Etablierung und Evaluierung eines Candida albicans-induzierten Extrakt-induzierten Mausmodells der Kawasaki-Krankheit-assoziierten Koronararteriitis

Zusammenfassung

Das CAWS-induzierte Mausmodell simuliert effektiv das Fortschreiten der Kawasaki-Krankheit von einer akuten Entzündung zu einer chronischen Fibrose, zeigt wichtige pathologische und immunpathologische Merkmale auf und kann die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien für die Kawasaki-Krankheit erleichtern.

Zusammenfassung

Die Kawasaki-Krankheit (KD) ist eine systemische Vaskulitis, die hauptsächlich Kinder betrifft, wobei die Läsionen der Koronararterien die schwerwiegendste Komplikation darstellen. In dieser Studie wurde ein optimiertes Maus-KD-Modell unter Verwendung des wasserlöslichen Extrakts von Candida albicans (CAWS) etabliert. Myokardentzündungen und damit verbundene pathologische Veränderungen wurden mittels HE-Färbung und Masson-Trichrom-Färbung bewertet. Die Immunfluoreszenztechnik detektierte die Infiltration von Immunzellen in Herzgewebe. Die Expression und Lokalisation des VDAC1-Proteins im Myokardgewebe wurde immunhistochemisch nachgewiesen. In vitro wurde ein phagozytisches Modell durch Co-Kultivierung von RAW264.7-Makrophagen mit Candida albicans-Sporen etabliert, und die Bildung und Funktion von Autophagolysosomen wurde mittels LC3-Immunfluoreszenzfärbung und einer Lyso-Tracker-Red-Sonde untersucht. Durch Dosis-Screening wurde festgestellt, dass 8 mg die optimale Modellierungsdosis für die Induktion einer Koronararterienentzündung war, mit einer moderaten Mortalitätsrate bei dieser Dosis. Die HE-Färbung zeigte, dass die CAWS-Injektion stabil Koronararterienläsionen induzierte, die mit den Merkmalen der menschlichen Kawasaki-Krankheit bei Mäusen übereinstimmten. Die Masson-Färbung bestätigte, dass es in der CAWS-Gruppe von Mäusen eine signifikante Ablagerung von Kollagenfasern um die Koronararterien und die Aorta gab, die eng mit dem Entzündungsbereich übereinstimmte, und es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe nach 14 Tagen beobachtet (p < 0,001). Die Immunfluoreszenz zeigte, dass am 14. Tag der Modellierung die Infiltration mehrerer Immunzellen in das Herzgewebe der CAWS-Gruppe signifikant zugenommen hatte (p < 0,001). Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, dass am 28. Tag der Modellierung die Expression des VDAC1-Proteins im Myokardgewebe der CAWS-Gruppe signifikant hochreguliert war (p < 0,001). In-vitro-Experimente haben gezeigt, dass bei Makrophagen, die mit Candida albicans-Sporen infiziert sind, die Bildung von Autophagolysosomen im Frühstadium zunimmt, während der Autophagenfluss im späteren Stadium blockiert wird, was auf eine Funktionsstörung hindeutet.

Einleitung

Die Kawasaki-Krankheit (KD), eine Form des mukokutanen Lymphknotensyndroms, ist eine Autoimmunerkrankung, die bei Kindern unter 5 Jahren auftritt und von einer fieberhaften Vaskulitis begleitet wird ^1,2,3. Studien deuten darauf hin, dass unbehandelte oder Behandlungsverläufe, die länger als 10 Tage bei schwerer KD verlaufen, anfällig für schwerwiegende kardiovaskuläre Komplikationen sind, vor allem einschließlich Koronarangorysmen und Koronararterienstenose ^4,5. Die Ruptur von koronaren Aneurysmen kann zu einem kardiogenen Schock oder sogar zum plötzlichen Tod führen, was die Hauptursache für erworbene Herzerkrankungen bei Kindern ist ^6,7. Obwohl die Anwendung von intravenösem Immunglobulin die Prognose signifikant verbessert hat, sind seine Ätiologie und Pathogenese nach wie vor unklar, was die Entwicklung zielgerichteter therapeutischer Strategien einschränkt ^8,9. Daher ist die Etablierung von Tiermodellen, die die Merkmale menschlicher Krankheiten genau simulieren können, zu einem dringenden Bedarf für die aktuelle Forschung geworden.

