Method Article

Zellsubtyp-spezifische Analyse von neuronalen Membranproteasomen in somatosensorischen Neuronen

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das neuronale Membranproteasom (NMP) wurde kürzlich in einer Untergruppe somatosensorischer Neuronen als Schlüsselregulator der Berührungs-, Schmerz- und Juckreizwahrnehmung identifiziert. In diesem Artikel wird ein robuster Arbeitsablauf für die Analyse der zelltypspezifischen NMP-Expression und -Funktion unter Verwendung von Zellsortierung, Transkriptom-Profiling und kulturbasierten Immunfluoreszenzanalysen vorgestellt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Signalübertragung von sensorischen Neuronen hängt von funktionellen Proteasomen ab, und ihre subzelluläre Lokalisation beeinflusst die Funktion. Ein spezialisierter Proteasom-Komplex, das neuronale Membranproteasom (NMP), wurde kürzlich in einer Subpopulation peripherer somatosensorischer Neuronen identifiziert. Das NMP lokalisiert ausschließlich an der Plasmamembran des Somas und sowohl an den proximalen als auch an den distalen Axonen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) zeigte, dass das NMP unter normalen Bedingungen überwiegend in MrgprA3+- und Cysltr2+-Neuronen exprimiert wird, die das mechanische, Juckreiz- und Schmerzempfinden vermitteln. Eine akute, selektive NMP-Hemmung in der Pfotenhaut von Mäusen reduzierte die mechanische Empfindlichkeit und die Schmerzempfindlichkeit, ohne das thermische Empfinden zu beeinträchtigen. Bemerkenswert ist, dass die selektive NMP-Hemmung im Gegensatz zur globalen Proteasom-Hemmung keine Neuropathie verursacht. In-vitro-Studien deuten darauf hin, dass das NMP die Kommunikation von Neuron zu Neuron erleichtert, möglicherweise durch die Freisetzung von Signalpeptiden, und für die normale neuronale Reaktion auf Stimulation unerlässlich ist. Diese Ergebnisse identifizieren das NMP als einen wichtigen Regulator des sensorischen Neuronenwechsels, der für normale Berührungen, Schmerzen und Juckreiz erforderlich ist. Somit stellt der NMP ein potenzielles Ziel für die Schmerztherapie dar. In diesem Artikel werden Methoden zur Isolierung sowohl NMP-exprimierender als auch nicht-NMP-exprimierender neuronaler Populationen mittels Antikörperfütterung und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) vorgestellt. Diese Populationen eignen sich für die zelltypspezifische Expressionsprofilierung mittels scRNA-seq oder kulturbasierte Analysen der NMP-Expressionsdynamik. Zusammen bieten diese Methoden einen robusten Workflow für die Untersuchung der NMP-Expressionsdynamik und ihres Beitrags zu schmerzrelevanten Krankheitszuständen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Proteasomfunktion ist für die optimale Entwicklung und Aufrechterhaltung des peripheren Nervensystems (PNS) unerlässlich1,2,3,4,5,6. Sowohl in vitro als auch in vivo Studien mit Proteasom-Inhibitoren zeigen, dass die proteasomale Aktivität entscheidend für die Neuroentwicklung, die Myelinisierung, die Erregbarkeit und die Funktion der Gliazellen ist 7,8,9,10. Darüber hinaus induziert eine auf Proteasom-Inhibitoren basierende Chemotherapie bei 30-60% der Patienten schmerzhafte Neuropathien, die oft durch chronische Schmerzen und veränderte Empfindungen in den Extremitäten gekennzeichnetsind 8,9,11,12,13. Interessanterweise reduziert die niedrig dosierte Verabreichung derselben Inhibitoren die Empfindlichkeit gegenüber schmerzhaften Reizen, was auf eine komplexe Rolle des Proteasoms bei der sensorischen Verarbeitung hindeutet 6,14,15. Trotz dieser umfangreichen Studien ist die spezifische Funktion von Proteasomen im PNS jedoch nach wie vor wenig verstanden.

