Messung der Einzelzellalterung mit einem bildgebenden Biomarker von Chromatin und epigenetischer Alterung

Zusammenfassung

Das Protokoll präsentiert den bildgebenden und rechnergestützten Workflow zur Extraktion und Validierung von bildgebungsbasiertem Chromatin und epigenetischen Alter (ImAge).

Zusammenfassung

Um eine personalisierte Gesundheitsversorgung voranzutreiben und potenzielle Verjüngungsstrategien zu bewerten, sind Biomarker, die das biologische Alter widerspiegeln, entscheidend. Wir haben bildgebungsbasiertes Chromatin und epigenetische Altersbildung (ImAge) eingeführt, einen bildgebenden Biomarker, der aus der räumlichen Organisation von Chromatin und epigenetischen Markierungen innerhalb einzelner Kerne abgeleitet ist und intrinsische altersbedingte Veränderungen erfasst. ImAge erfasst und quantifiziert effektiv die Effekte von Interventionen, die das biologische Alter modulieren, und zeigt eine Sensitivität durch signifikante Abnahmen nach Verjüngungsstrategien (wie Kalorienrestriktion und partielle Umprogrammierung durch vorübergehende Oct4-, Sox2-, Klf4- und Myc-(OSKM)-Expression) sowie Zunahmen nach Behandlungen wie Chemotherapie. Darüber hinaus korrelierte ein niedrigeres ImAge mit höherer Bewegungsaktivität, was darauf hindeutet, dass es funktionelle Verbesserungen zusammen mit biologischer Altersumkehr erfasst und ein vielversprechendes Einzelzellinstrument zur Bewertung von Langlebigkeitsinterventionen bietet. Da ImAge eine integrative Methode ist, die eine qualitativ hochwertige Bildgebung und eine sorgfältige rechnergestützte Analyse erfordert, möchten wir eine gründliche Anleitung zur Extraktion und Validierung bieten. Dieses umfassende Protokoll wird den Arbeitsablauf sowohl für Nasslaborverfahren (Probenvorbereitung und Bildgebung) als auch für die ordnungsgemäße Nutzung unserer Open-Source-Rechenpipeline (Umgebungsaufbau und Verarbeitung der Bilddaten) zur Extraktion und Validierung von ImAge detailliert beschreiben.

Einleitung

Die zunehmende durchschnittliche Lebenserwartung und eine alternde Weltbevölkerung unterstreichen den dringenden Bedarf an effektiven Biomarkern für das funktionelle oder biologische Alter ^1,2,3. Diese Biomarker sind unerlässlich, um das Krankheitsrisiko und die Lebensdauer genau vorherzusagen, was die geriatrische Versorgung erheblich verbessern und die damit verbundenen Kosten senken kann. Während DNA-Methylierungs- (DNAm)-Uhren bemerkenswerte Fortschritte bei der Quantifizierung biologischer Alterung gemacht haben ^4,5,6, basieren sie oft auf linearer Regression und erfordern große Kohorten, wobei sie möglicherweise nuancierte, kontextabhängige biologische Komponenten, die spezifisch für Individuen^{sind, übersehen}. Darüber hinaus erfordern diese sequenzierungsbasierten Techniken Zelllyse, komplexe Probenvorbereitung und teure Reagenzien für jede Zelle, was sie für Hochdurchsatz-, Groß- oder Längsschnittstudien, bei denen die Probenzerstörung^{ein Nachteil ist}, kostspieliger und schwieriger macht.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir bildgebungsbasiertes Chromatin und epigenetisches Alter (ImAge), eine neuartige Technik, die Alterung und Verjüngung bei Einzelzellauflösung quantifizieren soll. Diese Technik wurde im peripheren Mausblut und verschiedenen festen Organen angewandt und validiert, wie von Alvarez-Kuglen et ^al.1 beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt die optimierten Protokolle im Detail, sodass sie von anderen Forschern für verschiedene Anwendungen angepasst und übernommen werden können.

