Methodenartikel

Modellierung der dysplastischen und funktionellen Lungenalveolarreparatur nach einer Influenzainfektion

885 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19. September 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die intranasale Verabreichung von IAV und die nachgelagerte Analyse von Lungenschäden an Mäusen und damit verbundenen transkriptionellen Veränderungen an Lungenzelltypen.

Zusammenfassung

Eine Virusinfektion verursacht sowohl akute als auch langfristige Schäden an der Lungenalveole, der spezialisierten Gewebestruktur, die für den Gasaustausch zwischen dem Herz-Kreislauf-System und der äußeren Umgebung verantwortlich ist. Eine Influenza-A-Virus-Infektion (IAV) bei Mäusen stellt ein translationales Modell für die Reaktion der menschlichen Lunge auf eine Virusinfektion dar und induziert sowohl vorübergehende als auch persistente Zellzustandsänderungen in der Alveole. In einigen Fällen können durch Virusschäden induzierte aberrante Zellzustände, die im Laufe der Zeit nicht aufgelöst werden, die kritische Gasaustauschfunktion der Lunge dauerhaft beeinträchtigen. In diesem Artikel werden Methoden zur intranasalen Infektion von Mäusen mit A/PR/8/34 IAV und die Charakterisierung von vorübergehenden und lang anhaltenden Veränderungen der zellulären Zusammensetzung und Gewebestruktur geschädigter Lungen vorgestellt. Dieses Modell ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die der Lungenreparatur und chronischen Dysfunktion zugrunde liegen. Dieser Ansatz bietet auch eine Plattform für die Evaluierung therapeutischer Interventionen, die darauf abzielen, eine effektive Lungenregeneration zu fördern und die Atemfunktion nach einer Virusverletzung wiederherzustellen.

Einleitung

Die Lunge spielt eine entscheidende Rolle bei der Versorgung des lokalen Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen. Endothelzellen (ECs), die kleine kapillare Blutgefäße der Lunge bevölkern, sind für das reibungslose Funktionieren des Lungengewebes, die Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität und einen effizienten Gasaustausch unerlässlich1. ECs bilden die vaskuläre Nische und interagieren wechselseitig mit anderen Zellen wie Epithelzellen, Immunzellen und mesenchymalen Zellen. Dies trägt zur Regulierung der Lungenentwicklung und der Gewebereparatur als Reaktion auf Verletzungen oder Krankheitenbei 2 bei.

Die Infektion mit dem H1N1-Influenza-A-Virus ist ein weltweites Problem3. Bei Patienten mit H1N1-Infektion wird häufig eine exsudative diffuse Alveolarschädigung (DAD) diagnostiziert4. Eine Infektion mit H1N1 kann zu schweren Lungenschäden und schwerwiegenden Folgen führen, einschließlich Lungenentzündung, schwerer akuter Lungenschädigung (ALI) und akutem Atemnotsyndrom (ARDS)5. Die Schäden entstehen hauptsächlich dadurch, dass das Virus die Lungenepithelzellen infiziert, was eine übermäßige Immunantwort auslöst, die zu Entzündungen, Gewebeschäden und Flüssigkeitsansammlungen in der Lunge führt. Die Epithelzellen, die die Atemwege und Lungenbläschen auskleiden und für den Gasaustausch verantwortlich sind, werden somit direkt durch das H1N1-Virus geschädigt, was zu einer Störung der normalen Struktur der Lunge führt 6,7. Es hat sich gezeigt, dass andere Zelltypen, obwohl sie nicht direkt mit IAV infiziert sind, als Reaktion auf eine Infektion geschädigt werden können 8,9. Gewebeschäden nach einer Influenzainfektion betreffen daher alle zellulären Kompartimente der Lunge, und es wurde kürzlich gezeigt, dass eine IAV-Infektion sowohl vorübergehende als auch anhaltende Veränderungen des Zellzustands in mehreren zellulären Kompartimenten verursacht9. Diese Zellplastizität als Reaktion auf Krankheiten kann für eine erfolgreiche Gewebereparatur hilfreich oder schädlich sein und rechtfertigt weitere Studien.

Das am weitesten verbreitete experimentelle Modell zur Untersuchung der Influenza und ihrer Pathogenese ist die intranasale Infektion von Mäusen mit dem Influenzavirus A/PR/8/3410. Es ist eine wichtige Technik, die es ermöglicht, den Schweregrad der Krankheit, die Mortalität und die virale Infektiosität zu untersuchen. Die intranasale Infektion von Mäusen ahmt den natürlichen Infektionsweg beim Menschen nach und ermöglicht die Untersuchung sowohl adaptiver als auch angeborener Immunantworten gegen das Virus. Im Jahr 1934 wurde ein spezifischer Stamm des Influenza-A-Virus "A/PR/8/34" von einem Patienten in Puerto Rico isoliert11. Dieser Influenzavirusstamm ist inzwischen an die Maus angepasst und infiziert den Menschen nicht mehr produktiv. Aufgrund der Ähnlichkeiten im Immunsystem von Maus und Mensch sind Mäuse das beliebteste Tiermodell für die IAV-Forschung12. Bei diesem Verfahren wird der H1N1-Stamm A/PR/8/34 direkt über die Nasenlöcher an Mäuse verabreicht, wodurch eine natürliche Infektion nachgeahmtwird 13. Es ist eine einfache, kostengünstige und bequeme Methode, um die Auswirkungen einer Virusinfektion auf das Lungengewebe des Wirts sowohl unter Wildtyp- (WT) als auch unter Knockout-Bedingungen (KO) zu untersuchen. Alternative Techniken haben Vor- und Nachteile gegenüber dem intranasalen Modell. Die intratracheale (IT) Inokulation ermöglicht eine genaue Abgabe des Virus in die Lunge, aber diese Technik ahmt eine Infektion durch Inhalation nicht vollständig nach und liefert keine Informationen über die Toxizität in den oberen Atemwegen. Die IT-Inokulation erfordert auch großes Geschick, um das Risiko einer Trachealverletzung zu verringern13,14. Die Aerosol-Inhalationsimpfung (AR) ahmt den natürlichen Infektionsweg nach und führt im Vergleich zur intranasalen Infektion zu einer einheitlicheren Lungenpathologie, aber es kann schwierig sein, eine gleichmäßige Viruskonzentration im Aerosol aufrechtzuerhalten und eine genaue Abgabe des viralen Aerosols zu erreichen. Auch bei der AR-Inokulationsmethode10 ist die Sicherheit ein wichtiges Anliegen. Daher ist die intranasale Inokulationstechnik der IAV-Verabreichung ein entscheidender Ansatz für die pulmonale Forschung zu den nachgelagerten Auswirkungen von Virusinfektionen auf Gewebeverletzungen und -reparaturen. Im Gegensatz zu chemischen oder mechanischen Modellen bietet es eine realistischere und weniger invasive Möglichkeit, grippeinduzierte Lungenschäden und Wirt-Erreger-Interaktionen zu untersuchen.

