen Bohrer mit einer Drehbewegung verwenden.
  3. Setzen Sie die Blattscheiben sofort und vorsichtig in einen Brunnen einer 96-Well-Platte in 196 μL sterilem Milli-Q H2O. Setzen Sie die Scheiben fort, bis die erforderliche Anzahl an Proben entnommen ist.
  4. Fügen Sie sekundäre Metaboliten oder Lösungsmittelbehandlungen in der gewünschten Konzentration zu einem Endvolumen von 200 μL in einzelne Bohrungen hinzu.
  5. Setze die 96-Well-Platte mit abgenommenem Deckel in ein Glasglas mit Vakuumdüse.
  6. Schließen Sie den Vakuumschlauch an die Düse des Glasbetts an und drehen Sie den Vakuumdruck ein, bis der Vakuum 9,8 Pfund pro Quadratzoll erreicht (typischerweise 10 Sekunden). Wiederhole diesen Vorgang noch einmal.
  7. Stellen Sie den Deckel auf die Platte und inkubieren Sie auf einem Orbitalschütter (55 U/min) unter Licht (13 W, 50 μmol∙m-2∙s-1), das 23 cm über dem Schüttler für 4 Stunden angebracht ist.

2. Ionenleckmessungen

  1. Waschen Sie die Sonde mit Milli-Q-Wasser und tupfen Sie leicht auf Kimwipe zum Trocknen. Beachten Sie zur Referenz die Leitfähigkeitsmessung des Wassers.
  2. Nach 4–6 Stunden nach der Behandlung wird die Leitfähigkeit aus einzelnen Bohrlöchern entprobt und erfasst, indem die Sonde in die Flüssigkeit um die Blattscheibe eingetaucht wird. Halten Sie die Platte in einem Winkel von 45°, um sicherzustellen, dass die Sonde vollständig eingetaucht ist.
  3. Spülen Sie die Sonde zwischen den Proben ab, indem Sie sie in Milli-Q-Wasser tauchen und die Sonde trocken auf eine Kimwipe tupfen. Gelegentlich sollte die Leitfähigkeit des Wassers getestet werden, um sicherzustellen, dass die Sondenwerte stabil bleiben.
  4. Lege eine Kunststoff-Dichtungsfolie auf die Platte und setze sie über Nacht zurück in den Orbitalshaker zur Inkubation.

3. Peroxidase-Aktivitätsmessungen

  1. Bereiten Sie das Peroxidasesubstrat täglich frisch als 50-mL-Lösung vor. Erhitze 40 ml destilliertes steriles Wasser auf 70 °C in einem Becher mit einem Rührstab und löse 50 mg 5-Aminosalicylsäure (1 mg/mL) im erhitzten Wasser auf. Füge Wasser bis zu 50 ml hinzu und passe den pH-Wert mit NaOH auf 6 ein. Die Lösung ist lichtempfindlich, also decken Sie sie mit Alufolie ab oder verwenden Sie eine bernsteinfarbene Röhre.
  2. In einem 50 mL bernsteinfarbenen konischen Rohr wird eine 1%ige H2O2-Lösung hergestellt, indem 1,7 mL 30% H2OO2zu 48,3 mL Milli-Q H2OOOhinzugefügtwerden.
  3. Unmittelbar vor dem Assay fügen Sie 10 μL der 1% H2O2 2 2-2-Lösung pro Milliliter 5-Aminosalicyllösung hinzu, die für den Assay benötigt wird, um das Assaymedium zu erzeugen.
  4. Um die behandelten Blattscheiben zu beproben, nehmen Sie 50 μL aus jedem Bohrloch zum gewünschten Zeitpunkt. Auf eine klare, flache 96-Well-Platte übertragen und 50 μL des Prüfmediums hinzufügen, wobei sie durch 5-faches Pipettern mischen.
  5. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 Minuten und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 20 μL 2 N NaOH hinzufügen und sanft anklopfen, um zu mischen.
  6. Messen Sie die Absorption der Bohrlöcher bei 595 nm in einem Plattenmesser.

