Etablierung und Evaluierung eines Candida albicans-induzierten Extrakt-induzierten Mausmodells der Kawasaki-Krankheit-assoziierten Koronararteriitis

Die Kawasaki-Krankheit (KD), eine Form des mukokutanen Lymphknotensyndroms, ist eine Autoimmunerkrankung, die bei Kindern unter 5 Jahren auftritt und von einer fieberhaften Vaskulitis begleitet wird ^1,2,3. Studien deuten darauf hin, dass unbehandelte oder Behandlungsverläufe, die länger als 10 Tage bei schwerer KD verlaufen, anfällig für schwerwiegende kardiovaskuläre Komplikationen sind, vor allem einschließlich Koronarangorysmen und Koronararterienstenose ^4,5. Die Ruptur von koronaren Aneurysmen kann zu einem kardiogenen Schock oder sogar zum plötzlichen Tod führen, was die Hauptursache für erworbene Herzerkrankungen bei Kindern ist ^6,7. Obwohl die Anwendung von intravenösem Immunglobulin die Prognose signifikant verbessert hat, sind seine Ätiologie und Pathogenese nach wie vor unklar, was die Entwicklung zielgerichteter therapeutischer Strategien einschränkt ^8,9. Daher ist die Etablierung von Tiermodellen, die die Merkmale menschlicher Krankheiten genau simulieren können, zu einem dringenden Bedarf für die aktuelle Forschung geworden.

Derzeit ist ein großes Hindernis in der Erforschung der Kawasaki-Krankheit das Fehlen gut charakterisierter Tiermodelle, die die Pathologie menschlicher Krankheiten vollständig rekapitulieren. Unter den verschiedenen Modellen, die jetzt entwickelt wurden, ist das Vaskulitis-Modell, das durch Lactobacillus casei Zellwandextrakt (LCWE) induziert wird, ein relativ ausgereiftes System, und dieses Modell kann eine koronare Arteriitis verursachen. Es wird häufig verwendet, um den Mechanismus der Immundysregulation und spezifischer Zytokine in KD-ähnlichen Vaskulitiden zu untersuchen^10,11. Das Vaskulitis-Modell, das durch den wasserlöslichen Extrakt von Candida albicans (CAWS) induziert wird, hat aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit den pathologischen Merkmalen der menschlichen Kawasaki-Krankheit ebenfalls viel Aufmerksamkeit erregt^12,13. Nach systematischer Optimierung und Verbesserung durch mehrere Forschungsteams hat sich das CAWS-induzierte Modell zu einem wichtigen Werkzeug für die Erforschung der Kawasaki-Krankheit^{entwickelt 14}. Obwohl CAWS durch intraperitoneale Injektion eine Entzündung der Koronararterien induzieren kann, hat es insofern Einschränkungen, als es den genauen pathologischen Prozess der menschlichen KD-Vaskulitis nicht vollständig reproduzieren kann. Zum Beispiel wurden in der späten Pathologie von humanem KD¹⁵ keine Neutrophilen gefunden, aber die Neutrophileninfiltration trat in diesem Modell noch bis zu 16 Wochen nach der CAWS-Injektion^{auf 16}. Darüber hinaus ist der Mechanismus der durch CAWS verursachten Vaskulitis derzeit noch nicht vollständig geklärt, was das tiefgreifende Verständnis und die Anwendung des Modells^{einschränkt 9}. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Tiermodell für KD zu etablieren, indem das Induktionsprotokoll von CAWS optimiert, der Krankheitsmechanismus aufgeklärt und die Entwicklung zielgerichteter Therapien erleichtert wird.

In dieser Studie wurde CAWS verwendet, um ein standardisierteres Tiermodell der Kawasaki-Krankheit zu etablieren. Durch systematische Dosisoptimierungsexperimente wurde festgestellt, dass eine intraperitoneale Injektion von 8 mg täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen das optimale Verabreichungsschema war. Dieses Schema kann stabil Koronararterienläsionen induzieren und gleichzeitig eine hohe Überlebensrate bei Tieren aufrechterhalten. Darüber hinaus untersuchten wir die Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei der Bildung von Fibrose während der chronischen Phase der KD, wobei der Schwerpunkt auf dem möglichen Mechanismus des spannungsabhängigen Anionenkanals 1 (VDAC1), einem Schlüsselprotein, das die mitochondriale Apoptose reguliert, während des Übergangs von Entzündung zu Fibrose^{lag 17}. Es ist erwähnenswert, dass durch die Analyse der Autophagosom/Lysosomen-Kolokalisation in dieser Studie in diesem Modell eine abnormale Autophagiefunktion beobachtet wurde. Dieses optimierte Modell stellt ein wichtiges Werkzeug dar, um die Pathogenese von Koronararterienläsionen bei der Kawasaki-Krankheit systematisch zu untersuchen und neue Behandlungsstrategien zu evaluieren.