In dieser Arbeit etablieren wir eine reproduzierbare Methode zur intranasalen Infektion von Mäusen mit dem Influenza-A-Virus (A/PR/8/34) und zur Charakterisierung sowohl der kurz- als auch der langfristigen zellulären und strukturellen Veränderungen in der Lungenalveole, die aus einer Virusschädigung resultieren. Studien, die diese Methode anwenden, können bei der Entdeckung von Mechanismen der Schädigung und Reparatur von Lungengewebe helfen, um neue therapeutische Ziele für Lungenerkrankungen zu identifizieren.

Protokoll

Die Arbeit mit dem Influenza-A-Virus im Tiermodell gilt als Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) und Tierschutzstufe 2 (ABSL2). Alle tierexperimentellen Verfahren, die zur Generierung dieser Daten verwendet wurden, wurden vom Animal Care and Use Committee des Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Protokoll #24-452) genehmigt. Dieses Protokoll ist auch vom Institutional Biosafety Committee des Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health genehmigt. Vor Beginn dieses Protokolls wird empfohlen, dass Benutzer die Genehmigung ihres institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung und des institutionellen Ausschusses für biologische Sicherheit einholen.

1. Erstellung des Arbeitsmaterials

HINWEIS: Alle Arbeiten mit dem Influenzavirus sollten auf Eis in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Werfen Sie Spitzen und alles andere, was mit dem Virus in Kontakt kommt, in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel. Eiskübel, Pipetten und Tip-Boxen sollten mit 10%iger Bleichlösung besprüht und nicht untergetaucht werden. Bei Raumtemperatur mindestens 30 min inkubieren. Entsorgen Sie feste Abfälle in einem Behälter für biologisch gefährliche Abfälle und entsorgen Sie flüssige Abfälle in der Spüle, indem Sie sie mit Wasser spülen.

  1. Tauen Sie gefrorene Virusbestände (0,5 ml) auf Eis in einer Biosicherheitswerkbank auf.
  2. Stellen Sie einen Abfallbehälter mit 10 % Bleiche in Leitungswasser auf. Stellen Sie zwei Gefrierboxen aus Kunststoff oder Pappe, die bis zu 100 Probenröhrchen aufnehmen können, zum Vorkühlen in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
  3. 160 1,5-ml-Röhrchen für Virusaliquote voretikettieren. Röhrchen mit Schraubverschluss sind den Klappröhrchen vorzuziehen, um die Bildung von Aerosolen beim Öffnen von Virusröhrchen zur Verwendung zu vermeiden. Legen Sie die Röhrchen zum Vorkühlen auf Eis, bevor Sie Aliquots des Virus herstellen.
  4. Stellen Sie mit einer kalibrierten P20-Pipette und Spitzen 3 μl Virusaliquote her, geben Sie das Virus nur in vorgekühlte Röhrchen und bewahren Sie die Aliquote immer auf Eis auf.
  5. Bewahren Sie sie nach der Herstellung von Aliquoten in einer vorgekühlten Gefrierbox auf, die mit "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", der Katalognummer, der Chargennummer und dem Verfallsdatum beschriftet ist.
    HINWEIS: Verschiedene Chargen von Viren haben eine unterschiedliche Infektiosität und sollten nicht gemischt werden.
  6. Stellen Sie die Box in einen -80 °C Gefrierschrank. Achten Sie darauf, alles so kalt wie möglich zu halten, da der Virustiter mit jedem Frost-/Auftauzyklus abnimmt.