Proteasomen sind die primäre Proteinabbaumaschinerie in allen Bereichen des Lebens und essentiell für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase16. Das 20S-Kernproteasom besteht aus vier heptameren Ringen von α-, β-, β- α Untereinheiten und vermittelt den Ubiquitin-unabhängigen Proteinabbau17,18. Die Assoziation mit regulatorischen Partikeln bildet das 26S- und 30S-gekappte Proteasom, das den Ubiquitin-abhängigen Proteinabbau vermittelt 4,17. In Neuronen wurden Proteasomen in allen zellulären Kompartimenten identifiziert, und es ist bekannt, dass ihre subzelluläre Lokalisation die Funktion beeinflusst19. Vielen häufig verwendeten Proteasom-Inhibitoren fehlt es jedoch an Spezifität, um selektiv auf unterschiedlich lokalisierte Proteasom-Populationen abzuzielen.

Tatsächlich wurde unter Verwendung von membranundurchlässigen Proteasom-Inhibitoren und Antikörpermarkierung in nicht-permeabilisierten Zellen festgestellt, dass ein neuronenspezifischer Proteasom-Komplex in einer Untergruppe somatosensorischer Neuronen an der Plasmamembran lokalisiertist 20. Die scRNA-seq-Analyse von primären Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG), die über Antikörperfütterung gegen eine Proteasom-Untereinheit und FACS-Sortierung in NMP+- und NMP-Populationen unterteilt wurden, führte zu 20 transkriptionell unterschiedlichen Zellclustern20. Weitere Analysen ergaben, dass sich die NMP+-Zellen nur in 3 der 20 Cluster gruppierten. Unter Verwendung von Genmarkersätzen für bestimmte neuronale Subtypen wurden 13 verschiedene somatosensorische Neuronen-Subtypen identifiziert20. Die Mehrzahl der NMP+-Neuronen gruppierte sich mit mrgprA3+ und Cysltr2+ sensorischen Neuronen20. Eine minimale Anzahl der NMP+-Zellen gruppierte sich zu einem dritten Cluster, in dem keine spezifischen Gensätze identifiziert wurden, und diesem Cluster wurdendaher 20 nicht zugeordnet. MrgprA3+- und Cysltr2+-Neuronen sind C-Typ-Nozizeptoren, die empfindlich auf Wärme, mechanische und pruritogene Reize reagieren und den neuronalen Subtypen CGRP-θ bzw. SST entsprechen21,22. Von den 20 identifizierten Zellclustern exprimierten 7 NMP-Cluster Genmarker, die mit nicht-neuronalen Zellen übereinstimmten, darunter Schwann-Zellen, Satellitenglia und Immunzellen, und wurden ebenfalls nicht zugeordnet20. Diese Zellpopulationen wurden erwartet, da es während der DRG-Neuronenkultivierung nicht möglich ist, nicht-neuronale von neuronalen Zellen zu trennen20.

Bei der Untersuchung seiner Funktion veränderte die In-vitro-Hemmung des NMP die neuronale Erregbarkeit gegenüber KCl, Histamin und αβ-Methylenadenosin-5'-Triphosphat-Stimulation20. In vivo verringerte die NMP-Hemmung die Empfindlichkeit gegenüber mechanischen und Schmerzreizen ohne Auswirkungen auf das thermische Empfinden20. Diese Ergebnisse zeigen, dass der NMP ein wichtiger Regulator des mechanischen Schmerz-, Schmerz- und Juckreizempfindens und ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Schmerztherapie ist20. Die spezifischen Mechanismen, die die NMP-Aktivität mit der Schmerzentwicklung in verschiedenen Krankheitskontexten verbinden, sind jedoch nach wie vor wenig verstanden. Daher ist eine weitere Untersuchung der Expressionsdynamik und -funktion von NMP bei Schmerz- und Neuropathie-assoziierten Erkrankungen gerechtfertigt.

In diesem Artikel wird ein robuster Arbeitsablauf (Abbildung 1) zur Identifizierung und Isolierung von NMP+ DRG-Neuronalpopulationen beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die zelltypspezifische Untersuchung der NMP-Expressionsdynamik mittels FACS-Sortierung, scRNA-seq und Immunfärbung. Diese Ansätze ermöglichen eine hochauflösende Analyse der NMP-Expression in zelltypspezifischer Weise, die zur Untersuchung der Rolle des NMP bei normalen und verschiedenen schmerzassoziierten Erkrankungen verwendet werden kann.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Methoden, die an Versuchstieren beschrieben wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Loyola University of Chicago Stritch School of Medicine genehmigt.