Derzeit ist ein großes Hindernis in der Erforschung der Kawasaki-Krankheit das Fehlen gut charakterisierter Tiermodelle, die die Pathologie menschlicher Krankheiten vollständig rekapitulieren. Unter den verschiedenen Modellen, die jetzt entwickelt wurden, ist das Vaskulitis-Modell, das durch Lactobacillus casei Zellwandextrakt (LCWE) induziert wird, ein relativ ausgereiftes System, und dieses Modell kann eine koronare Arteriitis verursachen. Es wird häufig verwendet, um den Mechanismus der Immundysregulation und spezifischer Zytokine in KD-ähnlichen Vaskulitiden zu untersuchen^10,11. Das Vaskulitis-Modell, das durch den wasserlöslichen Extrakt von Candida albicans (CAWS) induziert wird, hat aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit den pathologischen Merkmalen der menschlichen Kawasaki-Krankheit ebenfalls viel Aufmerksamkeit erregt^12,13. Nach systematischer Optimierung und Verbesserung durch mehrere Forschungsteams hat sich das CAWS-induzierte Modell zu einem wichtigen Werkzeug für die Erforschung der Kawasaki-Krankheit^{entwickelt 14}. Obwohl CAWS durch intraperitoneale Injektion eine Entzündung der Koronararterien induzieren kann, hat es insofern Einschränkungen, als es den genauen pathologischen Prozess der menschlichen KD-Vaskulitis nicht vollständig reproduzieren kann. Zum Beispiel wurden in der späten Pathologie von humanem KD¹⁵ keine Neutrophilen gefunden, aber die Neutrophileninfiltration trat in diesem Modell noch bis zu 16 Wochen nach der CAWS-Injektion^{auf 16}. Darüber hinaus ist der Mechanismus der durch CAWS verursachten Vaskulitis derzeit noch nicht vollständig geklärt, was das tiefgreifende Verständnis und die Anwendung des Modells^{einschränkt 9}. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Tiermodell für KD zu etablieren, indem das Induktionsprotokoll von CAWS optimiert, der Krankheitsmechanismus aufgeklärt und die Entwicklung zielgerichteter Therapien erleichtert wird.

In dieser Studie wurde CAWS verwendet, um ein standardisierteres Tiermodell der Kawasaki-Krankheit zu etablieren. Durch systematische Dosisoptimierungsexperimente wurde festgestellt, dass eine intraperitoneale Injektion von 8 mg täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen das optimale Verabreichungsschema war. Dieses Schema kann stabil Koronararterienläsionen induzieren und gleichzeitig eine hohe Überlebensrate bei Tieren aufrechterhalten. Darüber hinaus untersuchten wir die Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei der Bildung von Fibrose während der chronischen Phase der KD, wobei der Schwerpunkt auf dem möglichen Mechanismus des spannungsabhängigen Anionenkanals 1 (VDAC1), einem Schlüsselprotein, das die mitochondriale Apoptose reguliert, während des Übergangs von Entzündung zu Fibrose^{lag 17}. Es ist erwähnenswert, dass durch die Analyse der Autophagosom/Lysosomen-Kolokalisation in dieser Studie in diesem Modell eine abnormale Autophagiefunktion beobachtet wurde. Dieses optimierte Modell stellt ein wichtiges Werkzeug dar, um die Pathogenese von Koronararterienläsionen bei der Kawasaki-Krankheit systematisch zu untersuchen und neue Behandlungsstrategien zu evaluieren.

Protokoll

Alle Forschungsversuche mit Tierversuchen wurden von der Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University genehmigt (KY-2024-250-01). Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des CAWS

1. Candida albicans in Sabouraud-Dextrosebrühe nach dem etablierten Protokoll von Duong et ^al.18 impfen. Anschließend wird die inokulierte Bouillon 48 h lang bei 37 °C in einer verschlossenen anaeroben Kammer mit einem Gasgemisch anaerob kultiviert.
   HINWEIS: Um die Sterilität des Nährmediums zu gewährleisten, müssen die anaeroben Kulturbedingungen bei 37 °C streng kontrolliert werden, um eine Kontamination durch verschiedene Bakterien zu verhindern.
2. Wiederholt mit C-begrenzendem Medium spülen und bei 37 °C für 48 h bei einer Drehzahl von 4,5 x g inkubieren.
3. Geben Sie die gleiche Menge wasserfreies Ethanol hinzu und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C stehen.
4. Bei 4,5 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen, dem Niederschlag die gleiche Menge wasserfreies Ethanol zugeben und über Nacht bei 4 °C stehen lassen.
5. Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen, 50 ml Aceton zum Niederschlag geben, zentrifugieren und den Niederschlag trocknen. Lösen Sie den Niederschlag für die spätere Verwendung in steriler normaler Kochsalzlösung auf.