4. Callose-Bildgebung und Bildanalyse

  1. Nach der Probenahme der Brunnen für den Peroxidase-Test wird die verbleibende Flüssigkeit aus den Bohrlöchern entfernt und 100 μL einer Essigsäure:Ethanol-(1:3)-Lösung zur Fixierung und Entfärbung hinzugefügt. Setzen Sie einen Deckel auf die Platte und inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker (60 U/min) in einer Abzughaube für 24 Stunden bei Zimmertemperatur.
  2. Ersetzen Sie die Entverfärbungslösung durch eine frische Lösung und inkubieren Sie weitere 24 Stunden bei Zimmertemperatur.
  3. Pipettieren Sie die Entfärbungslösung und fügen Sie jedem Brunnen 100 μL 150 mM K2HPO4 hinzu. Stelle den Teller auf den Shaker und inkubiere ihn 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
  4. Entferne die K2HPO4 Waschlösung und gib 100 μL 150 mM K2HPO4 mit 0,1 mg/mL Anilinblau hinzu. Decken Sie die 96-Well-Platte mit einer Abdeckung und Alufolie ab und inkubieren Sie sie mindestens 2 Stunden (Arabidopsis) oder über Nacht (Gerste) auf einem Shaker.
    HINWEIS: Anilinblau ist lichtempfindlich und sollte für jede technische Nachbildung frisch hergestellt werden.
  5. Entferne die Anilin-blaue Lösung und ersetze sie durch 50 % Glycerol. Decken Sie die 96-Well-Platten mit Alufolie ab und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie zum Fotografieren bereit sind.
  6. Gib einen Tropfen 50%ige Glycerollösung auf einen sauberen Glasobjektträger. Heben Sie vorsichtig eine Blattscheibe mit einer Pinzette auf und legen Sie sie mit der abaxialen Seite nach oben auf den Schlitten. Decken Sie mit einem 1,5-Liter-Deckzettel ab, um Luftblasen zu minimieren, und fügen Sie bei Bedarf zusätzlich 50 % Glycerin hinzu, um unter dem Deckzettel zu füllen.
  7. Bringen Sie das Blattmaterial mit durchgebranntem weißem Licht (hellem Feld) unter einer 20-fach trockenen Objektivlinse in den Fokus.
  8. Wählen Sie die Anregungswellenlänge auf 370 nm und die Emissionswellenlänge auf 509 nm für die Anilin-Blau-Bildgebung und legen Sie eine Belichtungszeit ein. Optimieren Sie die Belichtungszeit, um ausreichendes Signal zu ermöglichen, aber eine Übersättigung von Pixeln zu vermeiden. Für den quantitativen Vergleich von Bildern stellen Sie sicher, dass die Laserintensität und Belichtungszeit für alle biologischen Replikate, Behandlungen und technischen Replikationen einheitlich sind.
  9. Wählen Sie für jede Blattscheibe drei verschiedene Sichtfelder aus und nehmen Sie Bilder für jedes mit den in Schritt 4.8 festgelegten Parametern auf. Erwache alle Bilder mit Pflanzenmaterial, das das Sichtfeld vollständig ausfüllt, mit minimalen Hintergrundbereichen (nicht-pflanzliches Material). Nehmen Sie Bilder auf einer einzelnen Z-Ebene auf der Blattoberfläche auf.
    HINWEIS: Ein Hintergrund kann unvermeidlich sein und kann in späteren Bildquantifizierungsschritten korrigiert werden. In diesem Beispiel werden Bilder mit einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberlampe und dem DAPI-Filterwürfel aufgenommen (Anregung 360/40 nm, Emission 460/50 nm). In Fällen, in denen keine Quecksilberlampe verfügbar ist, kann eine LED-Lichtquelle mit mehreren Wellenlängen verwendet werden.
  10. Um Callose-Flecken anhand von Bildern zu quantifizieren, laden Sie die frei verfügbare FIJI-Bildverarbeitungssoftware unter Verwendung der online verfügbaren Anleitung unter https://imagej.net/Fiji/Downloads herunter und installieren Sie sie. FIJI öffnen und die anilinblauen Bilder zur Analyse importieren. Für diese Analyse verwenden Sie .tiff Dateien mit einer Auflösung von mindestens 300 DPI. Exportieren Sie Bilddateien in .tiff Format mit der Mikroskopsoftware vor der Analyse oder lassen Sie FIJI die Dateien öffnen.
    HINWEIS: Fiji kann die meisten proprietären Dateitypen öffnen (z. B. .czi, .nd2, .lif, .vsi).
  11. Stellen Sie die Skala des Bildes ein (klicken Sie auf Analysieren | Skalierung einstellen), basierend auf den Entfernungswerten aus dem Mikroskop-Setup.
  12. Konvertiere das Bild in ein 32-Bit-Graustufenbild (klicke auf Bild | Typ | 32 Bit).
  13. Stellen Sie die Schwelle an (klicken Sie auf Bild | Anpassen | Schwellewert) nur das Fluoreszenzsignal einzubeziehen, das die Anilinblau-Färbung darstellt, indem man auf Auto klickt und dann manuell die Minimal- und Maximalwerte auf der Schwellenkurve anpasst. Sobald die Schwelle festgelegt ist, klicken Sie auf Apply | Konvertiere in Maske. Mit Tabellenkalkulationssoftware schreiben Sie die ausgewählten Schwellenwerte für jedes Bild.
    HINWEIS: Aufgrund der inhärenten Autofluoreszenz von Pflanzenproben und der Entfernung des Pflanzengewebes kann der Schwellenwert zwischen den Proben unterschiedlich sein. Für die Reproduzierbarkeit ist es unerlässlich, den Schwellenwert jedes Bildes aufzuzeichnen und bei der Anpassung der Schwellenwerte zwischen den Proben konsequent zu sein.
  14. Quantifizieren Sie die Anzahl und Größe der Anilinblaupuncta mit Teilchen analysieren (klicken Sie auf Analysieren | Analysiere Partikel) mit den Standardeinstellungen. Für Durchschnittswerte aller Puncta im Bild wählen Sie im Pop-up-Feld Zusammenfassen und klicken Sie dann auf OK.
  15. Kopieren und fügen Sie diese Ergebnisse aus dem Zusammenfassungsfeld mit den Schwellenwertparametern in die Tabelle ein, um sie weiter zu analysieren. In dieser Quantifizierung enthaltene Werte umfassen die Anzahl (Anzahl der Anilinblau-Puncta), Gesamtfläche (Gesamtfläche in Einheiten2 von Anilinblau-Puncta), Durchschnittsgröße (durchschnittliche Größe in Einheiten2 von Anilinblau-Puncta), %Fläche (Prozentsatz der durchschnittlichen Bedeckung in denEinheiten 2 der anilinblauen Fluoreszenz im Vergleich zur Gesamtfläche), Umfang (durchschnittlicher Umfang der Puncta) und IntDen (Hinweis auf die Fluoreszenzintensität der Anilinblau-Färbung).
  16. Wiederholen Sie die Schritte 4.11-4.15 für alle während des Experiments aufgenommenen Bilder. Wenn Sie ein Schwellenbild aus FIJI schließen, wählen Sie "Nicht speichern ", um zu vermeiden, dass das Rohdatenbild auf die Schwellenmaske geändert wird.
  17. Wenn Bilder einen Bereich mit nicht-pflanzlichem Hintergrund enthalten, messen Sie die Fläche des Pflanzengewebes, indem Sie manuell die Region des Pflanzengewebes mit den Polygon- oder Freihand-Auswahlwerkzeugen umreißen und die Fläche messen (klicken Sie auf Analysieren | Messen). Kopiere diesen Wert für jedes Bild in die Tabelle.
  18. In einer Tabelle werden die Werte aus den drei Sichtfeldbildern einer biologischen Replikation gemittelt. Wenn einige Bilder aus dem Experiment keine pflanzliche Fläche enthalten (siehe Schritt 4.17), korrigieren Sie alle Werte basierend auf der Fläche des Pflanzengewebes in jedem Bild. Zum Beispiel teilen Sie den Count-Wert durch die Fläche des Pflanzengewebes für jedes Bild, bevor Sie Grafiken und statistische Vergleiche erstellen.