Alle Forschungsversuche mit Tierversuchen wurden von der Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University genehmigt (KY-2024-250-01). Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des CAWS

1. Candida albicans in Sabouraud-Dextrosebrühe nach dem etablierten Protokoll von Duong et ^al.18 impfen. Anschließend wird die inokulierte Bouillon 48 h lang bei 37 °C in einer verschlossenen anaeroben Kammer mit einem Gasgemisch anaerob kultiviert.
   HINWEIS: Um die Sterilität des Nährmediums zu gewährleisten, müssen die anaeroben Kulturbedingungen bei 37 °C streng kontrolliert werden, um eine Kontamination durch verschiedene Bakterien zu verhindern.
2. Wiederholt mit C-begrenzendem Medium spülen und bei 37 °C für 48 h bei einer Drehzahl von 4,5 x g inkubieren.
3. Geben Sie die gleiche Menge wasserfreies Ethanol hinzu und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C stehen.
4. Bei 4,5 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen, dem Niederschlag die gleiche Menge wasserfreies Ethanol zugeben und über Nacht bei 4 °C stehen lassen.
5. Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen, 50 ml Aceton zum Niederschlag geben, zentrifugieren und den Niederschlag trocknen. Lösen Sie den Niederschlag für die spätere Verwendung in steriler normaler Kochsalzlösung auf.

2. Konstruktion eines Mausmodells der Kawasaki-Krankheit

1. Wählen Sie achtzig männliche C57BL/6-Mäuse mit Lichtschutzfaktor im Alter von 4-6 Wochen aus und halten Sie sie unter kontrollierten Bedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
   HINWEIS: Um die potenzielle Beeinflussung der Immun- und Entzündungsreaktionen durch Schwankungen des Östrogenspiegels zu minimieren, wurden in dieser vorläufigen Modellstudie zur Etablierung und Charakterisierung nur männliche Mäuse verwendet¹⁹.
2. Teilen Sie die Mäuse gleichmäßig nach der Zufallszahlentabellenmethode in 4 Gruppen ein, einschließlich 3 CAWS-Injektionsgruppen mit unterschiedlichen Dosen (4 mg, 8 mg, 12 mg) und 1 Kontrollgruppe mit normaler Kochsalzlösung mit 20 Mäusen in jeder Gruppe.
3. Bereiten Sie CAWS-Pulver in drei Konzentrationen von 40 mg/ml, 80 mg/ml und 120 mg/ml unter Verwendung von steriler normaler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) vor. Injizieren Sie der Versuchsgruppe morgens vom 1. bis zum 5. Versuchstag 0,1 ml CAWS und verabreichen Sie der Kontrollgruppe nach demselben Schema das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Die intraperitoneale Injektion wurde mit einer 1-ml-Insulinspritze durchgeführt. Positionieren Sie die Maus während der Operation mit dem Kopf nach unten und dem Schwanz nach oben, um eine Schädigung von Organen wie Dick- und Dünndarm beim Einführen der Spritze zu vermeiden.
4. Verwenden Sie täglich um 9 Uhr eine elektronische Waage, um gleichzeitig das verbleibende Futter im Futterautomaten zu wiegen und den 24-Stunden-Futterverbrauch für jeden Mäusekäfig zu berechnen.
5. Wählen Sie am 3., 7., 14. und 28. Tag nach der letzten Injektion nach dem Zufallsprinzip 3 Mäuse aus jeder Gruppe aus und opfern Sie sie zu jedem Zeitpunkt.
6. Setzen Sie die Mäuse in eine geschlossene, mit Raumluft vorgefüllte Kammer. Komprimiertes CO₂ mit einer Durchflussrate von 30 % des Kammervolumens pro Minute einleiten. Nach 5 Minuten wurde eine zervikale Dislokation durchgeführt, um den Tod zu bestätigen.
7. Sammeln und wiegen Sie Herzproben. Beobachten Sie entzündliche Läsionen des Herzens und der Blutgefäße durch HE-Färbung.