2. Konstruktion eines Mausmodells der Kawasaki-Krankheit

1. Wählen Sie achtzig männliche C57BL/6-Mäuse mit Lichtschutzfaktor im Alter von 4-6 Wochen aus und halten Sie sie unter kontrollierten Bedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
   HINWEIS: Um die potenzielle Beeinflussung der Immun- und Entzündungsreaktionen durch Schwankungen des Östrogenspiegels zu minimieren, wurden in dieser vorläufigen Modellstudie zur Etablierung und Charakterisierung nur männliche Mäuse verwendet¹⁹.
2. Teilen Sie die Mäuse gleichmäßig nach der Zufallszahlentabellenmethode in 4 Gruppen ein, einschließlich 3 CAWS-Injektionsgruppen mit unterschiedlichen Dosen (4 mg, 8 mg, 12 mg) und 1 Kontrollgruppe mit normaler Kochsalzlösung mit 20 Mäusen in jeder Gruppe.
3. Bereiten Sie CAWS-Pulver in drei Konzentrationen von 40 mg/ml, 80 mg/ml und 120 mg/ml unter Verwendung von steriler normaler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) vor. Injizieren Sie der Versuchsgruppe morgens vom 1. bis zum 5. Versuchstag 0,1 ml CAWS und verabreichen Sie der Kontrollgruppe nach demselben Schema das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Die intraperitoneale Injektion wurde mit einer 1-ml-Insulinspritze durchgeführt. Positionieren Sie die Maus während der Operation mit dem Kopf nach unten und dem Schwanz nach oben, um eine Schädigung von Organen wie Dick- und Dünndarm beim Einführen der Spritze zu vermeiden.
4. Verwenden Sie täglich um 9 Uhr eine elektronische Waage, um gleichzeitig das verbleibende Futter im Futterautomaten zu wiegen und den 24-Stunden-Futterverbrauch für jeden Mäusekäfig zu berechnen.
5. Wählen Sie am 3., 7., 14. und 28. Tag nach der letzten Injektion nach dem Zufallsprinzip 3 Mäuse aus jeder Gruppe aus und opfern Sie sie zu jedem Zeitpunkt.
6. Setzen Sie die Mäuse in eine geschlossene, mit Raumluft vorgefüllte Kammer. Komprimiertes CO₂ mit einer Durchflussrate von 30 % des Kammervolumens pro Minute einleiten. Nach 5 Minuten wurde eine zervikale Dislokation durchgeführt, um den Tod zu bestätigen.
7. Sammeln und wiegen Sie Herzproben. Beobachten Sie entzündliche Läsionen des Herzens und der Blutgefäße durch HE-Färbung.

3. HE-Färbe- und Sortierstandards

1. Das Herz und der Aortenbogen (ca. 3 mm × 3 mm) wurden rasch isoliert. Es wird eine mediane Sternotomie nach der beschriebenen Methode²⁰ durchgeführt. Trennen Sie schnell das Herz vom Aortenbogen (ca. 3 mm × 3 mm). Die entnommenen Gewebe wurden 24 h lang in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert.
2. Nach der Fixierung dehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Ethanolserie (70 % Ethanol für 1 h, 80 % Ethanol für 1 h, 95 % Ethanol für 1 h und 100 % Ethanol für 1 h), klar in Xylol und eingebettet in Paraffin. Zum Schluss werden die Blöcke in 5 μm große Endlosscheiben geschnitten.
3. Für die H&E-Färbung färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylin, spülen Sie sie 10 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, färben Sie sie 2 Minuten lang mit Eosin und fahren Sie dann mit der Dehydrierung und Montage^{fort 21}.
   HINWEIS: Je nach Grad der vaskulären Intimaverletzung wird sie in drei Grade eingeteilt: Grad I ist hauptsächlich durch endotheliale Schwellung und Neutrophilenaggregation gekennzeichnet; Grad II manifestiert sich als Degeneration der glatten Muskulatur, Infiltration von Entzündungszellen und Organellenschäden; Grad III zeigt schwere Läsionen wie Endothelnekrose und -ablösung sowie Fibringerablagerungen.