2. Verdünnen von Virusaliquoten zur Verwendung in intranasalen Infektionsexperimenten

  1. Tauen Sie ein 3 μl aliquotes Virusmaterial auf Eis in der Biosicherheitswerkbank auf.
  2. Eine Verdünnung im Verhältnis 1:100 (Verdünnung A) wird vorgenommen, indem 2 μl des 3 μl Aliquot in ein vorgekühltes 1,5 ml-Röhrchen mit 198 μl kaltem D-PBS überführt werden.
  3. Verdünnen Sie den Virusfond weiter, bis er die entsprechende Konzentration von 0,5-1 LD50 im Stammhintergrund der verwendeten Mäuse erreicht. Bewahren Sie alles auf Eis auf und verwenden Sie vorgekühlte Röhrchen, um eine Übererwärmung des Virus zu vermeiden.
    HINWEIS: Infizieren Sie beispielsweise für VR-95PQ, Los 70063082, Mäuse mit 12.600 bis 31.500 CEID50/μl Virus (skaliert nach Körpergewicht) in einer Verdünnung von 1:500.000.
  4. Aus Verdünnung A (1:100) wird eine Verdünnung von 1:50.000 (Verdünnung B) vorgenommen, indem 10 μl Verdünnung A zu 4990 μl kaltem D-PBS in einem vorgekühlten 15-ml-Röhrchen gegeben werden. Mischen Sie gut, indem Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
  5. Aus Verdünnung B wird eine Verdünnung von 1:500.000 (Verdünnung C) vorgenommen, indem 200 μl Verdünnung B zu 1,8 ml D-PBS in einem vorgekühlten 5-ml-Röhrchen hinzugefügt werden. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Um die ideale Verdünnung des Virus zu bestimmen, die bei der Infektion der Tiere beim Kauf einer neuen Charge verwendet werden soll, ist es möglich, den auf dem Produktblatt angegebenen Titer des Virus zu schätzen und die Verdünnung auf der Grundlage des Titers der vorherigen Charge anzupassen. Der beste Weg, die ideale Verdünnung zu bestimmen, besteht darin, die neue Viruscharge empirisch mit Hilfe von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen zu titern. Planen Sie einen Verdünnungsbereich von 1:50.000 bis 1:500.000 und bestellen Sie 1-2 Käfige mit weiblichen C57BL/6-Mäusen pro Verdünnung zum Testen. Infizieren Sie Mäuse in unterschiedlichen Konzentrationen und überwachen Sie ihren Gewichtsverlust. Um virale Titer zu testen, schlägt die Studie vor, nur weibliche Mäuse zu verwenden, um die Variabilität zu reduzieren, die durch Geschlechts- oder Gewichtsunterschiede zwischen Mäusen verursacht werden kann. Weibliche Mäuse werden oft kränker als männliche Mäuse, möglicherweise aufgrund ihrer geringeren Größe oder aufgrund geschlechtsspezifischer Unterschiede in der Reaktion auf eine Influenzainfektion, wie es bei anderen Formen der Lungenschädigung von Mäusen der Fall ist15. Obwohl dies nicht im Detail untersucht wurde, wurden weibliche Mäuse in den Titerexperimenten verwendet, denn wenn der Titer mit männlichen Mäusen bestimmt wurde, könnten weibliche Mäuse bei der festgelegten Dosis sterben. Es wurde jedoch festgestellt, dass männliche Mäuse bei einer Infektion mit einem Virustiter merklich krank werden und spürbare Lungenverletzungen aufweisen, was nur an weiblichen Mäusen bestimmt wurde. Eine ideale Verdünnung bei Verwendung von Mäusen mit gemischtem Hintergrund oder ausgezüchteten Mäusen ist "1 LD50", die Verdünnung, bei der 50 % der Wildtyp-C57BL/6-Mäuse sterben. Gezüchtete Mäuse sind resistenter gegen Infektionen16 und werden bei dieser Verdünnung verletzt und erholen sich gut. Wenn sich die Mäuse für das Experiment auf einem Inzucht-C57BL/6-Hintergrund befinden, beträgt die ideale Dosis die Hälfte dieser "0,5 LD50". Da das Ziel dieser Experimente darin besteht, Verletzungen und Reparaturen zu untersuchen, ist es ideal, eine Dosis zu definieren, bei der Mäuse krank werden und 20-25 % ihres Körpergewichts verlieren, die meisten Mäuse sich jedoch letztendlich erholen (Abbildung 1). Wenn alle Mäuse in der Studie ungefähr das gleiche Gewicht (~25 g) haben, ist es möglich, das Influenzavirus in einer Menge von 50 μl der entsprechenden Verdünnung an jede Maus zu verabreichen. Mäuse wiegen jedoch zwischen 15 und 35 g. Verabreichen Sie daher 2 μl Virusverdünnung pro Gramm Körpergewicht (z. B. würde eine 15-g-Maus 30 μl Influenza erhalten, während eine 35-g-Maus 70 μl erhalten würde). Dies führt zu einem gleichmäßigeren Ausmaß an Infektionen und Gewebeschäden bei unterschiedlich großen Tieren. Diese Informationen werden benötigt, um das Volumen der Verdünnung C zu planen.

3. Transport von viralen Aliquoten zu Tierhaltungen

  1. Legen Sie das 5-ml-Röhrchen mit der endgültigen Virusverdünnung in das Eis und beschriften Sie den Behälter mit einem Biohazard-Aufkleber. Legen Sie eine Probenträgerbox aus Kunststoff mit Papiertüchern aus, um mögliche Verschüttungen aufzufangen.
  2. Legen Sie die für eine intranasale Infektion benötigten Materialien in die mit der Biogefährdung gekennzeichnete Box: eine P200-Pipette, eine ungeöffnete Schachtel mit gefilterten P200-Pipettenspitzen, einen Pen und ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit frischem 10%igem Bleichmittel für Virusabfälle gefüllt ist. Füllen Sie zur Infektionskontrolle ein 1,5-ml-Röhrchen mit dem gleichen kalten D-PBS, das auch zur Verdünnung des IAV verwendet wird.

4. Verabreichung von IAV an Mäuse

HINWEIS: Für die Arbeit mit dem Influenzavirus in der Tierhaltung ist eine Einrichtung der Sicherheitsstufe ABSL2 erforderlich. Zur Standard-PSA gehören ein Kittel, ein Einweg-Laborkittel, zwei Haarhauben, doppelte Nitrilhandschuhe, doppelte Schuhüberzieher, eine Schutzbrille (Schutzbrille) und eine Maske. Das verdünnte Influenzavirus sollte während des gesamten Verabreichungsprotokolls auf Eis gehalten werden, um einen Verlust der Infektiosität zu vermeiden.

