Forschungsartikel
CD44 erleichtert die Pathogenese der Krankheit, indem es Entzündungskaskaden und osteoklastische Differenzierung über die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs orchestriert. Glycitein übt therapeutische Wirkungen auf komorbide Osteoporose (OP) + Parodontitis (PD) Manifestationen durch gezielte Abschwächung der CD44-vermittelten Signalübertragung aus.
Diese Untersuchung klärt die kritischen molekularen Determinanten auf, die mit der Komorbidität von Osteoporose (OP) und Parodontitis (PD) durch proteomisches Profiling verbunden sind, während die regulatorische Funktion von CD44 bei experimenteller Parodontitis in einem OP-Mausmodell beschrieben wird. In Phase I wurden Serumproben von Patienten mit OP+PD (n = 3) und gesunden Kontrollen (n = 6) entnommen, die in unserer Einrichtung routinemäßigen Gesundheitsuntersuchungen unterzogen wurden, um eine vergleichende Proteomanalyse durchzuführen. Die anschließende translationale Validierung von differentiell exprimierten Genen (DEGs) und den damit verbundenen Signalkaskaden wurde an klinischen Proben und OP+PD-Mausmodellen durchgeführt. Um die Rolle von CD44 bei der Parkinson-Progression unter osteoporotischen Bedingungen mechanistisch zu charakterisieren, wurde ein OP-Mausmodell durch bilaterale Ovariektomie erstellt, gefolgt von einer experimentellen Parkinson-Induktion durch Ligaturplatzierung. Zu den umfassenden Untersuchungen gehörten histomorphometrische Veränderungen durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung, mikroarchitektonische Knochenanalyse im ersten Molarenbereich des Oberkiefers mittels Mikro-CT und Immunblotting-Bewertung von Komponenten des Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)/Akt-Signalwegs. Ein paralleles pharmakologisches Netzwerk-Screening in Verbindung mit molekularen Docking-Simulationen wurde durchgeführt, um bioaktive Bestandteile von Angelica sinensis mit therapeutischem Potenzial zu identifizieren. Die proteomische Befragung identifizierte CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP und VWF als Kandidaten für pathogene Mediatoren in der OP+PD-Pathogenese. In unseren Händen zeigte die Analyse der Gensatzanreicherung, dass der PI3K/Akt-Signalweg als Hauptmediator für das Fortschreiten der OP+PD-Krankheit fungiert. Die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR-basierte Validierung bestätigte eine signifikante CD44-Hochregulation sowohl in klinischen als auch in experimentellen OP+PD-Kohorten. Die In-vivo-Modulation über CD44-Suppression stellte die Integrität des parodontalen Gewebes signifikant wieder her, reduzierte die Infiltration von Entzündungszellen und stärkte die Mikroarchitektur des Alveolenknochens bei OP-Mäusen, was mit einer Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs einherging. Die Netzwerkpharmakologie zeigte, dass Glycitein der primäre bioaktive sekundäre Pflanzenstoff in Angelica sinensis ist, wobei CD44 als zentrales molekulares Ziel identifiziert wurde. Glycitein verbesserte die alveoläre Knochenstruktur bei OP+PD-Mäusen, erhöhte die Knochenvolumenfraktion (BV/TV), die Trabekeldicke (Tb.Th), die Knochenmineraldichte (BMD) und reduzierte die Trabekelzahl (Tb.N) und das Verhältnis von Knochenoberfläche zu Knochenvolumen (BS/BV), was auf eine gesündere Knochenqualität hinweist, was mechanistisch auf die Abschwächung der CD44-Signalachse zurückzuführen ist.
Die Parodontitis (PD) ist eine komplexe, gemischte mikrobielle Erkrankung, die durch die Ablagerung pathologischer Biofilme im Zahnfleischsulcusverursacht wird 1. Sie ist gekennzeichnet durch ein Ungleichgewicht im mikroökologischen Milieu, das eine pathologische Entzündungskaskade innerhalb des Wirts auslöst, die schließlich zu einer irreversiblen fortschreitenden Schädigung des Zementes, des parodontalen Ligamentums und des Alveolarknochens führt, die Bestandteile des parodontalen Attachmentsystems sind. Dies kann zu Zahnlockerungen oder sogar Zahnverlust führen2. Die Menge wurde zur Vergleichbarkeit standardisiert, und die jüngsten epidemiologischen Daten3 zeigen, dass weltweit über 1,066 Milliarden Menschen an schwerer Parodontitis leiden, mit einer altersstandardisierten Prävalenz von etwa 12,5 %, was auf erhebliche Unterschiede zwischen den internationalen Bevölkerungen hinweist.