3. HE-Färbe- und Sortierstandards

1. Das Herz und der Aortenbogen (ca. 3 mm × 3 mm) wurden rasch isoliert. Es wird eine mediane Sternotomie nach der beschriebenen Methode²⁰ durchgeführt. Trennen Sie schnell das Herz vom Aortenbogen (ca. 3 mm × 3 mm). Die entnommenen Gewebe wurden 24 h lang in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert.
2. Nach der Fixierung dehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Ethanolserie (70 % Ethanol für 1 h, 80 % Ethanol für 1 h, 95 % Ethanol für 1 h und 100 % Ethanol für 1 h), klar in Xylol und eingebettet in Paraffin. Zum Schluss werden die Blöcke in 5 μm große Endlosscheiben geschnitten.
3. Für die H&E-Färbung färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylin, spülen Sie sie 10 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, färben Sie sie 2 Minuten lang mit Eosin und fahren Sie dann mit der Dehydrierung und Montage^{fort 21}.
   HINWEIS: Je nach Grad der vaskulären Intimaverletzung wird sie in drei Grade eingeteilt: Grad I ist hauptsächlich durch endotheliale Schwellung und Neutrophilenaggregation gekennzeichnet; Grad II manifestiert sich als Degeneration der glatten Muskulatur, Infiltration von Entzündungszellen und Organellenschäden; Grad III zeigt schwere Läsionen wie Endothelnekrose und -ablösung sowie Fibringerablagerungen.

4. Masson-Trichrom-Färbung

1. Nach der Fixierung werden die Gewebeproben durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, die in Xylol klar ist und in Paraffin eingebettet ist.
2. Nach dem Entparaffinieren hydratisieren Sie die Schnitte durch eine abgestufte Ethanolreihe mit destilliertem Wasser, um sie für die Färbung vorzubereiten.
3. Färben Sie die Zellkerne 5 Minuten lang mit Weigert's Eisen Hämatoxylin, spülen Sie es gründlich unter fließendem Wasser ab und färben Sie dann das Zytoplasma 5 Minuten lang mit Lichun Red acid Fuchsin.
4. Differenzieren Sie 1 min lang mit 1% Phosphomolybdsäure, färben Sie die Kollagenfasern dann 3 min lang direkt mit Anilinblau. Rasch mit 1 % Eisessig nachspülen.
   HINWEIS: Kontrollieren Sie den Zeitpunkt des Differenzierungsschritts streng, um die Spezifität der Färbung sicherzustellen.
5. Nach der Dehydrierung mit Ethanol und Xylol, die transparent werden, versiegeln Sie den neutralen Film.
6. Spülen Sie die fleckigen Abschnitte unter fließendem Wasser ab, um überschüssige Farbe zu entfernen.
7. Die Schnitte werden durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, die in Xylol geklärt ist, und mit neutralem Gummi montiert.
8. Betrachten Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop bei gleichbleibender Vergrößerung. Kollagenfasern sollten blau, Muskelfasern und Zytoplasma rot und Zellkerne tiefblau erscheinen.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Fixieren Sie Zell- oder Gewebeschnitte und blockieren Sie 1 h lang mit 5 % BSA, um unspezifische Bindungen zu reduzieren.
2. Verwenden Sie normales Serum aus der gleichen Spezies wie der Sekundärantikörper, verdünnen Sie es mit PBS im Verhältnis 1:10 und tropfen Sie es auf die Probe. Bei Raumtemperatur 30 min verschließen. Nach dem Versiegeln zweimal vorsichtig mit PBS nachspülen.
3. Die Schnitte werden mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS den fluoreszierenden Sekundärantikörper zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
4. Färben des Kerns mit DAPI, Versiegeln mit Anti-Quenching-Eindeckmittel und Betrachten unter konfokaler Mikroskopie.