  1. Alle Arbeiten mit Viren müssen in einer Biosicherheitswerkbank stattfinden. Obwohl es sich bei dem Influenzavirus A/PR/8/34 um einen an Mäuse angepassten Stamm handelt, sind Influenzaviren anfällig für Mutationen und behandeln das Virus daher so, als wäre es für den Menschen potenziell infektiös.
  2. Verabreichen Sie den Tieren nacheinander eine Isofluran-Anästhesie mit einer Flussrate von 2,5-3% auf der Verdampfermaschine. Bringen Sie Tiere vor der Verabreichung von Influenza von einer Anästhesiebox in einen Nasenkonus.
  3. Wenn eine Maus unter Narkose steht, überprüfen Sie ihre Atmung und kneifen Sie in die Zehen, um zu sehen, ob sie reagiert. Mäuse sind bereit für eine IAV-Infektion, wenn sie auf ein Zehenkneifen mit einem kleinen Krampf oder "Sprung" reagieren - aber nicht, wenn sie wach genug sind, um ihren Kopf zu bewegen.
  4. Mit einer P200-Pipette, die auf 50 μl (oder 2 μl/g Körpergewicht; siehe HINWEIS unten Schritt 2.5) eingestellt ist, verdünntes IAV (oder PBS-Kontrolle) aus der Durchstechflasche auf Eis aspirieren und die Pipette auf die Spitzenbox oder das Papiertuch legen, wo die Spitze nicht mit den Handschuhen oder der Oberfläche der Biosicherheitswerkbank in Berührung kommt.
  5. Nehmen Sie die betäubte Maus durch Schieben auf und halten Sie die Maus mit dem Gesicht nach oben in einem Winkel von 45°. Ziehen Sie die Maus fest genug, dass die Luftröhre für eine bessere Inhalation verlängert wird, aber nicht so fest, dass die Atmung behindert wird. Stellen Sie sicher, dass der Atem der Maus flach, aber gleichmäßig ist, ohne nach Luft zu schnappen.
  6. Pipettieren Sie die IAV-Verdünnung langsam in die Nasenlöcher der Maus. Dies kann mit einer von zwei Methoden erfolgreich erfolgen, wie in den Schritten 4.6.1 und 4.6.2 beschrieben.
    1. Lassen Sie die Virusverdünnung tropfenweise in die Nasenlöcher fallen, wobei Sie zwischen den Nasenlöchern wechseln, so dass das Virus auf beiden Seiten der Nase eindringt.
    2. Erzeugen Sie eine "Blase" aus Viren, die sich über beide Nasenlöcher erstreckt und durch konsequentes und langsames Pipettieren aufrechterhalten wird, während die Maus die Flüssigkeit einatmet.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde konsequent die Blaseninstillationsmethode verwendet, die kontrollierter und reproduzierbarer war. Diese Methode ermöglicht eine einfache Verabreichung der Virussuspension in die Nasenlöcher unter Narkose und erleichtert die natürliche Atmung. Die tropfenweise Methode ist gleichermaßen gültig, aber unabhängig davon, welche Methode verwendet wird, sollte die Konsistenz der Methode in allen Experimenten angewendet werden, um eine geringere Variabilität der Ergebnisse zu gewährleisten.
  7. Halten Sie die Pipettenspitze nahe an die Nase, aber berühren Sie nicht die Nase. Wenn die Maus aufwacht, verabreichen Sie die Hälfte der Dosis und bringen Sie die Maus in den Isofluran-Nasenkegel zurück, bevor Sie die zweite Hälfte der Dosis verabreichen.
  8. Wenn die Maus wach genug ist, um den Kopf zu schütteln, zu husten oder das Virus auszuspucken, ist eine weitere Anästhesie erforderlich, um die Entstehung eines aerosolisierten Virus zu vermeiden und eine gute Infektion zu gewährleisten. Wenn die Maus nicht wach ist, verabreichen Sie die gesamte Dosis. Wenn die Maus wieder auf den Nasenkonus gesetzt wurde, wiederholen Sie Schritt 4.6, um den verbleibenden IAV zu verabreichen.
  9. Werfen Sie die Spitze in einen Abfallbehälter mit frischen 10 % Bleichmittel. Verwenden Sie für jeden Mäusekäfig eine frische Spitze.
  10. Halten Sie die Maus nach jeder IAV-Verabreichung 1-2 Minuten aufrecht, um die Atemwege offen zu halten und sicherzustellen, dass die Grippe ausreichend in die Lunge gelangt ist. Wenn das Grippevirus erfolgreich in die Lunge der Maus gelangt ist, kann das Knistern gefühlt werden, indem man einen Finger auf jede Seite der Brust der Maus legt.
  11. Nachdem sich die Maus erholt hat, setzen Sie sie wieder in den Käfig ein, um sie vollständig wiederherzustellen. Mäuse erholen sich schnell von Isofluran, müssen aber überwacht werden, bis sie ambulant sind.
  12. Zeichnen Sie Ereignisse wie Knistern in der Brust und tiefes Atmen auf, die darauf hinweisen, dass IAV gut eingeatmet wurde, oder Blasen und Nasenspray, die darauf hinweisen, dass ein Teil davon aus den Nasenlöchern der Maus ausgestoßen wurde. Behalten Sie den Überblick über diese Informationen in einer Verletzungsprotokolltabelle (Zusatzdatei 1) und einem Labornotizbuch.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.12 für jede Maus, die infiziert werden soll.

5. Rücktransport zum Labor

  1. Legen Sie 50 ml konisch mit Bleichmittel und Spitzen zurück in die Probenträgerbox aus Kunststoff, zusammen mit der übrig gebliebenen IAV-Verdünnung (falls vorhanden) und den Laborgeräten, die für eine Grippeinfektion verwendet werden.
  2. Sobald Sie wieder im Labor sind, inkubieren Sie alles, was mit dem Virus in Kontakt gekommen ist, mit 10 % Bleichmittel. Besprühen Sie Eiskübel, Pipetten und Tip-Boxen mit 10%iger Bleichlösung, anstatt sie einzutauchen. Bei Raumtemperatur mindestens 30 min inkubieren. Entsorgen Sie feste Abfälle im Behälter für biologisch gefährliche Abfälle und entsorgen Sie flüssige Abfälle in der Spüle und spülen Sie sie mit Wasser.

6. Monitoring von Mäusen und zusätzliche experimentelle Verfahren

  1. Überwachen Sie den Body Condition Score (BCS)17 und das Körpergewicht aller Kontroll- (PBS) und IAV-infizierten Mäuse täglich nach einer Influenzainfektion, entweder am Tag nach der Infektion (Tag 1) oder 3 Tage nach der Infektion (Tag 4). Es ist unwahrscheinlich, dass IAV-infizierte Mäuse bis zum 4. Tag nach der Infektion signifikant an Gewicht verlieren (Abbildung 1).
    HINWEIS: Mäuse, die mehr als 30 % ihres Körpergewichts verlieren oder einen Body Condition Score von 1 erreichen, sollten eingeschläfert werden.
  2. Falls gewünscht, verabreichen Sie Mäusen EdU durch intraperitoneale (i.p.) Injektion oder im Trinkwasser, um die Zellproliferation nach einer Influenzainfektion zu überwachen.
    HINWEIS: Viele Zelltypen in der Lunge der Maus vermehren sich nach IAV-induzierten Schäden9. Es ist möglich, nach Belieben andere Medikamente, spezielles Futter oder spezielles Wasser für bestimmte experimentelle Zwecke zu verabreichen. Denken Sie daran, dass Mäuse während ihrer Genesung von der Influenza nicht so viel essen oder trinken wie sonst, so dass eine injektionsbasierte Verabreichungsmethode wünschenswerter sein kann. Auf der anderen Seite kann es schwierig sein, Mäusen mit einem BCS von 2-2,5 zu injizieren.