Die Osteoporose (OP), eine systemische Knochenerkrankung, ist gekennzeichnet durch eine erhebliche Verschlechterung der Knochenmikrostruktur und einen systematischen Verlust an Knochenmasse 4,5. Das Risiko für Frakturen wird durch diese strukturelle Schwäche vor allem bei älteren Menschen stark erhöht. Bemerkenswert ist, dass Personen ab 65 Jahren in Japan eine höhere Prävalenz von Parodontalerkrankungen aufwiesen als Erwachsene zwischen 30 und 64 Jahren. Postmenopausale Frauen haben eine höhere Inzidenz von Parodontalerkrankungen und leiden häufig unter anderen Gesundheitsproblemen 6,7. Die Studie prognostiziert, dass die Krankheitslast von 2005 bis 2025 um über 50 % zunehmen wird, wobei die wirtschaftlichen Kosten voraussichtlich von 17 Milliarden US-Dollar auf 25 Milliarden US-Dollar steigen werden. Die Studie prognostiziert, dass die Krankheitslast von 2005 bis 2025 um über 50 % zunehmen wird, wobei die wirtschaftlichen Kosten voraussichtlich von 17 Milliarden US-Dollar auf 25 Milliarden US-Dollar steigen werden. Dieser Trend unterstreicht die erheblichen sozioökonomischen Auswirkungen dieser Parodontalerkrankungen. Darüber hinaus besteht bei weiblichen Patientinnen mit Parodontitis und Gingivitis eine klare positive Korrelation zwischen der Dauer der Erkrankung und ihrer Chronizität und den erhöhten Gesundheitsrisiken8.
Frühere Studien deuteten darauf hin, dass OP die Entwicklung von Parkinson fördern kann und umgekehrt, was auf gemeinsame Risikofaktoren für beide Krankheiten zurückzuführen ist, wie z. B. Altern, Rauchen und unzureichende Kalzium- und Vitamin-D-Aufnahme. In der postmenopausalen weiblichen Population konnte eine schwere OP von einem verringerten Mineralgehalt des Unterkiefers begleitet werden, was mit einem Mangel an parodontaler Bindung verbunden sein könnte9. Es wurde gezeigt, dass eine OP-assoziierte reduzierte Knochendichte die PD-induzierte Resorption des alveolären Knochens beschleunigen und dadurch die Invasion parodontaler Krankheitserreger begünstigenkann 10. Unter einer Reihe von altersbedingten und physiologischen Veränderungen im Zusammenhang mit gesundheitlichen Herausforderungen sind Parkinson und OP mit der Beschleunigung der Alterung der Weltbevölkerung und der signifikanten Zunahme der Zahl der Frauen in den Wechseljahren besonders prominent. Daher ist die Klärung der relevanten Indikatoren und ihrer Zusammenhänge von entscheidender Bedeutung für die Prävention, Behandlung und prognostische Beurteilung von Krankheiten. Motiviert durch diese Aspekte nutzte diese Studie die Proteomik, um Schlüsselproteine zu screenen, mit einem Schwerpunkt auf CD44-vermittelten PI3K/Akt-Signalwegen, bei der Entwicklung von OP+PD und untersuchte die regulatorischen Rollen und möglichen Mechanismen von Schlüsselproteinen anhand eines experimentellen Parkinson-Modells in OP-Mäusen. Weiteres Screening von zielgerichteten Therapeutika in Angelica sinensis - einem traditionellen chinesischen Heilkraut, das in der klinischen Praxis aufgrund seiner entzündungshemmenden und knochenschützenden Eigenschaften weit verbreitet ist und von dem zuvor berichtet wurde, dass es den Knochenschwund lindert und Entzündungsreaktionen bei Osteoporose und Parodontitis moduliert. Geleitet von der Netzwerkpharmakologie und dem molekularen Docking wurde Glycitein als primärer bioaktiver phytochemischer Stoff und als rationaler Kandidat für eine OP+PD-Intervention identifiziert.