4. Masson-Trichrom-Färbung

1. Nach der Fixierung werden die Gewebeproben durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, die in Xylol klar ist und in Paraffin eingebettet ist.
2. Nach dem Entparaffinieren hydratisieren Sie die Schnitte durch eine abgestufte Ethanolreihe mit destilliertem Wasser, um sie für die Färbung vorzubereiten.
3. Färben Sie die Zellkerne 5 Minuten lang mit Weigert's Eisen Hämatoxylin, spülen Sie es gründlich unter fließendem Wasser ab und färben Sie dann das Zytoplasma 5 Minuten lang mit Lichun Red acid Fuchsin.
4. Differenzieren Sie 1 min lang mit 1% Phosphomolybdsäure, färben Sie die Kollagenfasern dann 3 min lang direkt mit Anilinblau. Rasch mit 1 % Eisessig nachspülen.
   HINWEIS: Kontrollieren Sie den Zeitpunkt des Differenzierungsschritts streng, um die Spezifität der Färbung sicherzustellen.
5. Nach der Dehydrierung mit Ethanol und Xylol, die transparent werden, versiegeln Sie den neutralen Film.
6. Spülen Sie die fleckigen Abschnitte unter fließendem Wasser ab, um überschüssige Farbe zu entfernen.
7. Die Schnitte werden durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, die in Xylol geklärt ist, und mit neutralem Gummi montiert.
8. Betrachten Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop bei gleichbleibender Vergrößerung. Kollagenfasern sollten blau, Muskelfasern und Zytoplasma rot und Zellkerne tiefblau erscheinen.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Fixieren Sie Zell- oder Gewebeschnitte und blockieren Sie 1 h lang mit 5 % BSA, um unspezifische Bindungen zu reduzieren.
2. Verwenden Sie normales Serum aus der gleichen Spezies wie der Sekundärantikörper, verdünnen Sie es mit PBS im Verhältnis 1:10 und tropfen Sie es auf die Probe. Bei Raumtemperatur 30 min verschließen. Nach dem Versiegeln zweimal vorsichtig mit PBS nachspülen.
3. Die Schnitte werden mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS den fluoreszierenden Sekundärantikörper zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
4. Färben des Kerns mit DAPI, Versiegeln mit Anti-Quenching-Eindeckmittel und Betrachten unter konfokaler Mikroskopie.

6. Immunhistochemie

1. Nach dem Entparaffinieren und der Hydratation der Paraffinschnitte ist eine Antigenreparatur durchzuführen und die endogene Peroxidase zu blockieren.
2. Antikörperinkubation und Farbentwicklung: Zuerst mit normalem Serum blockieren, dann den Primärantikörper und den HRP-markierten Sekundärantikörper nacheinander inkubieren und schließlich die DAB-Farbentwicklung. Kontrollieren Sie den Reaktionsgrad unter dem Mikroskop.
3. Färben Sie die Zellkerne erneut mit Hämatoxylin. Nach der Dehydrierung und Transparenz verschließen Sie die Platten und beobachten das bräunlich-gelbe positive Signal unter dem Mikroskop.
   HINWEIS: Für das Experiment müssen Steuerelemente eingerichtet und die Bedingungen für die Wiederherstellung und Farbentwicklung streng kontrolliert werden.

7. Nachweis von Autolysosomen

1. RAW264.7-Makrophagen werden mit Candida albicans-Sporen in einem geeigneten Verhältnis (10:1) cokultiviert und bei 37 °C und 5 % CO₂ für 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h und 48 h inkubiert, um ein phagozytäres Modell zu etablieren.
2. Waschen Sie dreimal mit vorgekühltem PBS, um die unphagozytären Sporen zu entfernen.
3. Zuerst werden die Proben mit 5% BSA für 30 min blockiert. Inkubieren Sie dann nacheinander mit dem Primärantikörper gegen LC3 (1:200 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 1 h, gefolgt von dem Alexa Fluor 488-markierten Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
4. Geben Sie die Lysosomensonde Lysosom Lysosom Lysosom Lysosom direkt in die Zellen, um die lysosomale Lokalisation zu visualisieren. Zum Schluss wird die Zellkerne 5 min lang mit DAPI (1 μg/ml) gegengefärbt.
   HINWEIS: Der gesamte Operationsprozess sollte im Dunkeln durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Inkubationszeit und die Konzentration des Antikörpers genau kontrolliert werden.