7. Entnahme von Lungengewebe für nachgelagerte Ansätze

  1. Entnahme von Lungengewebe für Downstream-Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzanalyse, Durchflusszytometrie oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung in der Mausanlage oder im Labor in einer Biosicherheitswerkbank.
  2. Euthanasieren Sie Mäuse nacheinander mit CO2. Verrenken Sie sich nicht zervikal, um eine Verrenkung der Luftröhre zu vermeiden. Die bilaterale Thorakotomie ist in der Regel eine zugelassene sekundäre Euthanasiemethode.
    HINWEIS: Diese Studie folgt den genehmigten Tierhaltungsrichtlinien der Institution und dem CO2 -Euthanasieprotokoll und hat diese Methode in früheren Influenzastudien konsequent angewendet, ohne signifikante Variabilität bei Lungenschäden oder histopathologischen Ergebnissen einzuführen. Ketamin/Xylazin kann auch zur Einschläferung von Mäusen verwendet werden, um Schäden durch CO2 -Inhalation zu vermeiden. Die CO2 -Inhalation ist jedoch eine akzeptable Methode, wenn die Beschaffung von Ketamin/Xylazin zu kostspielig ist oder wenn die Erlangung einer DEA-Lizenz zu schwierig ist.
  3. Präparieren Sie die Brusthöhle und legen Sie den Brustkorb und die Luftröhre frei.
  4. Schneiden Sie das Zwerchfell auf und präparieren Sie es vorsichtig vom Brustkorb weg, um die Lunge nicht zu punktieren. Schneide an den Seiten des Brustkorbs entlang und entferne den Brustkorb an der Oberseite. Schneiden Sie die Schlüsselbeine ab und präparieren Sie den Knochen und das Weichgewebe von der Vorderseite der Luftröhre weg.
  5. Präparieren Sie den Muskel und das Gewebe, das die Luftröhre umgibt, bis die Knorpelringe sichtbar sind, aber punktieren Sie die Luftröhre nicht. Schieben Sie die Speiseröhre mit einer gebogenen Pinzette hinter der Luftröhre hervor und präparieren Sie sie von der Luftröhre weg.
  6. Fädeln Sie ein Stück Naht hinter die Luftröhre und binden Sie einen losen Nahtknoten (legen Sie ein Ende mit einer Doppelschlaufe um eine Pinzette mit der anderen, greifen Sie das lose Ende der Naht und ziehen Sie das lose Ende durch die Schlaufen).
  7. Perfundierte des Kreislaufsystems mit D-PBS. Klemmen Sie ein großes Gefäß (unter der Vordergliedmaße oder am unteren Ende des Zwerchfells) ab und perfundieren Sie D-PBS durch den rechten Ventrikel (unten am Herzen, mit dem Gesicht nach oben), indem Sie langsam auf das Ende der Spritze drücken. Wenn die Nadel nicht durch die Herzwand sichtbar ist, befindet sie sich wahrscheinlich in der linken Herzkammer. Dadurch wird Blut aus der Lunge entfernt.
    HINWEIS: Schieben Sie keine Blasen. Wenn sich Blasen in der Leitung befinden, stoßen Sie diese aus, bevor Sie D-PBS mit der Spritze drücken. Wenn der Tod von Endothelzellen ein Problem darstellt, ist es schonender, die Schwerkraftperfusion zu verwenden, als PBS von Hand zu drücken.
  8. Wenn Gewebe nur für die Histologie oder Immunfluoreszenz entnommen wird, fahren Sie mit Schritt 7.9 fort. Wenn Sie nur für einzellige Suspension sammeln, schneiden Sie alle Lungenlappen ab und legen Sie sie in PBS auf Eis, dann fahren Sie mit Schritt 7.11 fort.
  9. Lungeninflation für nachgeschaltete Immunfluoreszenz oder Histologie:
    1. Blasen Sie die Lunge in 2 % Paraformaldehyd (PFA) auf und dehydrieren Sie sie durch Ethanol zur Paraffineinbettung oder blasen Sie sie in 2 % PFA auf und dehydrieren Sie sie durch Saccharose für die Kryosektion.
    2. Für RNA-Nachweistechniken wie RNAscope oder Hybridisierungskettenreaktion (HCR) fixieren Sie die Lunge mit 4 % PFA. Für eine optimale Fixierung blasen Sie die Lunge in 2 % ultraniedrigschmelzender Agarose auf und schneiden Sie sie sofort auf einem vibrierenden Mikrotom in 2 % oder 4 % PFA in einer Gewebekulturplatte für die nachgeschaltete Immunfluoreszenz.
  10. Lungeninflation von Hand:
    1. Blasen Sie die Lunge von Hand mit einer Spritze und einer 21-23-G-Nadel mit oder ohne Schlauch oder unter Verwendung der Schwerkraft auf, indem Sie einen Schlauch mit PFA an einem Ringständer 30 cm über der Arbeitsfläche anbringen.
    2. Nachdem Sie die Luftröhre isoliert haben, führen Sie die Nadel in die Oberseite der Luftröhre ein, schrägen Sie sie ab, ohne die Unterseite der Luftröhre zu durchstechen, und ziehen Sie die Naht um die Luftröhre und die Nadel fest, bevor Sie Flüssigkeit einführen.
      HINWEIS: Die Verwendung einer scharfen Nadel birgt im Vergleich zu einer Nadel mit stumpfer Spitze ein geringes Risiko einer Trachealpunktion, und die Forscher müssen während des Eingriffs große Sorgfalt walten lassen, um Schäden zu vermeiden. Wenn eine scharfe Nadel die Luftröhre durchsticht, sollte eine Nadel mit stumpfer Spitze verwendet werden.
  11. Um eine Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierungsanalyse herzustellen, entfernen Sie Lungengewebe aus D-PBS und zerkleinern Sie das Lungengewebe mit einer Schere, dann hacken Sie es mit einer Rasierklinge für 2-3 Minuten, um noch feinere Gewebestücke zu erhalten.
  12. Dissoziieren Sie in einem Aufschlusspuffer, der 480 μl/ml-Kollagenase I, 100 μl/ml-Dispase und 2 μl/ml-DNase in D-PBS enthält, bei 37 °C für 30-35 min. Filtrieren Sie durch 100-μm- und 40-μm-Filter, lysieren Sie alle verbleibenden roten Blutkörperchen mit Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer und resuspendieren Sie in 1 % BSA in PBS für die nachgelagerte Verarbeitung und Analyse.
    HINWEIS: Zum Nachweis einer Virusinfektion und einer Clearance nach einer Infektion in der Lunge ist es möglich, die Viruslast mit qRT-PCR oder TCID50-Assay in Lungenhomogenaten zu bewerten, um die Virusreplikation zu messen. Die Neuraminidase- und Kapsidfärbung kann auch zum Nachweis einer Virusinfektion verwendet werden. Die Virusclearance sollte an den Tagen 8 bis 9 nach der Infektion erfolgen 18,19, während die Reparatur und Regeneration des Lungengewebes mehrere Wochen lang fortgesetztwird 9.