5. Datenanalyse

  1. Bewerten Sie die Qualität des Experiments, indem Sie positive Kontrollen mit negativen Kontrollen innerhalb derselben Platte mit einem t-Test vergleichen. Wenn die positiven Kontrollgruppen keine signifikanten Veränderungen der Stressreaktionen bewirkten, sollten experimentelle Bedingungen wie die Gesundheit der Pflanzen, der Zeitpunkt der Behandlung, die negative Kontrolle und die mögliche Verschlechterung der MSMs neu bewertet werden.
  2. Signifikanzprüfung
    1. Wenn alle technischen Replikationen einer Behandlung auf derselben Platte ausgewertet werden, analysieren Sie die Unterschiede zwischen einzelnen Behandlungen und der negativen Kontrolle mit standardisierten statistischen Ansätzen wie einer Einweg-ANOVA mit einem Tukey-Test.
    2. Wenn technische Replikationen einer Behandlung über mehrere Platten ausgewertet würden, wird jede Probe relativ zur negativen Kontrolle normalisiert, um den Einfluss des Platten-zu-Platten-Fehlers zu minimieren. Teile jeden Wert durch den Durchschnitt der negativen Kontrollproben innerhalb derselben Platte. Unterwerfen Sie die normalisierten Werte den standardisierten statistischen Methoden.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit dieser Methode kann feststellen, ob ein MSM eine Teilmenge der zellulären Stressreaktionen von Pflanzen aktiviert. Die Ergebnisse dieses Tests liefern die Quantifizierung der Peroxidase-Aktivität, der Ionenleckage und der Callose-Produktion, um festzustellen, ob ein MSM im Vergleich zu einer negativen Kontrolle unterschiedliche Reaktionen induziert. Ein positives Ergebnis für eine Verbindung würde durch einen signifikanten Unterschied zur negativen Kontrolle angezeigt werden, wie für das Gramillin-Ionophor gezeigt, das Ionenverlust und Calloseproduktion induziert (Abbildung 3)2. Die Einbeziehung einer positiven Kontrolle, wie etwa 1 μM flg22, die alle drei Reaktionen induziert, gewährleistet intakte Anlagenleistung und experimentelle Bedingungen (Abbildung 3)11,15. Gramillin und flg22 sind in Wasser gelöst, während das hydrophobe Surfakt und T-2-Toxin in DMSO gelöst sind. Um hydrophobe Moleküle herzustellen, bereiten wir zunächst einen 10-mM-Vorrat in DMSO vor. Dieser Bestand wird verwendet, um eine Endkonzentration von 10 μM in Milli-Q-Wasser für die Blattbehandlung zu erzeugen, das 0,1 % DMSO enthält. Surfactin (10 μM) induziert die Peroxidase-Aktivität und Kallose, während das T-2-Toxin (10 μM) die Peroxidase-Aktivität unterdrückt und die Callose-Produktion auslöst, wahrscheinlich aufgrund von Zelltod 2,6,16. Die Verwendung von Wasser oder 0,1 % DMSO als negative Kontrollen ist für die angezeigten Behandlungen geeignet, da beide Kontrollen ähnliche Ergebnisse erzielen (Abbildung 2).