Dieser Ansatz unterscheidet sich grundlegend von traditionellen DNAm-Uhren, indem er intrinsische, altersbedingte Trajektorien basierend auf der räumlichen Organisation von Chromatin und epigenetischen Markierungen innerhalb einzelner Kerne¹ erfasst. Bildgebungsbasierte Methoden bieten deutliche Vorteile: Sie sind von Natur aus zerstörungsfrei, das heißt, Zellen werden während der Verarbeitung nicht zerstört, im Gegensatz zu sequenzierungsbasierten Methoden. Diese nicht-destruktive Natur ermöglicht entscheidend die Erhaltung der räumlichen Struktur von Chromatin und epigenetischen Markierungen auf Einzelzellebene, wodurch der räumliche Kontext der Zellen innerhalb von Geweben erhalten bleibt – eine Perspektive, die in herkömmlichen Sequenzierungsprozessen oft verloren geht. Darüber hinaus sind Bildgebungstechniken in der Regel kosteneffizienter für groß angelegte oder longitudinale Studien, da sie keine teuren Reagenzien oder komplexe Bibliotheksvorbereitungen pro Zelle erfordern, was sie für wiederholte Beobachtungen über die Zeit^10,11 geeignet macht.

Ein wesentlicher Vorteil von ImAge ist seine Fähigkeit, altersbedingte Trajektorien als intrinsische Hauptmerkmale der Daten selbst offenzulegen, ohne eine Regression des chronologischen Alters erforderlich zu machen. ImAge hat eine starke Korrelation mit dem chronologischen Alter in Maus-peripheren Blut-Mononuklearzellen und verschiedenen festen Organen nachgewiesen^. Entscheidend ist, dass ImAge erwartete Störungen des biologischen Alters effektiv erfasst und eine Zunahme nach der Chemotherapie sowie eine Abnahme der Kalorienrestriktion und partieller Reprogrammierung durch vorübergehende OSKM-Expression in Leber- und Skelettmuskulatur zeigt. Darüber hinaus wurden ImAge-Anzeigen beobachtet, die umgekehrt mit der lokomotorischen Aktivität bei chronologisch identischen Mäusen korrelieren, was auf ihren Nutzen bei der Messung biologischer und funktioneller Alter hinweist.

Die Implementierung der ImAge-Methodik erfordert Fachkenntnisse sowohl in den Nasslabor-Experimenten¹² als auch in computergestützten Analysen¹ (Abbildung 1); Daher bietet dieses Papier umfassende, schrittweise Protokolle für beide Aspekte. Dieses optimierte Protokoll zielt darauf ab, die breite Einführung von ImAge zu erleichtern und es Forschern zu ermöglichen, altersbedingte Veränderungen in Chromatin und epigenetischer Organisation bei Einzelzellauflösung über verschiedene Zelltypen und Gewebe hinweg zu untersuchen. In diesem Protokoll wurden H3K27ac und H3K27me3, zwei Marker, die ausreichend Kontrast und Auflösung zur Bestimmung von ImAge bieten, als repräsentative Markierungen ausgewählt. Forscher können dieses Protokoll replizieren, um biologisches Altern zu quantifizieren, die Auswirkungen von Langlebigkeitsinterventionen zu bewerten und die inhärente Heterogenität in Alterungs- und Verjüngungsprozessen auf individueller Organismusebene zu erforschen.

Protokoll

Alle Tierversuche werden gemäß Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Scripps Research Institute genehmigt wurden (Protokoll 09-0004-6). Die in diesem Manuskript präsentierten Daten wurden mit männlichen i4F-Mäusen gewonnen, die im Alter von 2 bis 14 Monaten lagen. Interessante Organe (Leber- und Skelettmuskulatur) wurden von 13,8 Monate alten i4F und Wurfgeschwister-Kontrollmäusen entnommen, die eine Woche lang mit einer niedrigen Dosis Doxycyclin (0,2 mg/ml)¹⁴ behandelt wurden. Kerne wurden aus Proben von jungen (3,2 Monaten), älteren (13,8 Monaten) und älteren Individuen isoliert, die mit Doxycyclin behandelt wurden, um OSKM-Faktoren (gealtert-OSKM) zu überexprimieren.