1. Aufbereitung von Aufschlusslösungen, DRG-Medien und FACS-Medien

  1. Bereiten Sie eine komplette Kochsalzlösung (CSS) vor, die 137 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM MgCl2,6H 2O, 25 mM Sorbit, 10 mM HEPES und 3 mM CaCl 2,2H2O enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 ein und sterilisieren Sie den Filter.
  2. Bereiten Sie die Arbeitslösung der Gewebedissoziationsenzymmischung (moderate Verreibung) vor, indem Sie 190 μl des Stammmaterials (5 mg/ml in H2O), 84 μl 50 mM EDTA und 6,5 ml CSS kombinieren. Frisch zubereiten und vor Gebrauch filtrieren.
  3. Bereiten Sie eine Gewebedissoziationsenzymmischung (geringe Verreibung) mit Papainlösung vor, die 190 μl Stammlösung aus der Enzymmischung, 150 μl Papain, 84 μl 50 mM EDTA und 6,5 ml CSS enthält. Frisch zubereiten und vor Gebrauch filtrieren.
  4. Bereiten Sie die BSA/TI/DME-Lösung vor, indem Sie 7,5 mg Trypsin-Inhibitor und 7,5 mg BSA in 5 ml DMEM/F12-Medium kombinieren. Frisch zubereiten und filtrieren.
  5. Bereiten Sie DRG-Neuronenmedien vor, indem Sie 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Glutamin und 2 % 50x B27-Supplement in 430 ml DMEM/F12 kombinieren.
  6. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie 1 % FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES und 1 % Penicillin/Streptomycin in autoklaviertem Wasser kombinieren. Frisch zubereiten und filtrieren.
  7. Vierundzwanzig Stunden vor Beginn des Protokolls beschichten Sie zwei 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen, indem Sie sie mit FACS-Puffer füllen und bei 4 °C platzieren.

2. Herstellung einer einzelligen DRG-Neuronensuspension

  1. Ernten Sie alle DRGs von 4-6 P20-P23-Mäusen nach den zuvor beschriebenen Methoden 20,23.
  2. Übertragen Sie die DRGs in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 7 ml Arbeitslösung der Gewebedissoziationsenzymmischung (moderate Verreibung) hinzu. Unter leichtem Rühren (durch Drehen) bei 37 °C für 20 min inkubieren.
  3. Ganglien bei 120 × g für 2 min herunterschleudern. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Ganglien in 7 ml Gewebedissoziationsenzymmischung (geringe Verreibung)-Papain-Arbeitslösung. Unter leichtem Rühren (durch Drehen) bei 37 °C 15 min inkubieren.
  4. Bei 120 × g 2 Min. schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Ganglien in 500 μl BSA/TI/DMEM-Lösung.
  5. Triturieren Sie die Ganglien 12-16x mit einer 1 mL Pasteur-Pipette aus feuerpoliertem Glas.
  6. Filtern Sie Zelltrümmer heraus, indem Sie die Zellen durch ein 40-μm-Zellsieb leiten. Waschen Sie das Sieb mit 1 mL BSA/TI/DLEM-Lösung, um sicherzustellen, dass alle DRG-Neuronen gesammelt werden. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  7. Bei 120 × g 2 Min. schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 mL DRG-Medien.
    HINWEIS: Dies ist die einzellige DRG-Neuronensuspension.