In unseren vorläufigen Screenings von 100 kommerziell erhältlichen MSM sehen wir eine Callose-Induktion für die meisten untersuchten Verbindungen (>70 %), während Ionenleckage und Peroxidase-Aktivität durch weniger Verbindungen ausgelöst werden (30 % und 35 %). Die Mehrheit dieser Verbindungen wird von Fusarium-Arten produziert, darunter sieben verschiedene Trichothecene wie Deoxynivalenol (DON) und T-2-Toxin. Obwohl weitere Replikationen zur Bestätigung dieser Ergebnisse laufen, zeigen sie ähnliche Trends wie bei unseren positiven Kontrollen (Abbildung 3), bei denen Callose durch alle Behandlungen induziert wurde und Ionenleckage oder Peroxidase durch einige, aber nicht alle Behandlungen ausgelöst wurde.

figure-results-1
Abbildung 1: Überblick über das Verfahren zur Bewertung von MSM-induzierten zellulären Reaktionen in Blättern. Blattscheiben werden in eine 96-Well-Platte mit den interessanten Behandlungen platziert, und die Scheiben werden vakuuminfiltriert. Jede Platte enthält vier Replikationen einer negativen Kontrolle (Wasser mit Lösungsmittel) und einer positiven Kontrolle (flg22 oder T-2-Toxin). Nach 4–6 Stunden wird die Leitfähigkeit der Flüssigkeit um die Blattscheibe herum als Quantifizierung des Ionenlecks gemessen. Nach 24 Stunden wird die Peroxidase-Aktivität mittels eines kolorimetrischen Tests mit der Flüssigkeit um die Blattscheibe quantifiziert, die Blattscheibe entfärbt und zur Callose-Quantifizierung verarbeitet. Abkürzung: MSM = mikrobieller Sekundärmetabolit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Die Wirkung des Lösungsmittels auf die durch FLG22 induzierte Ionenleckage oder Peroxidase-Aktivität. Vier replikierte Arabidopsis-Proben wurden mit 1 μM flg22 kombiniert mit DMSO oder Methanol behandelt (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Balkendiagramme zeigen die durchschnittliche Leitfähigkeit der Probe nach 4 Stunden oder die Peroxidase-Aktivität (OD600) nach 24 Stunden nach Behandlung aus einem einzelnen Experiment (n = 4, SD). Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Ein signifikanter Unterschied zur Wasserkontrolle wurde durch einen t-Test festgestellt und durch ein Sternchen (p < 0,05) angezeigt. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; MeOH = Methanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Induktion von Ionenleck, Peroxidase-Aktivität oder Callose-Ablagerung in Arabidopsis-Blattscheiben durch mikrobiell abgeleitete Moleküle. Zu den Behandlungen gehörten das immunogene, nicht-toxische Peptid flg22 (1 μM), die zyklischen Lipopeptide Gramillin und Surfactin (10 μM) sowie das T-2-Toxin (10 μM)2,6. Alle Daten wurden auf die Kontrolle Wasser + 0,1 % DMSO normalisiert. Box-and-whisker-Plots zeigen die Leitfähigkeit der Probe nach 4 Stunden, die Peroxidase-Aktivität (OD600) nach 24 Stunden oder die Anzahl der Callose-Ablagerungen nach 24 Stunden aus einem einzelnen Experiment (n = 4-16 Pflanzen). Die Boxdiagramme zeigen ein 'x' an, um den Wert des Mittelwerts anzuzeigen, und die Boxen zeigen das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil der Behandlung an. Die höchsten und niedrigsten Beobachtungen, die keine Ausreißer sind, werden durch die Schnurrhaare angezeigt (>1,5x Interquartilbereich, gekennzeichnet durch Kreise). Ein signifikanter Unterschied zur Wasserkontrolle wird durch ein Sternchen angezeigt und wurde durch eine Einweg-ANOVA mit einem Tukey-Test (S. < 0,05) bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanzenkoloniserende mikrobielle Gemeinschaften sezernieren verschiedene MSMs ab, um die Biofilmbildung zu erleichtern, konkurrierende Mikroben zu unterdrücken und den Pflanzenwirt17 zu beeinflussen. Während einige MSMs keinen Einfluss auf die Pflanze haben, verursachen andere einen schnellen Zelltod, unterdrücken die Zellfunktion oder verursachen Pflanzenresistenz17. Einige MSMs beeinflussen die Pflanzenresistenz gegen den MSM-produzierenden Mikroorganismus, und resistente Genotypen können anhand der MSM-Unempfindlichkeit 2,3,18 ausgewählt werden. Andere MSMs induzieren systemische Resistenzen und bieten Schutz gegen mikrobielle Krankheitserreger, die in der Landwirtschaft zur Entwicklung bioprotektiver Produkte zur Unterdrückung von Krankheiteneingesetzt wurden 8. Um effektive und nachhaltige Strategien zur Pflanzenverbesserung zu entwickeln, ist es unerlässlich, nützliche MSMs und die Pflanzengene zu identifizieren, die eine optimale MSM-Reaktionsfähigkeit ermöglichen.