1. Bildgebung von Proben

1. Probenvorbereitung
   1. Sammeln Sie interessante Organe (Leber- und Skelettmuskulatur) von frisch sezierten Mäusen (oder anderen interessanten Arten) und frieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff schnell ein. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis sie einsatzbereit sind.
   2. Organe und Gewebe werden in einen vorgekühlten Mörser übertragen und auf Trockeneis gelegt. Gießen Sie flüssigen Stickstoff über das gefrorene Gewebe und mahlen Sie mit einem vorgekühlten Stößel. Pulverisieren Sie die Probe mit dem vorgekühlten Mörser und Stößel, bis ein gleichmäßig feines Pulver entsteht.
   3. Aliquot mahlt Gewebe mit einem vorgekühlten Metallspatel in mehrere Röhren und lagert ungenutzte Proben bei -80 °C.
      HINWEIS: Gewebeproben in den Röhren können bei -80 °C gelagert oder mit der Kernisolierung fortgesetzt werden.
   4. Extrahieren Sie Kerne aus gefrorenen Aliquots mit einem kommerziell erhältlichen Nuclei Lysis Buffer-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   5. Zähle die Kerne mit Trypan Blue. Mische Kerne und Trypan Blue im gleichen Verhältnis in einem separaten Rohr. Übertragen Sie 10 μl der Nuclei-Trypan-Blue-Lösung auf ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler.
   6. Verdünne Proben in PBS + 0,5 % BSA, sodass 10.000 Kerne in einem Volumen von 20–30 μL pro Bohrloch plattiert werden können.
2. Anrichtenvorbereitung
   1. Geben Sie alle relevanten Metadaten für die Beschichtungsvorbereitung und computergestützte Analyse in die Platemap ein (bereitgestellt in Supplementary File 1). Erfassen Sie die Stichprobenkennungen (z. B. Zahlen oder Zeichen) im selben Layout wie die tatsächliche Bohrlochplatte im Reiter SampleID. Erfassen Sie experimentelle Bedingungen, einschließlich des Alters der Probe, im gleichen Layout wie die tatsächliche Bohrlochplatte im Zustand des Tabs.
      HINWEIS: Die im Zustand angegebenen Informationen werden verwendet, um die Altersgruppe jeder Stichprobe (z. B. jung oder alt) zu identifizieren. Diese identifizierten Altersgruppen dienen anschließend als Referenzen für die Erstellung des Alterungsmodells (ImAge). Daher muss der Zustandsreiter Daten enthalten, die mit dem Alter in Verbindung gebracht werden können, sowie weitere relevante experimentelle Bedingungen bei Bedarf.
   2. Erfassen Sie die Ziel-Biomarker (z. B. H3K27me3) im gleichen Layout wie die eigentliche Bohrlochplatte im Kanal# (# wird durch eine Zahl ersetzt) Tab. Überprüfen Sie, dass alle Metadatenkombinationen übereinstimmen und korrekt in einem aufeinanderfolgenden Tabellenformat im Reiter Platemap wiedergegeben werden.
      HINWEIS: Jede Spalte in der Tabelle sollte einem bestimmten Tab-Namen entsprechen (z. B. "sampleID"). Ein zusätzlicher Tab mit der Bezeichnung "Metadaten" ist zur Dokumentation von Projektzielen und Verfärbungsdetails bereitgestellt; Diese Informationen werden in der Datenanalyse nicht verwendet. Nutzen Sie diesen Reiter bei Bedarf an.
   3. Exportiere die Tab-Plattekarte als CSV-Dateiformat mit dem kurzen, beschreibenden Projektnamen (z. B. project.csv).
      HINWEIS: Der Metadaten-Tab bietet eine Vorlage zur Zusammenfassung der Projektziele und Informationen zur Immunfärbung. Die Verwendung des Metadaten-Tabs in der Platemap-Vorlage ist für den Plattierungsprozess selbst optional. Andere Tabs, darunter sampleID, Kanal# (# wird durch eine Zahl ersetzt), sind jedoch für die rechnerische Analyse erforderlich.