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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Tiere geprüft und genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid der Tiere so gering wie möglich zu halten.
Ziel dieser Studie ist es, die Rolle der CD44-vermittelten Regulation des PI3K/Akt-Signalwegs bei der osteoklastischen Differenzierung und Entzündungsprogression während komorbider Osteoporose und Parodontitis (OP+PD) zu untersuchen und festzustellen, ob Glycitein, eine bioaktive Substanz aus Angelica sinensis, diese Effekte therapeutisch modulieren kann. Die Begründung ergibt sich aus neuen Erkenntnissen, die eine Verbindung zwischen CD44-Überexpression und pathologischer Knochenresorption und Immundysregulation bei OP+PDherstellen 11,12,13. Durch die Integration von Proteomik, In-vivo-Modellierung und Netzwerkpharmakologie untersucht das Protokoll systematisch molekulare Mechanismen und therapeutische Interventionen, um das Fortschreiten der Krankheit zu mildern14.
Die Stichprobengröße für In-vivo-Experimente basierte auf früheren Studien und Power-Analysen, was zu n = 6 pro Gruppe führte, was eine ausreichende statistische Aussagekraft zur Erkennung signifikanter Unterschiede (P < 0,05) zwischen den Behandlungsbedingungen gewährleistet. Glycitein wurde in Dosierungen von 50 mg/kg und 100 mg/kg verabreicht, in 5 % DMSO in Olivenöl suspendiert und über eine tägliche orale Sonde verabreicht. Die Mäuse wurden über 8 Wochen nach Induktion der Parkinson überwacht. Bei der Ligaturplatzierung zur Induktion einer parodontalen Entzündung wurde 5-0-Seidenfaden verwendet, und eine bilaterale Ovariektomie wurde unter 0,3 % Pentobarbital-Natriumanästhesie (0,5 ml/100 g) durchgeführt15. Darüber hinaus wurden molekulare Assays, einschließlich RT-qPCR, Western Blot und ELISA, unter Verwendung validierter Protokolle16 durchgeführt, und histologische Auswertungen, wie z. B. Hämatoxylin-Eosin (H&E) und Methylenblau-Färbung, folgten den festgelegten Zeitplänen und Färbedauer.
Alle experimentellen Verfahren mit chemischen Reagenzien, Färbemitteln und biologischen Proben wurden nach Standard-Biosicherheitsprotokollen durchgeführt, um Gesundheitsrisiken zu minimieren. Gefährliche Materialien wie Formalin, EDTA, Methylenblau und saures Fuchsin wurden mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhen, Masken und Schutzbrillen gehandhabt. Alle Abfallmaterialien, einschließlich gebrauchter Reagenzien und kontaminierter Einwegartikel, wurden in dafür vorgesehenen Behältern für biologische Gefahrstoffe gesammelt und über zertifizierte Entsorgungsdienste für gefährliche Abfälle gemäß institutionellen und ökologischen Sicherheitsrichtlinien entsorgt. Abbildung 1 zeigt den gesamten experimentellen Arbeitsablauf.
Klinische Datenerfassung
In unserer Studie haben wir systematisch klinische Ausgangsdaten und detaillierte Anamnesen von drei OP+PD-Patienten und sechs Kontrollpersonen gesammelt und umfassend analysiert, einschließlich demografischer und Lebensstilfaktoren sowie anatomischer und metastasierter Profile. Darüber hinaus wurde eine strenge Bestätigung des Testergebnisses auf eine HPV-Infektion (positiv oder negativ) durchgeführt. Das Progressionsstadium bzw. Rezidivmuster metastasierender Läsionen wurde detailliert erfasst. Während der ersten 7 Tage der Immuntherapie wurden die Blutproben der Patienten systematisch entnommen und standardisiert, einschließlich biochemischer Indikatoren wie Blutroutinetests. Routinemäßige Blutuntersuchungen wurden in strikter Übereinstimmung mit Standardverfahren durchgeführt, um Schlüsselparameter wie Blutplättchen, Lymphozyten und Neutrophile genau zu bewerten. Das Serumalbumin wurde parallel gemessen, und die Leberfunktion wurde durch quantitative Analyse des Globulinkonzentrationsindex beurteilt.