Die Suche nach nützlichen MSMs wird dadurch erschwert, dass diese Verbindungen enzymatisch produziert werden, wobei für dasEndprodukt mehrere Enzyme benötigt werden. Dies erschwert es zu bestimmen, welches Gen gezielt ausgewählt werden soll, um die MSM-Produktion für genetische Studien abzuschaffen. Die enzymatische Biosynthese führt zu mehreren strukturellen Variationen desselben MSM mit potenziell unterschiedlichen Bioaktivitäten19. Das Trennen und Reinigen dieser MSMs, um die bioaktiven Moleküle zu finden, kann zeitaufwendig oder unmöglich sein. In manchen Fällen können nur geringe Konzentrationen einzelner MSMs gereinigt werden, wobei mehrere Reinigungsrundenerforderlich sind 2. Sobald eine bioaktive Verbindung oder ein Extrakt gewonnen wurde, können verschiedene Ansätze angewandt werden, um zu verstehen, wie der Mikroorganismus die Pflanze beeinflussen könnte.

Frühere Bestrebungen konzentrierten sich darauf, die Auswirkungen von MSM auf die transkriptionelle Umprogrammierung oder Bioschutz in Modellpflanzenzu überwachen 20. Um MSM-Reaktionen über Modellpflanzen hinaus zu bewerten, sind Hochdurchsatz-Assays, die Reaktionen auf verschiedene MSMs erfassen und minimale MSMs erfordern, potenziell nützlich. Neuere Untersuchungen zeigen, dass ROS-Ausbrüche eine häufige frühe Reaktion auf MSMs sind, darunter Gramillin, Surfactin, Syringomycin und Syringopeptin 2,3,7. Ein luminolbasierter Test erkennt den apoplastischen ROS-Burst, der durch Peroxidasen und NADPH-Oxidasen erzeugt wird, und eignet sich für Hochdurchsatztests21. Leider sind intrazelluläre ROS, die von MSMs induziert werden, wie Surfaktin, mitdieser Methode nicht nachweisbar. Die Quantifizierung der Peroxidaseaktivität bietet eine empfindlichere Alternative als der luminolbasierte Test zur Erkennung der vorübergehenden Aktivierung ROS-erzeugender Enzyme während Stress11. Unsere Beobachtung, dass Surfactin die Peroxidase-Aktivität induziert, stimmt mit aktuellen Arbeiten überein, die zeigen, dass die Peroxidase-Aktivität durch Surfactin und Beauvericin in Arabidopsis ausgelöst wird (Abbildung 3)2. Außerdem zeigten wir, dass flg22 und das Ionophor Gramillin Ionenverlust induzieren, und alle getesteten Verbindungen, einschließlich flg22, T-2-Toxin, Surfactin und Gramillin, induzieren Callose wie erwartet (Abbildung 3)2,4,7.