3. Platte 10.000 Kerne/Bohrloch in einem Volumen von 20 bis 30 μL in einer Bohrlochplatte (z. B. 384-Bohrlochplatten). Drehplatte bei 1.000 x g (Beschleunigung neun, Verzögerung 4) für 10 Minuten bei 4 °C.
4. Fixiere mit 1:1 Volumen 8% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 10 Minuten bei Zimmertemperatur.
   VORSICHT: Führen Sie Pfa-Schritte in einer Abzugshaube durch und entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Sicherheitsvorschriften.
5. Entferne die Lösung. Fügen Sie 30 μL 0,1 M Glycin in PBS für 5 Minuten bei Zimmertemperatur hinzu. Entferne die Lösung. Waschen Sie zweimal mit 100 μL PBS und fügen Sie 30 μL PBS zur Aufbewahrung hinzu.
   HINWEIS: Zellen können bei 4 °C gelagert oder sofort mit der Immunkennzeichnung beginnen.
6. Immunkennzeichnung
   1. Entfernen Sie PBS. Gib 30 μL Blocklösung hinzu (2 % BSA und 0,5 % Triton X-100 in PBS) und inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entferne die Blocklösung.
   2. Fügen Sie 25 μL primäre Antikörper hinzu: Maus-Anti-H3K27ac (1:250) und Rabbit anti-H3K27me3 (1:250), verdünnt im Blockpuffer (0,4 - 2 μg/mL). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   3. Entferne die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie 3x mit 100 μL PBS für 3 Minuten bei Zimmertemperatur.
   4. Fügen Sie 25 μL sekundäre Antikörper hinzu: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) und Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250), verdünnt im Blockpuffer (1 - 10 μg/mL). Inkubieren Sie 2 Stunden bei 4 °C oder 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
   5. Waschen Sie 3x mit 100 μL PBS für 3 Minuten bei Zimmertemperatur. Färbe mit DAPI/Hoechst in 30 μL Konzentration von 0,01 mg/mL. Waschen Sie mit 100 μL PBS.
      HINWEIS: Lagern Sie die Platte bei 4 °C in Folie oder beginnen Sie sofort mit der Bildnahme. DAPI/Hoechst ist für den Kernsegmentierungsschritt erforderlich.
7. Bildgebung
   1. Bild-Zellen auf einem High-Content-Imager für maximale Auflösung (für diesen Datensatz wurde 20x verwendet, aber 63x wird empfohlen).
      HINWEIS: Obwohl die Bildabbildung mit jedem High-Content-Imager durchgeführt werden kann, geht dieses Protokoll von einer flachen Ordnerstruktur aus aufgenommenen Bildern und einem generischen Bildformat (z. B. .tiff) als Ausgabe des aufgenommenen Bildes aus (Abbildung 2).
   2. Sammeln Sie mehrere Felder pro Bohrloch und mehrere Z-Stacks, idealerweise von oben nach unten die Zellkerne. Eine 10-μm-Abdeckung zusammen mit der z-Achse (z. B. 20 Z-Schnitte bei einem 0,5 μm Z-Schritt) deckt typischerweise die meisten Mauszellkerne ab. Die Größe und die erforderliche Abdeckung hängen von der Art und den Zelltypen ab, die interessiert sind. Repräsentative Bildgebung ist in Abbildung 3 dargestellt.
   3. Übertragen Sie die Bilddatendaten auf den Computer, an dem eine computergestützte Analyse durchgeführt wird, basierend auf der in Abbildung 2 dargestellten Ordnerstruktur.
   4. Füge das in Schritt 1.2.2 oben definierte Präfix des Projektnamens mit quadratischer Klammer in den Bilddatenordner (z. B. [Projekt]original_folder_name) hinzu.