3. Fütterung von Antikörpern zur Markierung von NMP-positiven Neuronen

  1. Teilen Sie die DRG-Neuronensuspension in zwei 1,5-ml-Röhrchen mit jeweils 500 μl auf und beschriften Sie die beiden Röhrchen mit "primär" und "nicht primär".
  2. 20 μl Anti-Proteasom-Antikörper der 20S-Untereinheit alpha 2 (PSMA2) von Ziegen in das "primäre" markierte Röhrchen geben (Verdünnung 1:25).
    1. Optional: Um die Membranintegrität und Spezifität des PSMA2-Antikörpers zu testen, fügen Sie eine zusätzliche Probe von primären DRGs hinzu, die mit Hühner-Anti-Neurofilament-Schwerkette (NF-H) (1:1.000) inkubiert wurden, gefolgt von Anti-Hühner-Antikörpern (z. B. 488-konjugierten) sekundären (1:250) (Schritt 3.10).
      HINWEIS: Die Anti-NF-H-Markierungskontrolle sollte zu keiner zellulären Markierung führen, wenn die neuronale Membran intakt ist.
  3. Inkubieren Sie die Zellen unter sanftem Rühren für 30 min bei 37 °C.
  4. Warmfiltriert, sterilisiert 1x PBS während der primären Antikörperinkubation.
  5. Die Röhrchen werden bei 200 × g 2 min lang zentrifugiert und 90 % des Überstands entfernt (verworfen).
  6. Resuspendieren Sie die Neuronen in 500 μl warmem 1x PBS. Die Röhrchen werden unter leichtem Rühren 3 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6 für insgesamt drei Wäschen.
  8. Während der Waschschritte bereiten Sie den Sekundärantikörper vor, indem Sie 4 μl Anti-Ziegen-IgG (555-nm-Fluorophor) in 1.000 μl warmem DRG-Medium (1:250-Verdünnung) verdünnen.
  9. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie sowohl das "primäre" als auch das "keine primäre" Röhrchen in 500 μl der sekundären Antikörperlösung.
    HINWEIS: Schützen Sie die Röhren ab diesem Zeitpunkt vor Licht, indem Sie sie mit Alufolie umwickeln.
  10. Die Röhrchen werden unter leichtem Rühren 40 min lang bei 37 °C inkubiert.
  11. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 3.5-3.6 für insgesamt drei Wäschen wiederholen.
  12. Nach dem dritten Waschen resuspendieren Sie die Neuronen in 300 μl FACS-Puffer. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in separate 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen und legen Sie sie zum Schutz vor Licht in einen Eiskübel mit Deckel auf Eis.
  13. Legen Sie die vorbehandelten Rundbodenröhrchen mit FACS-Puffer vom Vortag in den Eiskübel mit den Röhrchen mit den Zellen und fahren Sie mit dem FACS-Sortierschritt fort.

4. Trennung von NMP-positiven (NMP+ ) und NMP-negativen (NMP- ) Neuronen mittels FACS-Sortierung

  1. Unmittelbar nach der Antikörperfütterung und Markierung der DRG-Neuronen werden die Zellen und beschichteten Röhrchen einem FACS-Sortierer zugeführt.
  2. Geben Sie 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (1:1.000) sowohl in die "primären" als auch in die "nicht primären" Röhrchen. 10-30 min auf Eis inkubieren.
    HINWEIS: 7-AAD wird verwendet, um tote Zellen vom Sortierprozess auszuschließen.
  3. Entfernen Sie den FACS-Puffer aus den Röhrchen, die über Nacht beschichtet wurden, und ersetzen Sie ihn durch 1 ml frischen FACS-Puffer. Diese Röhren dienen als Sammelröhrchen für die sortierten Neuronen.
  4. Verwenden Sie die mit "no primary" gekennzeichnete Röhre, um Parameter und Gating für unmarkierte Neuronen festzulegen.
  5. Wenden Sie ein Forward Scatter (FSC)-Gating an, um Zellen zu isolieren, die der Größe der sensorischen Neuronen entsprechen. Die Durchmesser der sensorischen Neuronen reichen von 10 bis 50 μm.
  6. Wenden Sie ein SSC-Gating (Side Scatter) an, um tote Zellen und Ablagerungen auszuschließen (untere Seitenstreuung) und um Ereignisse zu isolieren, die mit der Granularität von DRG-Neuronen übereinstimmen (größere Seitenstreuung).
  7. Laden Sie die "primäre" Röhre und stellen Sie die Gating-Parameter ein, die mit der "keine primäre" Probe festgelegt wurden, um unmarkierte (NMP-) und 555-positive (NMP+) neuronale Populationen zu erkennen.
  8. Mit einer 100-μm-Düse und einem Sortierdruck von 15-20 psi sortieren Sie die Neuronen in 555+ und 555-.
  9. Fahren Sie mit der nachgelagerten Analyse der sortierten Neuronen fort.

5. Einzelzell-RNA-Sequenzierung von NMP+ und NMP-Neuronen

  1. Die sortierten Zellen in 1,5 mL Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Transportieren Sie die Zellen zu einem Einzelzell-Sequenzierungskern.
  2. Führen Sie eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung an NMP+- und NMP-sortierten Neuronen in einer Tiefe von 30.000 bis 100.000 Reads pro Zelle durch.
  3. Analysieren Sie die scRNA-seq-Daten mit verschiedenen frei verfügbaren Softwareprogrammen, um Zellcluster nach spezifischen Genexpressionsprofilen zu generieren. Für weitere Details zu den bisher verwendeten Analyseschritten und Programmen siehe Villalón Landeros et al.20.
  4. Erstellen Sie eine Liste spezifischer Genmarker, um einzelne neuronale Populationen unter Verwendung verfügbarer Datenbanken wie https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ oder https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all zu identifizieren
  5. Verwenden Sie die Liste spezifischer Genmarker, um die resultierenden Zellcluster zu identifizieren.
    HINWEIS: Die zuvor durchgeführte scRNA-seq-Analyse wurde von einem unabhängigen Beratungsunternehmen (www.cmcherryconsulting.com) durchgeführt.