Ergebnisse

Zunächst untersuchten wir systematisch die myokardialen pathologischen Veränderungen, die durch unterschiedliche Dosen von CAWS bei Mäusen induziert wurden. In der PBS-Kontrollgruppe, der 4 mg CAWS-Gruppe und der 8 mg CAWS-Gruppe wurden keine Todesfälle beobachtet (n = 20 in jeder Gruppe). Im Gegensatz dazu war die Entzündungsreaktion in der 4-mg-Gruppe mild und entsprach nicht den Modellierungsanforderungen. Die Mortalitätsrate war in der 12-mg-CAWS-Grup...

Diskussion

Aneurysmen der Koronararterien (CAA) und Myokardfibrose bei KD sind die Hauptursachen für kardiovaskuläre Langzeitereignisse. Trotz der Fortschritte in der Akutphasenbehandlung entwickeln immer noch etwa 5 % der Patienten eine persistierende CAA^28,29. Der Mechanismus dieser verzögerten pathologischen Veränderung ist noch unklar, und es besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen, um ihren dynamischen Prozess aufzudecken

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ein sekundärer Ziegenantikörper gegen Kaninchen-IgG Alexa Fluor 488	abcam	ab15081	ein sekundärer Ziegenantikörper gegen Kaninchen-IgG Alexa Fluor 488
Anaerobe Kammer	Thermowissenschaftlich	Thermowissenschaftlich	Anaerobe Kammer
Anilinblau	Solarbio	G3668	Anilinblau
anti-LC3	abcam	ab192890	der primäre Antikörper gegen LC3
Biologischer Sicherheitsschrank	Thermowissenschaftlich	1500	Biologischer Sicherheitsschrank
BSA	Solarbio	A8020	BSA
Candida albicans (Stamm)	NBRC	1385	Candida albicans (Stamm)
CD3e	BD Bioscience	561827	FITC Hamster Anti-Maus CD3e(145-2C11)
CD86	BD Bioscience	105013	CD86
CD8a	BD Bioscience	100713	CD8a
Zellkultur-Inkubator	Thermowissenschaftlich	311	Zellkultur-Inkubator
Zentrifuge	Thermowissenschaftlich	ST4R Plus	Zentrifuge
Konfokalmikroskop	Olymp	IX73	Konfokalmikroskop
DAPI	Beyotime Biotechnologie	P0131-25ml	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
Einbettmaschine	P.S.J MEDIZINISCH	BM450A	Einbettmaschine
Eosin	Solarbio	G1100	Eosin
F4/80	BD Bioscience	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
Formaldehyd	Solarbio	P1110	Formaldehyd
Vollautomatischer Gewebedehydrator	Leica Biosystems	ASP3005	Vollautomatischer Gewebedehydrator
Glasmikroskop-Objektträger	Citotest	250124A1	Glasmikroskop-Objektträger
H& E-Farbstoff	Beyotime Biotechnologie	C0105M	H& E-Farbstoff
IHC-Kit	Absin-Biotechnologie	abs996-5ml	IHC-Kit
LC3-Sonde	Beyotime Biotechnologie	C3018M	LC3-Sonde
Niedrigprofil-Mikrotom-Klingen	Thermo Fisher	3052835	Niedrigprofil-Mikrotom-Klingen
Lysosomsonde	Beyotime Biotechnologie	C1046	Lysosomsonde
Textmarker	Deli	SK109	Textmarker
Masson-Farbstoff	Beyotime Biotechnologie	C0189M	Masson-Farbstoff
Mikrotom	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Mikrotom
Neutraler Gummi	Solarbi	G8590	Neutraler Gummi
NK1.1	BD Bioscience	561117	NK1.1
Lichtmikroskop	Nikon	Nikon	Lichtmikroskop
Paraffin	Solarbio	YA0012	Paraffin
Paraffin	Solarbio	YA0012	Paraffin
PBS	Solarbio	P1020	PBS
Phosphomolybdsäure	Solarbio	G3472	Phosphomolybdsäure
VDAC1	Abcam	ab34726	Anti-VDAC1