Durch die Bewertung mehrerer Reaktionen innerhalb derselben Stichprobe minimieren wir die experimentelle Variation bei der separaten Bewertung jedes dieser Merkmale und ermöglichen eine Korrelation zwischen den Merkmalen für systemweite Studien zu Pflanzenstressreaktionen. Die Bewertung mehrerer Behandlungen oder Genotypen innerhalb derselben experimentellen Einheit ermöglicht zudem eine Phänotypisierung auf Populationsebene für die Populationsgenetik. Beispielsweise wurde ein ähnlicher Ansatz verwendet, um eine QTL zu identifizieren, die der FLG22-induzierten ROS-Produktion in Gerste22 zugrunde liegt. Dieser Test kann auch für chemische genetische Screens verwendet werden, um Modulatoren von Pflanzenstressreaktionen zu finden oder potenzielle bioprotektive MSMs aus mikrobiellen Extrakten zu identifizieren.

Um sicherzustellen, dass die experimentelle Methode im jeweiligen System funktioniert, sollten Forscher folgende Faktoren und Einschränkungen berücksichtigen:

Qualität des Blattgewebes
Stellen Sie sicher, dass das Pflanzenblattgewebe vor der Ernte nicht gestresst wird. Anzeichen dafür, dass Pflanzen gestresst sind, variieren je nach Art, umfassen aber in der Regel Welken, Gelbfärbung, Rötung, Flecken, übermäßiges Blattkräuseln oder Rollen. Das Entnehmen von Blattgewebe verursacht Verletzungen, daher reduziert das Vermeiden einer übermäßigen Maceration des Gewebes den Hintergrundfehler durch die Handhabung.

Pflanzenart
Dieses Protokoll ist für die Verwendung mit Gersten- und Arabidopsis-Blättern optimiert. Gerstenblätter benötigen eine längere Färbungszeit für Callose als Arabidopsis, vermutlich aufgrund des dickeren Kutikulawachs in Gräsern, das die Hydrophobie erhöht und die Diffusion der Behandlungen in dasBlatt 23 einschränkt. Dies könnte auch teilweise die fehlende Peroxidase-Aktivitäts-Induktion mit unserer Methode erklären, obwohl wir eine Unterdrückung der Peroxidase-Aktivität durch toxische Verbindungen ähnlich wie in Arabidopsis (Abbildung 3) beobachten konnten. Wir haben versucht, die Anzahl der Blattscheiben pro Probe auf 5 zu erhöhen, den pH-Wert auf 5, 6 oder 7 anzupassen, die Anzahl der Vakuuminfiltrationen auf 10 zu erhöhen und die Substratkonzentration zu verändern oder das Substrat auf Guaiacol24 zu ändern. Obwohl wir eine erhöhte Peroxidase-Aktivität mit mehr Blattscheiben und Infiltrationsrunden sahen, blieben die Unterschiede zwischen der negativen Kontrollgruppe und dem flg22 gering (10 % Anstieg bei flg22) oder nicht signifikant über die Experimente hinweg. Wir wissen, dass Gerste auf flg22 reagiert, indem sie ROS-Produktion, Callose-Produktion und Peroxidase-Expression25,26 induziert. In Maiswurzeln zeigten Proteinextrakte eine MAMP-induzierte Peroxidase-Aktivität, was darauf hindeutet, dass die Proteinextraktion notwendig sein könnte, um die Induktion zu sehen, im Gegensatz zur Erkennung der Proteinaktivität, die aus den Blattscheiben auslaugt, wie es in unserem Test24 geschieht. In unserem Test induziert die Verwundung eindeutig die Peroxidase-Aktivität in der negativen Kontrollprobe, da diese Aktivität verschwindet, wenn die Zellen durch Toxinexposition absterben. Es ist möglich, dass die flg22-Behandlung dieselben Peroxidasen wie die Verwundung induzieren könnte, sodass es so aussieht, als hätte keine Induktion stattgefunden. Alternativ ist unser Test möglicherweise nicht empfindlich genug, um subtile Veränderungen zu erkennen, oder die Peroxidasen diffundieren nicht gut in die Lösung.

Um dieses Protokoll auf andere Pflanzenarten anzuwenden, empfehlen wir, die beschriebene Methode zu verwenden und Arabidopsis als Kontrollmechanismus einzubeziehen, um sicherzustellen, dass das Protokoll funktioniert. Wenn die Peroxidase-Aktivität gering erscheint, könnte eine Erhöhung der Anzahl der Blattscheiben pro Probe, die Erhöhung der Vakuuminfiltrationen auf 5 oder 10 und das Ausprobieren verschiedener Behandlungen, einschließlich anderer MAMPs, Ionophore oder T-2-Toxins, ein positives Ergebnis erzielen.