6. Immunhistochemie

1. Nach dem Entparaffinieren und der Hydratation der Paraffinschnitte ist eine Antigenreparatur durchzuführen und die endogene Peroxidase zu blockieren.
2. Antikörperinkubation und Farbentwicklung: Zuerst mit normalem Serum blockieren, dann den Primärantikörper und den HRP-markierten Sekundärantikörper nacheinander inkubieren und schließlich die DAB-Farbentwicklung. Kontrollieren Sie den Reaktionsgrad unter dem Mikroskop.
3. Färben Sie die Zellkerne erneut mit Hämatoxylin. Nach der Dehydrierung und Transparenz verschließen Sie die Platten und beobachten das bräunlich-gelbe positive Signal unter dem Mikroskop.
   HINWEIS: Für das Experiment müssen Steuerelemente eingerichtet und die Bedingungen für die Wiederherstellung und Farbentwicklung streng kontrolliert werden.

7. Nachweis von Autolysosomen

1. RAW264.7-Makrophagen werden mit Candida albicans-Sporen in einem geeigneten Verhältnis (10:1) cokultiviert und bei 37 °C und 5 % CO₂ für 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h und 48 h inkubiert, um ein phagozytäres Modell zu etablieren.
2. Waschen Sie dreimal mit vorgekühltem PBS, um die unphagozytären Sporen zu entfernen.
3. Zuerst werden die Proben mit 5% BSA für 30 min blockiert. Inkubieren Sie dann nacheinander mit dem Primärantikörper gegen LC3 (1:200 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 1 h, gefolgt von dem Alexa Fluor 488-markierten Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
4. Geben Sie die Lysosomensonde Lysosom Lysosom Lysosom Lysosom direkt in die Zellen, um die lysosomale Lokalisation zu visualisieren. Zum Schluss wird die Zellkerne 5 min lang mit DAPI (1 μg/ml) gegengefärbt.
   HINWEIS: Der gesamte Operationsprozess sollte im Dunkeln durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Inkubationszeit und die Konzentration des Antikörpers genau kontrolliert werden.

Zunächst untersuchten wir systematisch die myokardialen pathologischen Veränderungen, die durch unterschiedliche Dosen von CAWS bei Mäusen induziert wurden. In der PBS-Kontrollgruppe, der 4 mg CAWS-Gruppe und der 8 mg CAWS-Gruppe wurden keine Todesfälle beobachtet (n = 20 in jeder Gruppe). Im Gegensatz dazu war die Entzündungsreaktion in der 4-mg-Gruppe mild und entsprach nicht den Modellierungsanforderungen. Die Mortalitätsrate war in der 12-mg-CAWS-Gruppe höher (9/20, 45%), und die Todesfälle traten zwischen dem 3. und dem 10. Tag nach der Injektion auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Dosis von 12 mg eine übermäßige lokale Entzündungsschädigung und systemische Toxizität verursachen kann. Daher wurde diese Dosis aus nachfolgenden Studien ausgeschlossen. Die Dosis von 8 mg wurde schließlich als optimales Dosierungsschema gewählt, da sie bei gleichzeitiger Beibehaltung einer akzeptablen Überlebensrate und minimaler lokaler Nebenwirkungen eine signifikante Koronararteriitis wirksam induzieren konnte. (Abbildung 1A). Schließlich wurde festgestellt, dass die intraperitoneale Injektion von 8 mg CAWS die optimale Modellierungsdosis war. Die HE-Färbeergebnisse der Versuchsgruppe zeigten einen typischen dynamischen Prozess von Entzündung und Fibrose. Am dritten Tag kam es zu einer fokalen inflammatorischen Infiltration, die hauptsächlich aus perivaskulären Neutrophilen und Monozyten bestand. Am siebten Tag dehnte sich der Entzündungsbereich auf das Myokardinterstitium aus, begleitet von einer signifikanten Schwellung der Myokardzellen und einem interstitiellen Ödem. Am 14. Tag erreichte die Entzündung ihren Höhepunkt, und es kam zu einer Störung der Myokardfaseranordnung und einer fokalen Nekrose. Am 28. Tag war die Entzündung zwar gelindert, aber es hatte sich eine frühe Fibrose gebildet (Abbildung 1B und Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu blieb die Myokardstruktur in der Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt normal. Alle Ergebnisse wurden durch eine Doppelblindbewertung bestätigt, die bestätigte, dass eine Dosis von 8 mg CAWS stabil ein Myokardverletzungsmodell induzieren konnte, das mit den Merkmalen der Kawasaki-Krankheit übereinstimmte.