2. Computergestützte Analyse von Bildgebungsdaten

1. Systemsoftware-Anforderungsvorbereitung (Nur für die Ersteinrichtung erforderlich)
   1. Installieren Sie Windows Subsystem for Linux (WSL), wenn Sie auf einem Windows-Rechner arbeiten, indem Sie den Anweisungen bei https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install folgen. Installieren Sie Anaconda oder Miniconda, indem Sie den Anweisungen folgen https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
2. Vorbereitung einer Rechenumgebung (nur für die Ersteinrichtung erforderlich)
   1. Lade die Workflow-Skripte https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow aus dem GitHub-Repository herunter. Entpacke die heruntergeladene Datei.
      HINWEIS: Der Speicherort der Daten kann willkürlich angegeben werden; es wird jedoch empfohlen, ein Verzeichnis auszuwählen, das sich vom Speicherort der Systemdateien unterscheidet (z. B. das C-Laufwerk unter Windows).
   2. Organisieren Sie das geklonte ImAge-Repository so, dass es mit der angenommenen Ordnerstruktur für eine korrekte Skriptausführung übereinstimmt (Abbildung 2).
   3. Öffne die Terminal-App, wenn du unter Linux oder macOS arbeitest. Öffne die WSL-App, wenn du unter Windows arbeitest.
   4. Ändere den Ordner in die geklonte Repository-Datei. Von nun an bezeichnet der Begriff Command: eine Anweisung, den nachfolgenden Code in die Terminalanwendung zu kopieren und einzufügen, gefolgt vom Drücken der Enter-Taste .
      Befehl: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      HINWEIS: Ersetzen Sie "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" durch die benutzerspezifische Einstellung. Wenn zum Beispiel das Repository im "analysis"-Ordner des D-Laufwerks entpackt und von WSL aus zugänglich ist, lautet dies "/mnt/d/analysis".
   5. Erstelle eine neue Rechenumgebung mit Python Version 3.10 unter Verwendung von conda (Kommandozeilenanwendung installiert mit Anaconda/miniconda).
      Command: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. Aktiviere die neu erstellte Umgebung.
      Befehl: Conda, aktivieren ImAge_workflow
   7. Installiere poetry (einen Python-Paketmanager) mit dem pip-Installer (Python-Paket-Installer, der beim Erstellen der ImAge_workflow-Umgebung installiert wurde).
      Befehl: pip install poetry
   8. Installiere die erforderlichen Python-Pakete mit Poetry.
      Befehl: Poesie installieren
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass der aktuelle Ordner der ImAge_workflow ist, was durch das Ausführen eines Befehls: pwd, überprüft werden kann.
   9. Konfigurieren Sie CUDA innerhalb der Conda-Umgebung, um die Funktionalität der Grafikeinheit (GPU) im Segmentierungsschritt für schnellere Berechnungen zu aktivieren (nur anwendbar für Linux oder Windows-PCs mit Nvidia-GPU).
      Befehl: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; do if [ -d "$dir/lib" ]; dann exportieren LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      HINWEIS: Die Skripte erkennen automatisch die GPU-Verfügbarkeit auf dem Server. Wenn keine GPUs verfügbar sind, läuft es standardmäßig auf der CPU.
3. Führe Berechnungen wie unten beschrieben aus.
   HINWEIS: Die computergestützte Analyse besteht aus vier Schritten: Kernsegmentierung, Bildmerkmale-Extraktion, Konstruktion der Alterungsachse (ImAge) und Vorhersage von ImAge. Jeder Prozess wird mit Python-Skripten durchgeführt; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features und o4_ImAge_validation. Alle diese Schritte sind in einem Python-Skript enthalten, main.py. Die extrahierten ImAge-Anzeigen können mithilfe eines Box- und Geigendiagramms visualisiert werden, wie in Abbildung 4. Die ImAge-Auslesung kann auch in einem einfachen Tabellenformat (Standard-.csv-Dateiformat) extrahiert werden, wobei Stichproben als Zeilen dargestellt werden und entsprechende Auslesungen sowie Metadaten als Spalten. Nutzer haben die Flexibilität, bei Bedarf zusätzliche numerische Analysen auf den ImAge-Anzeigen durchzuführen. Diese Diagramme und die CSV-Datei können mit einem Python-Skript, visualization.py, erhalten werden. Der ImAge-Vorhersageprozess nutzt bootstrapped Signale, die von einzelnen Zellen im selben Gewebe erhalten werden. Diese bootstrapped Signale sind gemittelte Signale, die aus zufälligen Abtastungen und wiederholten Iterationen abgeleitet werden. Dieser Ansatz zielt darauf ab, sicherzustellen, dass die Analyse die zuverlässigsten und repräsentativsten Werte erfasst, wobei die Unsicherheit der Analyse proportional zur inhärenten Heterogenität des Gewebes ist.