Negativkontrollbehandlungen
Diese Methode basiert auf einer effektiven und angemessenen negativen Kontrolle für Vergleiche. Idealerweise würde eine negative Kontrolle dasselbe Hintergrundlösungsmittel enthalten wie die interessierende MSM-Behandlung, jedoch ohne MSM. Das Hintergrundlösungsmittel wäre Wasser oder hätte denselben Einfluss auf die gemessenen Spannungen wie Wasser. Dies ist ein praktischer Ansatz in Fällen, in denen das MSM bereits gereinigt ist und in einem Lösungsmittel der Wahl gelöst werden kann. Beim Vergleich mikrobieller Extrakte könnte eine negative Kontrolle das Nebenprodukt der partiellen Reinigung des MSM sein, das das gleiche Hintergrundmedium enthält, aber nach der Fraktionierung eine reduzierte MSM-Konzentration aufweist. Oder der Experimentator könnte das Kultivierungsmedium, das zur Erzeugung des MSM-haltigen Extrakts verwendet wird, als Negativkontrolle verwenden. In diesen komplexeren Proben könnte die negative Kontrolle Salze enthalten, die die Leitfähigkeitsmessung aufblähen, oder Lösungsmittel können die Peroxidaseaktivität unterdrücken (Abbildung 2). Um festzustellen, ob Salze die Ergebnisse der Ionenleckage beeinflussen, könnte der Experimentator die Leitfähigkeit der negativen Kontrolle und der Probe in Abwesenheit einer Blattscheibe testen, um festzustellen, ob die Probe oder das Blatt Veränderungen in der Leitfähigkeit verursacht. Um festzustellen, ob Lösungsmittel die Peroxidase-Reaktionen beeinflussen, kann der Experimentator flg22 zur negativen Kontrolle hinzufügen und das Ergebnis mit dem in Wasser gelösten flg22 vergleichen, um festzustellen, ob es einen Unterschied gibt. Es ist möglich, dass Lösungsmittel, getönte Verbindungen oder übermäßige Salze in einer negativen Kontrolle die Auswirkungen von MSM auf die beschriebenen Pflanzenstressreaktionen verdecken könnten, weshalb dieser Ansatz nicht in allen Szenarien geeignet ist.

Stichprobenzeit
Es ist wichtig, die Behandlung morgens einzuleiten, da die induzierbaren Abwehrreaktionen einem zirkadianen Zyklus folgen und die höchste Amplitude am frühen Morgen,27 Uhr, haben. Nach unserer Erfahrung verursacht Arabidopsis Ionenverlust als Reaktion auf Gramillin schneller (4 H) als Gerste und Mais (4–7 Stunden), weshalb ein Zeitverlauf erforderlich sein kann, um experimentelleParameter 2,28 zu etablieren. Die Zellreaktion nimmt mit der Zeit ab, und wir empfehlen nicht, Stressreaktionen länger als 30+ Stunden nach der Behandlung zu testen.

Konzentration
Die MSM-Konzentration kann einen nichtlinearen Einfluss auf die Auslösung von Pflanzenstressreaktionen haben, was ein Phänomen namens Hormesis20 ist. Je nach Verfügbarkeit und Löslichkeit des MSM würden die Experimentatoren idealerweise die Stressreaktionen der Pflanzen über verschiedene MSM-Konzentrationen hinweg testen. Typische Konzentrationen liegen zwischen 100 nM und 1.000 μM als Ausgangspunkt 2,11,20.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finanzielle Unterstützung wurde im Rahmen der Sustainable Canadian Agricultural Partnership (#20230098), einer Bundes-Provinz-Territorialinitiative, bereitgestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-AminosalicylsäureMillipore Sigma A79809
Barnart-VakuumpumpeArtisan Technology Group400-3910
COND-905 MikroleitfähigkeitssondeLazar Research Laboratories Inc.
FLG22-PeptidAnaSpecAS-62633
Infinite 200PRO FTeCan Group Ltd.30190086
SurfaktSigma-AldrichS3523
T-2-ToxinCayman Chemical Company Inc20433