Ergebnisse

Im Vergleich zu nicht infizierten, PBS-behandelten Mäusen zeigen IAV-infizierte Mäuse eine heterogene Gewebeschädigung (Abbildung 1A). Gewebeschäden können mit einem k-Means-Clustering-Algorithmus in MATLAB20 quantifiziert werden (Abbildung 1B). IAV-infizierte Mäuse beginnen zwischen 3 und 4 Tagen nach der Infektion an Gewicht zu verlieren. Bei einem idealen Titer verlieren Mäuse zwischen 20 und 30 % ihres ursprünglichen Körpergewichts, wobei der maximale Gewichtsverlust 8-10 Tage nach der Infektion (dpi) auftritt (Abbildung 1C). Bei 11-12 dpi sollten die Mäuse begonnen haben, an Gewicht zuzunehmen, und sollten um 14 dpi wieder auf 10-15 % ihres ursprünglichen Körpergewichts herankommen. Für Studien zur Regeneration ist es nützlich, wenn die meisten Mäuse im Experiment an Gewicht verlieren und Gewebeschäden erleiden, aber nicht sterben. Aufgrund der Heterogenität der Gewebeschädigung (Abbildung 1A,B) und der möglichen Variabilität in der intranasalen Verabreichung ist es jedoch normal, dass mehrere Mäuse in einem Experiment nicht an Gewicht verlieren oder Gewebeschäden erleiden und dass mehrere Mäuse >30% Körpergewicht verlieren, was zu einer Euthanasie führt (Abbildung 1D). Experimente, die versuchen, einen Unterschied im Überleben und Gewichtsverlust zwischen beispielsweise Mäusen mit KO eines bestimmten Gens und ihren WT-Kontrollen zu bestimmen, müssen möglicherweise den Titer und die Dosierung von IAV anpassen und eine Leistungsberechnung durchführen, um die Stichprobengröße zu bestimmen, die erforderlich ist, um einen solchen Unterschied in diesen beiden Parametern zu erkennen.

Zusätzlich zu den Veränderungen der gesamten Gewebestruktur und der Gesundheit der Maus treten im Verlauf der Reaktion des Gewebes auf Schäden transkriptionelle Veränderungen in allen zellulären Kompartimenten der Lunge auf. Dazu gehören sowohl vorübergehende Zellzustände, die sich letztendlich auflösen, wenn das Gewebe repariert wird, einschließlich vorübergehender oder intermediärer Epithelzellzustände und myeloischer Immunzellzustände, als auch persistierende Zellzustände, die nicht zur funktionellen Reparatur beitragen, einschließlich Krt5+-Epithelzellen und TrkB+-Endothelzellen9. So entsteht beispielsweise im Kapillarendothel der Lunge der Maus bei 6 dpi ein transienter Interferon-stimulierter Endothelzellzustand, der durch eine hohe Expression von Interferon-stimulierten Genen gekennzeichnet ist (Abbildung 2A). Dieser Zustand wird mit 11 bis 19 dpi aufgelöst (Abbildung 2A). Bei 11 dpi entsteht ein verletzungsinduzierter kapillärer endothelialer (iCAP) Zustand, der durch eine hohe Expression von Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 und Bnip3 gekennzeichnet ist (Abbildung 2B). Im Gegensatz zum Interferon-stimulierten Endothelzellzustand bleibt der iCAP-Endothelzellzustand dann in Regionen mit stark geschädigtem Gewebe bestehen und ist ein Jahr nach der Infektion immer noch vorhanden (Abbildung 2C). Transiente alveoläre Epithelzellzustände, einschließlich alveolärer Übergangszellen und unreifer alveolärer Typ-I-Epithelzellzustände (AT1), treten auch nach der Infektion auf (Abbildung 2D). Schließlich führt die Infektion zum Verlust vieler endogener Alveolarmakrophagen (aMAC_a) und ihrer Rekonstitution sowohl aus inflammatorischen Monozyten (iMON) als auch aus endogenen aMACs. Alveolarmakrophagen 1 Jahr nach der Infektion haben je nach Herkunft unterschiedliche Transkriptionszustände (aMAC_a und aMAC_b) (Abbildung 2E)9. Vorübergehende und persistierende Zellzustände, die nach einer akuten Lungenschädigung auftreten, rechtfertigen weitere Studien, da ihr abnormales Verhalten innerhalb der Nische entweder produktiv oder negativ zur erfolgreichen Gewebereparatur und anschließenden Gewebefunktion beitragen kann. Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurden bereits veröffentlicht9 und sind im Gene Expression Omnibus als GEO: GSE262927 hinterlegt.