6. Primärkulturen von angereicherten NMP+- und NMP-Neuronen

  1. Legen Sie am Tag vor dem Experiment 12 mm runde Deckgläser in eine 24-Well-Kulturplatte (1 Deckglas/Well) und waschen Sie sie 15 Minuten lang mit 70 % Ethanol. Anschließend 3x mit sterilem Wasser abspülen und in einer sterilen Gewebekulturhaube an der Luft trocknen.
  2. Sobald die Deckgläser trocken sind, bestreichen Sie sie mit 0,1 mg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid (PLL) und stellen Sie sie über Nacht bei 4 °C auf.
  3. Am Tag des Experiments die PLL entfernen, die Deckgläser 3x mit sterilem Wasser abspülen und in einer Gewebekulturhaube trocknen lassen.
    HINWEIS: Die PLL kann gespeichert und wiederverwendet werden.
  4. Verdünnen Sie 10 μl 1 mg/ml Laminin in 125 μl DRG-Medien und tupfen Sie 20-30 μl auf die Mitte jedes Deckglases.
  5. Beschichten Sie die Deckgläser vor Gebrauch mindestens 40 Minuten lang mit Laminin.
  6. Übertragen Sie die FACS-sortierten Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 200 × g , um die Zellen zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Neuronen in 50 μl warmem DRG-Medium.
  7. Aspirieren Sie Laminin aus dem Deckglas und lassen Sie das Deckglas trocknen.
  8. 15-20 μl resuspendierte Neuronen auf jedem Deckglas aussäen. Schieben Sie die Platte mit den ausgesäten Deckgläsern vorsichtig in einen Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten (nicht länger als 1 h), damit die Zellen anhaften können.
  9. Bringen Sie die Platte zurück in eine Gewebekulturhaube und geben Sie 1 ml steriles warmes DRG-Medium in jede Vertiefung, die Zellen auf Deckgläsern enthält.
    HINWEIS: Senken Sie die Pipettenspitze in die untere Ecke der Vertiefung und geben Sie langsam ab, um zu vermeiden, dass das Deckglas berührt und die Zellen beschädigt werden. Zu schnelles Hinzufügen von Medien kann zu Turbulenzen führen und Zellen verdrängen.
  10. Halten Sie die Kulturen bei 37 °C mit 5 % CO2/95 % Luftfeuchtigkeit und 75 % Medienwechsel alle 2-3 Tage.