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annu Rev Phytopathol. 55 (1), 109-137 (2017).
  2. Brauer, E. K., et al. A cyclic lipopeptide from Fusarium graminearum targets plant membranes to promote virulence. Cell Rep. 43 (7), 114384(2024).
  3. Thoms, D., et al. Innate immunity can distinguish beneficial from pathogenic rhizosphere microbiota. bioRxiv. , (2023).
  4. Nishiuchi, T., et al. Fusarium phytotoxin trichothecenes have an elicitor-like activity in Arabidopsis thaliana, but the activity differed significantly among their molecular species. Mol Plant Microbe Interact. 19 (5), 512-520 (2006).
  5. Schellenberger, R., et al. Apoplastic invasion patterns triggering plant immunity: plasma membrane sensing at the frontline. Mol Plant Pathol. 20 (11), 1602-1616 (2019).
  6. Henry, G., Deleu, M., Jourdan, E., Thonart, P., Ongena, M. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses. Cell Microbiol. 13 (11), 1824-1837 (2011).
  7. Pršić, J., et al. Mechanosensing and sphingolipid-docking mediate lipopeptide-induced immunity in Arabidopsis. bioRxiv. , (2023).
  8. Crouzet, J., et al. Biosurfactants in plant protection against diseases: rhamnolipids and lipopeptides case study. Front Bioeng Biotechnol. 8, 1014(2020).
  9. Khan, P., et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 173, 333-355 (2014).
  10. Schenk, S. T., Schikora, A. Staining of callose depositions in root and leaf tissues. Bio-protoc. 5 (6), e1429(2015).
  11. Mott, G. A., Desveaux, D., Guttman, D. S. A high-sensitivity, microtiter-based plate assay for plant pattern-triggered immunity. Mol Plant Microbe Interact. 31 (5), 499-504 (2018).
  12. Hatsugai, N., Katagiri, F. Quantification of plant cell death by electrolyte leakage assay. Bio-protoc. 8 (5), e2758(2018).
  13. Zhang, X. H., Yu, X. Z., Yue, D. M. Phytotoxicity of dimethyl sulfoxide (DMSO) to rice seedlings. Int J Environ Sci Technol. 13, 607-614 (2016).
  14. Mannan, A., et al. DMSO triggers the generation of ROS leading to an increase in artemisinin and dihydroartemisinic acid in Artemisia annua shoot cultures. Plant Cell Rep. 29, 143-152 (2010).
  15. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant J. 18 (3), 265-276 (1999).
  16. Jourdan, E., et al. Insights into the defense-related events occurring in plant cells following perception of surfactin-type lipopeptide from Bacillus subtilis. Mol Plant Microbe Interact. 22 (4), 456-468 (2009).
  17. Raaijmakers, J. M., De Bruijn, I., Nybroe, O., Ongena, M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1037-1062 (2010).
  18. vábová, L., Lebeda, A. In vitro selection for improved plant resistance to toxin-producing pathogens. J Phytopathol. 153 (1), 52-64 (2005).
  19. Mousa, W. K., Raizada, M. N. The diversity of antimicrobial secondary metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 4, 65(2013).
  20. Bektas, Y., Eulgem, T. Synthetic plant defense elicitors. Front Plant Sci. 5, 804(2015).
  21. Saeed, B., Trujillo, M. Analysis of immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Environ Responses Plants: Methods Protoc. , 339-346 (2022).
  22. Brauer, E. K., et al. Transcriptional and hormonal profiling of Fusarium graminearum-infected wheat reveals an association between auxin and susceptibility. Physiol Mol Plant Pathol. 107, 33-39 (2019).
  23. Taylor, P. The wetting of leaf surfaces. Curr Opin Colloid Interface Sci. 16 (4), 326-334 (2011).
  24. Mika, A., Boenisch, M. J., Hopff, D., Lüthje, S. Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. J Exp Bot. 61 (3), 831-841 (2010).
  25. Brauer, E. K., et al. Transcriptional profiling and genetic mapping of barley responses to bacterial flagellin. Mol Plant Microbe Interact. 38 (2), 344-352 (2025).
  26. Takáč, T., et al. TALEN-based HvMPK3 knock-out attenuates proteome and root hair phenotypic responses to flg22 in barley. Front Plant Sci. 12, 666229(2021).
  27. Kim, M. G., Macoy, D. M., Lee, J. Y., Cha, J. Y., Kim, W. Y. Interactions between plant immunity, temperature, light, and circadian rhythm. J Plant Biochem Physiol. 9, 260(2021).
  28. Bahadoor, A., et al. Gramillin A and B: cyclic lipopeptides identified as the nonribosomal biosynthetic products of Fusarium graminearum. J Am Chem Soc. 140 (48), 16783-16791 (2018).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Interaktionen zwischen Pflanzen und MikrobenBlattdiskuss AssayIonenaustrittPeroxidase Aktivit tCallose Produktion96 Well PlatteArabidopsis Bl tterGerstenbl tterPopulationsgenetik

Verwandte Artikel