   1. Öffne die Terminal-App, wenn du unter Linux oder macOS arbeitest. Öffne die WSL-App, wenn du unter Windows arbeitest.
      Befehl: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass der aktuelle Ordner der ImAge_workflow ist, was durch das Ausführen eines Befehls: pwd, überprüft werden kann.
   2. Aktiviere die Umgebung.
      Befehl: Conda, aktivieren ImAge_workflow
   3. Konfigurieren Sie die Analyseparameter im Workflow/main.py Datei im Code oder Texteditor (z. B. Notepad-App, Microsoft Visual Studio Code usw.).
      1. Setzen Sie den Projektnamen in der Variablen p auf eine kurze, filesystemsichere Identifikator, die zur Organisation von Ausgaben verwendet wird (z. B. p = brain_3ages_k27me3).
      2. Setze die Liste der Kanäle für die Feature-Extraktion in CHS. Fügen Sie den Segmentierungskanal hinzu, wenn Merkmale dieses Kanals für die Analyse benötigt werden (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Kartieren Sie Bildkanal-Kennungen von Dateinamen zu Tafelkartenspalten mit ImageIndex. Bestimmen Sie das vom Bildgebungssystem verwendete Kanaletikettformat zur Erfassung von Bilddaten und verwenden Sie dieses Label als Schlüssel. Ordne jedes Label dem exakten, kleinschreibungssensitiven Spaltenheader in der Platemap zu, die in Schritt 1.2.2 gespeichert wurde (z. B. imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
         VORSICHT: Spaltennamen sind groß- und schreibungssensitiv und müssen Ihrer Kennzeichenkartendatei entsprechen.
      4. Setze Datenstandorte: orgDataLoadPath zur Datensatzwurzel, orgDataSubFolder zum Bildunterordner falls nötig, und resultsSavePath zur Ausgabewurzel.
      5. Bestätigen Sie die Dateiendung in imageFileFormat und bearbeiten Sie imageFileRegEx, um Python-benannte Capture-Groups für alle erforderlichen Teile zu verwenden: Zeile, Kol, Feld, Zposition und Kanal. Verwenden Sie folgende Syntax: (? P\d+), wobei GROUP durch Zeile, Kol, Feld, Zposition oder Kanal ersetzt wird.
         HINWEIS: Aktualisieren Sie das Regex, wenn die Dateinamen unterschiedlich sind; Alle benannten Gruppen müssen korrekt parsen. Zum Beispiel sollte der Dateiname r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff in Folgendes umgewandelt werden: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Setze den Segmentierungskanal in segmentation_ch auf den nuklearen Kanal, der für die Objekterkennung verwendet wird (z. B. segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Entscheiden Sie, ob Sie Beleuchtungskorrektur verwenden möchten, indem Sie illumiCorrection setzen. Auf True setzen, um BaSiC-Modelle zu berechnen und anzuwenden; auf False eingestellt, um Rohbilder zu verarbeiten.
         HINWEIS: Für Platten mit ≥ 25 Brunnen wird eine Beleuchtungskorrektur empfohlen, um systematische Verzerrung zu verringern.
      8. Stellen Sie die physische Voxelgröße in Mikrometern in voxel_dim als [z, y, x] ein. Verwenden Sie Mikroskop-Metadaten, um Abstände zu bestimmen (z. B. voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Speichere die Datei und schließe den Editor nach Überprüfung jedes Parameters
   4. Führe Skripte aus, um ImAge-Auslesungen zu erhalten und führe Validierungen durch. Schließen Sie während des Skripts nicht das Terminal oder die WSL-App.
      Befehl: Python Workflow/main.py
      HINWEIS: Das Skript (main.py) umfasst alle Schritte, einschließlich Segmentierung, Merkmalsextraktion, ImAge-Achsenkonstruktion und Vorhersage standardmäßig. Das Skript erzeugt für jeden Schritt eine geschätzte Fertigstellungszeit (z. B. Kernsegmentierung). Jeder Prozess (z. B. o1_illumination_correction) erzeugt Zwischendateien im .pickle-Format, die Ergebnisse aus jedem Prozess enthalten. Dies ist jedoch ausschließlich für den Datentransfer zwischen Prozessen gedacht, um eine standardisierte Verarbeitung sicherzustellen, und ist in diesem Artikel nicht für Benutzermanipulationen gedacht. Dennoch, falls Benutzer diese Dateien manipulieren oder übernehmen müssen, siehe die in jeder Python-Funktion enthaltene Dokumentation für die Datenform und Typen¹³.
   5. Visualisiere die Ergebnisse und exportiere rohe ImAge-Anzeigen für weitere Analysen in externer Software. Befehl: Python-Workflow/visualization.py
      HINWEIS: Dieser Schritt erzeugt Abbildungen und Tabellen der ImAge-Auswertungen, und die Dateien befinden sich bei fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN bzw. export_o4_ImAge_validation (Abbildung 2).