7. Zelltypspezifische NMP-Expressionsanalyse

  1. Bereiten Sie eine 140-mm-Kulturplatte oder ein Immunfluoreszenz-Färbetablett vor, indem Sie es mit einem großen Stück Parafilm auskleiden.
  2. Übertragen Sie die Deckgläser mit einer sterilen 5/45-Pinzette aus der Gewebekulturschale auf den Parafilm auf der Färbeschale, wobei Sie darauf achten, dass die Seite, die die DRG-Neuronen enthält, nach oben zeigt.
  3. Geben Sie 100 μl DRG-Medium zu jedem Deckglas auf dem Parafilm, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.
    HINWEIS: Fügen Sie Flüssigkeiten hinzu, indem Sie langsam knapp über den Rand des Deckglases pipettieren.
  4. Verdünnen Sie den Anti-PSMA2-Primärantikörper der Ziege in warmen DRG-Medien in einer Verdünnung von 1:20.
  5. Entfernen Sie mit einem Aspirator, der mit einer ungefilterten P10-Spitze ausgestattet ist, das Medium langsam vom Deckglas ab, indem Sie vom Rand aus aspirieren. 100 μl Anti-PSMA2-Antikörperlösung aus der Ziege auf die Deckgläser geben und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig von den Deckgläsern. Fügen Sie 100 μl PBS (bei Raumtemperatur) hinzu und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei Raumtemperatur, um es zu waschen.
  7. Aspirieren Sie PBS vom Deckglas und wiederholen Sie die Zugabe und Aspiration von PBS für insgesamt drei Wäschen.
  8. Bereiten Sie den Anti-Ziegen-Sekundärantikörper (z. B. 555-konjugiert) in warmen DRG-Medien in einer Verdünnung von 1:250 vor.
  9. Nach dem dritten Waschen 100 μl des verdünnten Sekundärantikörpers in das Deckglas geben und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Schützen Sie die Zellen ab diesem Schritt vor Licht.
  10. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung vom Deckglas und waschen Sie sie 3x wie in den Schritten 7.6-7.7 beschrieben.
  11. Entfernen Sie die letzte PBS-Wäsche und fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μl Fixierlösung mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) und 4 % Saccharose in 1x PBS. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Fixiermittel aspirieren und 3x waschen, indem Sie die Schritte 7.6-7.7 wiederholen.
  13. Permeabilisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μl 0,1 % nichtionischem Detergens (z. B. Triton X-100) in 1x PBS und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  14. Aspirieren Sie die permeabilisierende Lösung und waschen Sie sie 3x, indem Sie die Schritte 7.6-7.7 wiederholen.
  15. 100 μL Blockierungslösung bestehend aus 5% FBS, 5% Eselsserum in 1x PBS zugeben und 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  16. Bereiten Sie einen DRG-Neuronenzelltyp-spezifischen primären Antikörpermix gemäß den folgenden Verdünnungen in Blockierungslösung vor: Kaninchen-Anti-Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP) (1:500); Isolektin B4, Biotin-Konjugat (IB4) (1:50); Anti-NF-H für Hühnchen (1:1000).
    HINWEIS: Diese Antikörper interferieren sich nicht gegenseitig und können zusammen in derselben Lösung hinzugefügt werden.
  17. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie den primären Antikörpermix auf das Deckglas. Bei Raumtemperatur 45 min inkubieren.
  18. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie 3x, indem Sie die Schritte 7.6-7.7 wiederholen.
  19. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörper-Mix-Lösung vor, indem Sie Streptavidin (z. B. 647-konjugiert), Esel Anti-Kaninchen (z. B. 488-konjugiert) und Esel Anti-Huhn (z. B. 405-konjugiert) auf jeweils 1:500 verdünnen.
  20. Entfernen Sie die letzte PBS-Waschung und geben Sie 100 μl Sekundärantikörperlösung auf die Deckgläser. Bei Raumtemperatur 45 min inkubieren.
  21. 3x waschen, indem Sie die Schritte 7.6-7.7 wiederholen.
  22. Optional: Bereiten Sie die Kernfärbung mit 1-10 μg/ml vor. 100 μl Kernfärbelösung zugeben, 30 s bei Raumtemperatur inkubieren und 2x mit entionisiertem Wasser (diH2O) waschen, indem die Schritte 7.6-7.7 wiederholt werden.
  23. Saugen Sie die letzte Wäsche vom Deckglas ab und heben Sie das Deckglas mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom Parafilm ab. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab, indem Sie den Rand des Deckglases vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch berühren.
  24. Geben Sie einen 7-μl-Tropfen Eindeckmedium auf einen Objektträger. Legen Sie das Deckglas vorsichtig über das Einbettmediumtröpfchen und stellen Sie sicher, dass die Zellen nach unten zeigen und mit dem Medium in Kontakt kommen.