Anschließend wurde mit der Masson-Tricolor-Färbemethode untersucht, ob eine CAWS-induzierte Vaskulitis der Kawasaki-ähnlichen Vaskulitis zu einer persistierenden Fibrose um die Koronararterien (CA) führen würde. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass in der CAWS-Injektionsgruppe von Mäusen offensichtliche Kollagenfaserablagerungen um die Wände der entzündeten Koronararterien und der Aorta nachgewiesen wurden, und diese fibrotischen Bereiche stimmten stark mit den Verteilungsorten der Infiltration von Entzündungszellen überein. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse in der PBS-Kontrollgruppe nur eine schwache Kollagenfärbung, die im normalen strukturellen Bereich der Gefäßwand lag (Abbildung 2A). Die quantitative Analyse zeigte, dass nach 14 Tagen eine signifikante Ablagerung von Kollagenfasern auftrat und sich der Grad der Fibrose statistisch von dem der Kontrollgruppe unterschied (Abbildung 2C).

Angesichts der Tatsache, dass die zentrale pathologische Veränderung bei der Kawasaki-Krankheit die immun-inflammatorische Reaktion der Gefäßwand ist, die die koordinierte Wirkung mehrerer Immunzellen beinhaltet22,23, untersuchten wir als nächstes die charakteristischen Veränderungen der Immunmikroumgebung im CAWS-Modell durch Immunfluoreszenz (IF)-Färbung. Am 14. Tag nach der CAWS-Injektion wurde eine IF-Färbung von Immunzellmarkern am Herzgewebe von Mäusen durchgeführt, denen CAWS injiziert worden war. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass am 14. Tag der Modellierung für Mäuse in der CAWS-Behandlungsgruppe die Infiltration von CD3+ T-Zellen, CD8+ zytotoxischen T-Zellen, CD86+ M1-Typ-Makrophagen, F4/80+ Makrophagen und NK1.1+ natürlichen Killerzellen in Koronararterien und Myokardgewebe im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe signifikant erhöht war (Abbildung 2B,D). Durch die systematische Analyse der Expressionsänderungen dieser Immunmarker wurde nicht nur nachgewiesen, dass das CAWS-Modell die immunologischen Eigenschaften der menschlichen Kawasaki-Krankheit genau simulieren kann, sondern vor allem der mögliche Mechanismus verschiedener Immunzelluntergruppen beim Auftreten und der Entwicklung der Krankheit aufgedeckt, was eine theoretische Grundlage für die anschließende Entwicklung gezielter Immuninterventionsstrategien liefert.

Die Forschung hat gezeigt, dass die mitochondriale Dysfunktion ein Schlüsselmechanismus ist, der der Myokardfibrose zugrunde liegt 24,25,26. Es ist bekannt, dass der spannungsabhängige Anionenkanal 1 (VDAC1), ein kritisches Protein für die mitochondriale Qualitätskontrolle, unter entzündlichem Stress eine abnormale Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTP) auslösen kann, wenn seine Expression hochreguliert wird. Dies wiederum induziert die Apoptose und aktiviert Fibroblasten17,27. Um diesen Mechanismus zu untersuchen, haben wir die VDAC1-Expression in der chronischen Phase mittels Immunhistochemie untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die VDAC1-Proteinexpression im Myokardgewebe von Mäusen in der mit CAWS behandelten Gruppe im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe 28 Tage nach der Modellierung signifikant erhöht war (Abbildung 3). Positive Signale waren überwiegend in fibrotischen Bereichen und um Blutgefäße herum lokalisiert, was darauf hindeutet, dass eine VDAC1-vermittelte mitochondriale Dysfunktion zur Myokardfibrose im Kawasaki-Krankheitsmodell beitragen kann. Diese Daten liefern experimentelle Hinweise auf die molekularen Mechanismen der CAWS-induzierten Myokardschädigung.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die VDAC1-vermittelte mitochondriale Dysfunktion am Myokardfibroseprozess der Kawasaki-Krankheit beteiligt ist, aber ihr spezifischer Mechanismus ist noch nicht geklärt. Angesichts der Tatsache, dass die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase von der normalen Funktion des Autophagie-Lysosomensystems abhängt. Wir spekulieren, dass VDAC1 die Fibrose verschlimmern kann, indem es die Bildung oder Funktion von Autophagolysosomen beeinflusst, was zu einer abnormalen Mitochondrienakkumulation führt. Um diese Hypothese zu verifizieren, etablierten wir zunächst ein Candida albicans-Sporeninfektionsmodell in Makrophagen (RAW264.7) (Abbildung 4) und detektierten die dynamischen Veränderungen des autophagischen Flusses und der lysosomalen Aktivität im Modell. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Bildung von Autophagie-Lysosomen im Frühstadium (innerhalb von 2-3 h nach der Zellinfektion) zunimmt, während der Autophagenfluss im späteren Stadium (3-4 h nach der Zellinfektion) blockiert wird. Die Veränderung des Autophagieflusses kann durch die Änderung der Merge-Färbung nach der Kolokalisation von Autophagosom und Lysosom beurteilt werden. Dieses Ergebnis bestätigt, dass eine Dysfunktion der Autophagolysosomen tatsächlich zu einer Beeinträchtigung der zellulären Clearance führen kann.