Ergebnisse

Repräsentative Bilder sollten gut gefüllt sein, um einzelne Zellen zu erhalten, aber einzelne Kerne sollten sich nicht berühren, da dies die Qualität der Zellkernsegmentierung verschlechtert. Abbildung 3 zeigt die repräsentative Bildgebung, um robuste computergestützte Analyseergebnisse zu erhalten.

Die in diesem Manuskript skizzierten Ergebnisse sind aus dem ImAge-Manuskript von Alvarez-Kuglen et al. ¹ ada...

Diskussion

Probenvorbereitung
Zur Probenpräparation entnehmen Sie umgehend interessante Gewebe und frieren sie sofort in flüssigem Stickstoff ein. Beim Mahlen von Gewebe mit Mörser und Stößel kann eine Silikonabdeckung für den Mörser verwendet werden, um den Probenverlust zu verhindern. Füge mehr flüssigen Stickstoff hinzu, wenn das Gewebe schwer zu zermalmen ist. Bei empfindlicheren Geweben können Proben auch frisch (statt gefroren) verarbeitet werden, um mechanische Störungen ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserum-Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Donkey Anti-Maus IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa 488	Invitrogen	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Stark kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
Glycin	Bio-Rad	161-0718
Histon H3K27ac-Antikörper (mAb)	Aktives Motiv	39685
Histon H3K27me3 Antikörper (pAb)	Aktives Motiv	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Kern-Isolationskit: Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	NUC101
Operetta CLS High Content Imager	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldehyd 16% wässrige Lösung EM-Grade	Elektronenmikroskopiewissenschaften	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
PhenoPlate 384-Well-Mikroplatte	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
Trypan Blue Solution, 0,4 % oon;	Gibco	15250061