  25. Legen Sie die Objektträger mit Deckgläsern für mindestens 1 h in eine dunkle, trockene Schublade oder Schachtel zum Trocknen und Versiegeln Sie den Rand des Deckglases. Versiegeln Sie den Rand der Deckgläser mit schnell trocknendem Nagellack und warten Sie 10-15 Minuten, bevor Sie fotografieren.
  26. Bildträger mit einem konfokalen Fluoreszenz- oder Spinning-Disk-Mikroskop, das mit den entsprechenden Lichtfiltern ausgestattet ist, um blaue, grüne, rote und dunkelrote Fluoreszenz sichtbar zu machen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, zwischen dem NMP und intrazellulären Proteasomen zu unterscheiden, beruht auf membranundurchlässigen Markierungsansätzen. Die Antikörperfütterung ermöglicht die Verwendung von Proteasom-Untereinheiten-spezifischen Antikörpern auf lebenden Neuronen, um Proteasomen zu markieren, die nur von außen zugänglich sind. Aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie sind Antikörper nicht in der Lage, intakte Zellmembranen zu durchdringen24. Lebende Neuronen erhalten di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteasomen sind in allen Zellen essentiell und in allen Kompartimenten der Zelle zu finden19. Die kürzliche Entdeckung eines spezialisierten Proteasom-Komplexes, des NMP, in Neuronen des zentralen 25,26,27 und des peripheren20 Nervensystems hat unser derzeitiges Verständnis der Funktion von Proteasomen verändert. Frühere Arbeiten haben gezeigt, da...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.V.L wurde durch Startkapital der Loyola University Chicago Stritch School of Medicine unterstützt. Wir danken Robert Ladd für seine Beratung und Unterstützung bei FACS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES-Pufferlösung, pH 7,3Qualität Biologisch118-089-721FACS-Puffer
10x PBSThermo Fisher Scientific70011-044FACS-Puffer
16 % Paraformaldehyd (PFA)-Stammlösung; EM-KlasseEMS15710Fixative Lösung
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Fisher Scientific10-010-023FACS-Waschungen
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem BodenFisher Scientific14-959-6FACS-Röhren
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)InvitrogenNr. A1310Markiert tote Zellen
B27 BeilageThermo Fisher Scientific17504044Nährmedium
RinderserumalbuminMilliporeSigmaNr. A9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl?-2H? O)MilliporeSigmaNr. C7902Komplette Kochsalzlösung
Hühner-Anti-Neurofilament-Schwerkette (NF-H)MilliporeSigmaAB5539Antikörper
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Scientific11320033Nährmedium; BSA/TI/DMEM
Esel Anti-Ziegen IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificNr. A32816Antikörper
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32790Antikörper
DyLight 405 Esel Anti-HuhnJackson Immunforschung703-475-155Antikörper
EDTAMilliporeSigmaNr. E5134; CAS: 6381-92-6Liberase TM/Liberase TL-papain Arbeitslösungen
Fötales Rinderserum (FBS)MilliporeSigmaNr. A9647Nährmedium/FACS-Puffer/Blockierungslösung
Glaspasteurpipette, 9 ZollFisher ScientificArtikel-Nr.: 1367820DTitruration
Anti-PSMA2 für ZiegenHergestellt im HausNAAntikörper
HEPES-PulverMilliporeSigmaNr. H4034Komplette Kochsalzlösung
HoechstThermo Fisher ScientificNr. H21492Nuklearer Fleck
Pferde-SerumThermo Fisher Scientific26050070Lösung zum Blockieren
IB4, Biotin-KonjugatMilliporeSigmaNr. L2140Antikörper
LamininSigma-AldrichL2020-1MGKulturschale
L-GlutaminThermo Fisher Scientific25030081Nährmedium
Lichase-Verreibung gering (TL)MilliporeSigma54010200001Liberase TL Stammlösung
Lidase-Verreibung moderat (TM)MilliporeSigma5401119001Liberase TM Stammlösung
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl?-6H? O)MilliporeSigmaNr. M2393Komplette Kochsalzlösung
EinhängemedienSouthernBiotech0100-01Fluormount-G
PapainWorthingtonKat#: 9001-73-4Liberase TL-Papain Arbeitslösung
Penicillin/StreptomycinMilliporeSigma15140122Nährmedium/FACS-Puffer
Poly-L-Lysin-Hydrobromid (PLL)MilliporeSigmaNr. P4707Kulturschale
Kaliumchlorid (KCl)MilliporeSigmaNr. P5405Komplette Kochsalzlösung
Kaninchen Anti-CGRPImmunstern24112Antikörper
Natriumchlorid (NaCl)MilliporeSigmaNr. S9888; CAS: 7647-14-5Komplette Kochsalzlösung
SorbitMilliporeSigma56755-MKomplette Kochsalzlösung
Streptavidin Alexa Fluor 647 KonjugatThermo Fisher ScientificNr. S21374Antikörper
SaccharoseSigma-AldrichNr. S0389-500GFixative Lösung
Trypsin-HemmerMilliporeSigmaNr. T9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cartelli, D., Cavaletti, G., Lauria, G., Meregalli, C. Ubiquitin proteasome system and microtubules are master regulators of central and peripheral nervous system axon degeneration. Cells. 11 (8), 1358(2022).