Abbildung 1: Histopathologische Analyse des Herzens und der Koronararterien. (A) Überlebenskurven von Mäusen, denen PBS oder verschiedene Dosen von CAWS injiziert wurden (4 mg, 8 mg und 12 mg; n = 20 pro Gruppe). (B) Die HE-Färbeergebnisse des Herzens in der CAWS-Behandlungsgruppe (8 mg) zu verschiedenen Zeitpunkten (3 Tage, 7 Tage, 14 Tage, 28 Tage) wurden vorgestellt. Maßstabsbalken: 1500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Analyse der Kollagenfibrose und der Infiltration von Immunzellen. (A) Die Masson-Färbeergebnisse der CAWS 8 mg-Gruppe und der Kontrollgruppe. Die Kollagenfasern haben eine charakteristische blaue Farbe, die Muskelfasern und das Zytoplasma sind rot und der Zellkern ist dunkelblau. Pfeile zeigen Pilzsporen an. Maßstabsbalken: 1500 μm. (B) Immunfluoreszenz-Färbeergebnisse der CAWS 8 mg-Gruppe und der Kontrollgruppe (CD3-markierte CD3+ T-Zellen, CD8-markierte CD8+ zytotoxische T-Zellen, CD86-markierte CD86+ M1-Makrophagen, F4/80-markierte F4/80+-Makrophagen und NK1.1-markierte NK1.1+ natürliche Killerzellen). Maßstabsbalken: 200 μm. (C) Beurteilen Sie den Grad der Herzfibrose. Der Grad der Herzfibrose wurde anhand des prozentualen Anteils der trichromatischen Färbefläche im Herzgewebe des Gesichtsfeldes bei 800-facher Vergrößerung bewertet. Die spezifische Methode ist wie folgt: Da Kollagenfasern mit makromolekularen anionischen Farbstoffen hellgrün gefärbt werden, wurden 100 Gesichtsfelder bei 800-facher Vergrößerung (alle Scheiben mit einer Dicke von 5 μm) beobachtet, und der Grad der Herzfibrose wurde durch den prozentualen Anteil der grünen Fläche an der Gesamtfläche bestimmt. Je höher der Prozentsatz, desto schwerer die Fibrose. (D) Der prozentuale Anteil der Immunzellen wurde statistisch anhand der Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung analysiert,***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Immunhistochemische Analyse der VDAC1-Expression in der PBS-Gruppe und der CAWS-Gruppe am Tag 28. (A) Immunhistochemische Analyse der VDAC1-Expression. Maßstab: 800 μm. Braun-schwarze Partikel sind positive Ergebnisse. (B) Statistische Analyse des Prozentsatzes der immunhistochemisch positiven VDAC1-Zellen, p < 0,001. (C) Statistische Analyse des H-Scores der VDAC1-Immunhistochemie. Die Daten wurden aus mehreren biologischen Replikaten abgeleitet (n = 20 Mäuse pro Gruppe), und die Ergebnisse wurden als mittlere ± Standardabweichung ausgedrückt und statistisch analysiert (***p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Nachweis von Autolysosomen nach der Phagozytose von Candida albicans durch Maus-RAW264.7-Zellen. (A) Pfeile zeigen Pilzsporen. Maßstabsleisten: 25 μm. Die Veränderung des Autophagieflusses kann durch die Änderung der Merge-Färbung nach der Kolokalisation von Autophagosom und Lysosom beurteilt werden. (B) Eine Zeitverlaufsanalyse der Autolysosomenbildungsrate quantifiziert relevante Parameter. Die Ergebnisse wurden als mittlere ± Standardabweichung ausgedrückt und statistisch ausgewertet (***p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.