figure-results-1
Abbildung 1: Überwachung von Lungenschäden und Tiergesundheit. (A) Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung von Lungengewebeschnitten einer scheininfizierten (PBS-behandelten) Lunge auf der linken Seite und einer IAV-infizierten Lunge auf der rechten Seite. Im Vergleich zur unverletzten Lunge weist die IAV-infizierte Lunge heterogene Gewebeschäden auf. Maßstabsbalken, 1 mm. (B) Unter Verwendung eines k-Means-Clustering-Algorithmus in MATLAB20 kann Gewebeschädigung als schwer (rot), beschädigt (grün) oder normal (blau) charakterisiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass im PBS-behandelten Lungenlappen auf der linken Seite die Atemwegsstrukturen aufgrund der Dichte und Färbeintensität der Atemwegsepithelzellen als "schwer" eingestuft werden. Es ist jedoch immer noch möglich, den Unterschied zwischen PBS-behandelter und grippeinfizierter Lunge unter Berücksichtigung dieser Ausgangslage leicht zu erkennen. Maßstabsbalken, 1 mm. (C) Beispiel für eine Gewichtsverlustkurve aus einem repräsentativen IAV-Infektionsexperiment, bei dem Mauslungen 13 Tage nach der Infektion (dpi) entnommen wurden. Die Kurve enthält Daten von sechs Wildtyp-Mäusen, und Punkte stellen den Mittelwert dar, während Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts darstellen. (D) Beispiel für eine Überlebenskurve aus einem repräsentativen IAV-Infektionsexperiment, bei dem die Lungen von Mäusen 14 Tage nach der Infektion (dpi) entnommen wurden. Die Kurve enthält Daten von sieben Wildtyp-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Überwachung der Zustandsänderungen der Kapillarendothelzellen nach einer IAV-Infektion. (A) Bei 6 dpi entsteht ein Interferon-stimulierter EC-Zustand, der zwischen 11 und 19 dpi aufgelöst wird. Die Reanalyse von veröffentlichten Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten aus Mauslungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Influenzainfektion zeigt, dass der Interferonmodul-Score bei allen Kapillarendothelzelltypen mit 6 dpi am höchsten ist. Die Daten wurden mit R erneut analysiert, und der Interferonmodul-Score basiert auf der Expression von 87 Interferon-stimulierten Genen innerhalb jedes Zelltyps. CAP1, Kapillar-Typ-1-Endothelzelle; iCAP, verletzungsinduzierte Endothelzelle; CAP2, Kapillar-Typ-2-Endothelzelle; EC, Endothelzelle. (B) Im Gegensatz dazu tritt ein verletzungsinduzierter EC-Zustand, der durch die Expression von Ntrk2 (TRKB) gekennzeichnet ist, bei 11 dpi auf und bleibt bis zu einem Jahr nach der Infektion bestehen. Maßstabsbalken, 500 μm. (C) Transkriptionsdaten aus der Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Lungenkapillarendothelzellen nach einer Influenzainfektion zeigen die dynamische Natur des Zustands der kapillären Endothelzellen während der Gewebereparatur. (D) Alveolenepithelzellen erfahren auch nach einer Influenzainfektion eine Zellplastizität. Ein alveolärer Übergangszelltyp entsteht zwischen 6-11 dpi und wird durch 19 dpi aufgelöst. Ein unreifer AT1-Zellzustand (AT1_c) entsteht bei 11 dpi und bleibt bis 90 dpi bestehen. (E) Nach der Infektion gehen viele vorhandene Alveolarmakrophagen (aMAC_a) verloren, und bei 6 dpi ist ein Einstrom von inflammatorischen Monozyten (iMON) zu beobachten. Die alveoläre Makrophagenpopulation wird sowohl durch vorhandene aMACs zur Regeneration der aMAC_a Population als auch durch inflammatorische Monozyten rekonstituiert, wodurch die aMAC_b Population entsteht. Obwohl beide einen alveolären Makrophagenzustand darstellen, können die resultierenden aMACs transkriptionell unterschieden werden. Die Diagramme in (C-E) zeigen den prozentualen Anteil der Zellen in jeder Population zu jedem Zeitpunkt im longitudinalen Influenzainfektionsdatensatz und wurden mit R erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Beispiel für ein Verletzungsprotokoll, ein Gewichtsprotokoll und ein Protokoll des Body Condition Score (BCS) zur Überwachung von Tieren nach einer Influenzainfektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier haben wir über eine bequeme Methode zur Übertragung des Influenzavirus auf Mäuse berichtet, um eine schnelle und effektive Schädigung der Lungen von Mäusen zu initiieren und Mechanismen sowohl für eine erfolgreiche Regeneration als auch für eine dysplastische Reparatur zu untersuchen. Wir zeigen, dass die intranasale Inokulation von A/PR/8/34 IAV eine stressfreie Technik sein kann. Es dauert weniger als 2 Minuten pro Maus, um die Inokulation nach der Isofluran-Anästhesie abzuschließen. Es handelt sich um eine einfache und nicht-invasive Technik der Virusinokulation, die dem natürlichen Infektionsweg folgt und es ermöglicht, die Reaktion sowohl des Gewebes als auch des Immunsystems auf physiologisch relevantere Weise zu untersuchen. Viren, die durch die Nasenlöcher der Maus geimpft werden, können sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität induzieren21. Noch wichtiger ist, dass die durch eine Virusinfektion verursachten Schäden in Lungengewebeschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbung gefärbt wurden, deutlich sichtbar sind22 (Abbildung 1). Eine vollständige Zeitleiste der erwarteten transkriptionellen Veränderungen der Lungenzelltypen in jedem Kompartiment der Lunge wurde bereits veröffentlicht9. In dieser Arbeit haben wir eine Teilmenge dieser Daten erneut analysiert, um zu zeigen, dass in den kapillarendothelialen, alveolärenpithelialen und myeloischen Immunkompartimenten der Mauslunge im Verlauf der Reaktion auf eine Influenzainfektion von nicht infizierten Mäusen bis zu einem Jahr nach der Infektion vorübergehende und persistente transkriptionelle Veränderungen auftreten (Abbildung 2).