  2. Fortun, J., et al. Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy model. J Neurochem. 92 (6), 1531-1541 (2005).
  3. Thibaudeau, T. A., Smith, D. M. A practical review of proteasome pharmacology. Pharmacol Rev. 71 (2), 170-197 (2019).
  4. Türker, F., Cook, E. K., Margolis, S. S. The proteasome and its role in the nervous system. Cell Chem Biol. 28 (7), 903-917 (2021).
  5. VerPlank, J. J. S., Lokireddy, S., Feltri, M. L., Goldberg, A. L., Wrabetz, L. Impairment of protein degradation and proteasome function in hereditary neuropathies. Glia. 66 (2), 379-395 (2018).
  6. Moss, A., et al. A role of the ubiquitin-proteasome system in neuropathic pain. J Neurosci. 22 (4), 1363-1372 (2002).
  7. Meregalli, C., et al. Bortezomib-induced painful neuropathy in rats: a behavioral, neurophysiological and pathological study. Eur J Pain. 14 (4), 343-350 (2010).
  8. Meregalli, C. An overview of bortezomib-induced neurotoxicity. Toxics. 3 (3), 294-303 (2015).
  9. Velasco, R., Alberti, P., Bruna, J., Psimaras, D., Argyriou, A. A. Bortezomib and other proteosome inhibitors-induced peripheral neurotoxicity: from pathogenesis to treatment. J Peripher Nerv Syst. 24 (Suppl 2), S52-S62 (2019).
  10. Cavaletti, G., et al. Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity: a neurophysiological and pathological study in the rat. Exp Neurol. 204 (1), 317-325 (2007).
  11. Cata, J. P., et al. Quantitative sensory findings in patients with bortezomib-induced pain. J Pain. 8 (4), 296-306 (2007).
  12. Meng, L., et al. Peripheral neuropathy during concomitant administration of proteasome inhibitors and factor Xa inhibitors: identifying the likelihood of drug-drug interactions. Front Pharmacol. 13, 757415(2022).
  13. Mina, S. A., et al. Post-marketing analysis of peripheral neuropathy burden with new-generation proteasome inhibitors using the FDA adverse event reporting system. Turk J Hematol. 38 (3), 218-221 (2021).
  14. Holzer, A. -K., Suciu, I., Karreman, C., Goj, T., Leist, M. Specific attenuation of purinergic signaling during bortezomib-induced peripheral neuropathy in vitro. Int J Mol Sci. 23 (7), 3734(2022).
  15. Meng, L., et al. a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (18), 10403-10408 (1999).
  16. Maupin-Furlow, J. Proteasomes and protein conjugation across domains of life. Nat Rev Microbiol. 10 (2), 73-82 (2012).
  17. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65 (1), 801-847 (1996).
  18. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Å resolution. Nature. 386 (6624), 463-471 (1997).
  19. Pines, J., Lindon, C. Proteolysis: anytime, any place, anywhere. Nat Cell Biol. 7 (8), 731-735 (2005).
  20. Landeros, E. V., et al. The nociceptive activity of peripheral sensory neurons is modulated by the neuronal membrane proteasome. Cell Rep. 43 (4), 114058(2024).
  21. Qi, L., et al. A mouse DRG genetic toolkit reveals morphological and physiological diversity of somatosensory neuron subtypes. Cell. 187 (6), 1508-1526.e16 (2024).
  22. Sharif, B., Ase, A. R., Ribeiro-da-Silva, A., Séguéla, P. Differential coding of itch and pain by a subpopulation of primary afferent neurons. Neuron. 106 (6), 940-951.e4 (2020).
  23. Krueger, E. R., Church, T. R., Brennan, A., Türker, F., Landeros, E. V. Protocol to study neuronal membrane proteasome function in mouse peripheral sensory neurons. STAR Protoc. 6 (1), 103552(2025).
  24. Chiu, M. L., Goulet, D. R., Teplyakov, A., Gilliland, G. L. Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics. Antibodies. 8 (4), 55(2019).
  25. Ramachandran, K. V., et al. Activity-dependent degradation of the nascentome by the neuronal membrane proteasome. Mol Cell. 71 (1), 169-177.e6 (2018).
  26. He, H. -Y., et al. Neuronal membrane proteasomes regulate neuronal circuit activity in vivo and are required for learning-induced behavioral plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (3), e2216537120(2023).
  27. Paradise, V., et al. ApoE isoforms differentially regulate neuronal membrane proteasomes to shift the threshold for pathological aggregation of endogenous tau. bioRxiv. , (2022).
  28. Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd edn, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal Membrane ProteasomeSomatosensory NeuronsSensory Neuron SignalingDorsal Root GangliaAntibody FeedingFlow CytometryCell Type SpecificitySingle Cell RNA SequencingProteasome InhibitionPain Sensation

Related Articles