Dieses Protokoll enthält mehrere kritische Schritte, und eine angemessene Fehlerbehebung dieser Schritte führt zu einem erfolgreichen Experiment. Das Influenzavirus A/PR/8/34 ist ein an die Maus angepasster Influenzastamm, der den Menschen nicht produktiv infiziert23, aber es ist immer wichtig, während des Experiments alle angegebenen Sicherheitsverfahren zu befolgen, um jede Möglichkeit einer Infektion des Laborpersonals zu vermeiden. Die Verabreichung einer Isofluran-Anästhesie ist ein entscheidender Schritt, um die erfolgreiche Abgabe des Virus zu gewährleisten, da Mäuse das Virus nicht gut einatmen, wenn sie wach sind. Überprüfen Sie die Atmung und überwachen Sie die Bewegung des Mauskopfes während des Eingriffs, um sicherzustellen, dass das Virus in beide Nasenlöcher geimpft wird. Werden Mäuse nicht vollständig betäubt, können Blasen entstehen, die sowohl die Inhalation des Virus einschränken als auch Aerosole erzeugen. Beide Ergebnisse sollten vermieden werden, und Mäuse sollten wieder auf den Isofluran-Nasenkegel gesetzt werden, wenn Niesen oder Blasen an den Nasenlöchern beobachtet werden. Die Überwachung nach der Infektion, wie z. B. die Messung des Gewichtsverlusts, des Body Condition Score und des Gesundheitszustands sowie die Bereitstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Regeneration, ist ebenfalls ein wichtiger Bestandteil dieses Experiments. Wenn beobachtet wird, dass Mäuse nicht ausreichend Gewicht verlieren oder nicht das erwartete Ausmaß an Gewebeschäden aufweisen (Abbildung 1), ist es möglich, dass die Dosis zu niedrig ist. Auf der anderen Seite, wenn viele Mäuse den Endpunkt eines Körpergewichtsverlusts von 30 % erreichen, ist es möglich, dass die Dosis zu hoch ist. In beiden Fällen ist es am besten, die richtige Dosis durch einen empirischen Titer der Viruscharge unter Verwendung einer Kohorte von C57BL/6-Mäusen zu bestimmen, wie wir hier beschreiben.

Da Influenzainfektionen nach wie vor weltweit verbreitet sind, schwere Atemwegserkrankungen verursachen und tödlich verlaufen können, ist es von größter Bedeutung, den Prozess der viralen Infektiosität und die zelluläre Reaktion auf Infektionen und Gewebeverletzungen in der Lunge zu verstehen. Die in dieser Studie beschriebene intranasale Infektionsmethode kann daher bei der Identifizierung wichtiger Regulationsmechanismen und der Entwicklung neuartiger Therapieansätze für Lungenerkrankungen helfen. Darüber hinaus könnten zukünftige Anwendungen der Technik einen anderen Stamm des mausadaptierten Influenzavirus, wie z. B. X31, verwenden, um die Auswirkungen auf die Struktur und Funktion des Lungengewebes im Falle wiederholter Atemwegsinfektionen zu bestimmen. Da viele Menschen im Laufe ihres Lebens mehreren Atemwegsinfektionen ausgesetzt sind, könnte eine solche Erweiterung dieses Modells wichtige Auswirkungen auf die Erforschung der Regeneration des Lungengewebes und damit auf die öffentliche Gesundheit haben.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program der US National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute, Center for Cancer Research, unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Röhre Fisher Scientific02-682-557
100 & Mikro; M-Zell-SiebFalke352360
15 mL konische RöhreFalke352196
1x PBSGibc010010-023
40 & Mikro; M-Zell-SiebFalke352340
5-mL-RöhreKugel6101C
50 mL konische RöhreFalke352098
A/PR/8/34 Influenza-Virus-AktieATCC VR-95PQVerschiedene Chargen haben unterschiedliche virale Titer
ACK Lysis-PufferQualitätsbiologisch118-156-101
Anti-TRKB-AntikörperR& D-SystemeAF1494
BleichmittelClorox10% Bleichmittel
Rinderserum-AlbuminSigma AldrichA8022
CO2-Anästhesie-InduktionskammerJeglicheN/A
Kollagenase Typ IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispaseCorningCB-40235
Zerlegungswerkzeuge: Schere, gebogene Zange, gerade PinzetteJeglicheN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EthanolPharmco111000200
GlasphiolenDWK Life Sciences986562
EiskübelJeglicheN/A
IsofluraneCovetrus29404
Nadeln, 21 & Dash; 23 GJeglicheN/A
P20/P200 Pipette PipetmanF144056M/F144058M,
P20/P200 PipettenspitzenThomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldehyd (PFA) ThermowissenschaftlichJ19943-k22 % PFA
PipetmanJeglicheN/A
Gefrierboxen aus Kunststoff oder PappeJeglicheN/A
RasierklingeJeglicheN/A
RingstandJeglicheN/A
Serologische Pipeten, 5 mLFalke357543
Schiebedecke Induktionsmaus Isofluran-KammerSomni Scientific
NahtFisher ScientificNC9422522
Spritzenrohr und Luer-LocksJeglicheN/A
Spritze, 10 mlJeglicheN/A
Tischanästhesiemaschine IsofluraneOhmedaOhmeda Isotec-4Die Durchflussrate sollte 2,5 % erreichen; 3%
Ultra-niedrig schmelzende AgaroseSigma AldrichA5030-1G
WaageOHAUSCS200

Referenzen

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Intranasale Infektionalveolare EpithelzellenEndothelzellzust ndeEinzelzellsequenzierungDurchflusszytometrieVerdauung von LungengewebeImmunfluoreszenzf rbungalveolare Makrophagen
Modellierung der dysplastischen und funktionellen Lungenalveolarreparatur nach einer Influenzainfektion
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.