Patienten
Bewertung der Knochenmineraldichte und Stratifizierung der Teilnehmer
Wir führten einen systematischen Vergleich der Knochendichtemessungen im Lendenwirbelbereich und im Schenkelhals durch. Alle Untersuchungen wurden von erfahrenen Radiologen unserer Abteilung durchgeführt, die Präzisionsgeräte zur genauen Quantifizierung der Knochendichtewerte verwendeten. Um eine standardisierte Probenentnahme zu gewährleisten, mussten die Teilnehmer vor der Probenahme mindestens 8 Stunden fasten. Durch die Integration von Knochendichtedaten mit umfassenden parodontalen Bewertungsdaten haben wir die Probanden streng entweder in die Gruppe der Osteoporose mit Parodontitis (OP+PD) oder der gesunden Kontrollgruppe (HC) eingeteilt, um sicherzustellen, dass das Geschlechterverhältnis zwischen den beiden Gruppen perfekt abgestimmt war. Das Gender-Matching bezieht sich auf die gleichmäßige Verteilung der Weibchen zwischen der OP+PD- und der gesunden Kontrollgruppe. Es wurden jedoch nur weibliche Teilnehmer in diese Studie eingeschlossen, um sich auf postmenopausale Osteoporose zu konzentrieren. In keiner der beiden Gruppen gab es männliche Probanden. Die Studie hielt sich an die ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki, wobei alle Teilnehmer formelle Einwilligungserklärungen unterschrieben und ihre Rechte in vollem Umfang schützten.
Diagnostische Parameter
Osteoporose wurde gemäß den chinesischen Richtlinien für die Diagnose und Behandlung der primären Osteoporose (2022)17 definiert, wobei die diagnostischen Schwellenwerte bei einem T-Score ≤ -2,5 Standardabweichungen (SD) für die lumbale (L1-L4) oder Hüft-BMD festgelegt wurden. Das Parodontitis-Staging folgte dem World Workshop Classification of Periodontal Diseases18 von 2018, wobei die Aufnahme auf Fälle des Grades A und der Stadien II-III beschränkt war. Einschlusskriterien: Postmenopausale Frauen im Alter von 50-65 Jahren, Doppeldiagnose von OP und Parkinson, die die oben genannten Kriterien erfüllt, keine Autoimmunerkrankungen, keine bösartigen Neubildungen in der Vorgeschichte, normale Herz-Lungen-, Leber- und Nierenfunktion. Ausschlusskriterien: Abgelehnte Teilnahme des Patienten oder der Familie, kürzlich (≤6 Monate) Pharmakotherapie bei OP oder Parkinson.
Proteomische Profilerstellung von Serumproben
Serumproben von drei OP+PD-Patienten und sechs Kontrollpersonen wurden für die proteomische Analyse entnommen. Die relative Proteinquantifizierung wurde durch Standardverfahren erreicht, und differentiell exprimierte Proteine wurden als solche mit P < 0,05 und Faltungsänderung > 1,519 definiert.
Analyse der Gensatzanreicherung (GSEA)
GSEA wurde verwendet, um wichtige Signalwege zu identifizieren, die zwischen der Kontroll- und der OP+PD-Kohorte fehlreguliert sind. Transkriptomische Rohdaten wurden zunächst mit Hilfe der log2-Konvertierung transformiert und durch Quantilnormalisierung normalisiert, um Batch-Effekte zu entfernen. Gensätze mit mehreren biologischen Funktionen wurden aus der Molecular Signatures Database (MSigDB) gescreent, und die statistische Signifikanz wurde mit dem nicht-parametrischen Wilcoxon-Rangsummentest bewertet. Die Anreicherungsergebnisse wurden unter Verwendung normalisierter Anreicherungswerte und Falschentdeckungsraten (FDR < 0,25) berichtet.
Analyse des gewichteten Gen-Co-Expressionsnetzwerks (WGCNA)
WGCNA wurde verwendet, um Genmodule zu identifizieren, die signifikant mit OP+PD-Phänotypen assoziiert sind. Eine weiche Schwelle von 12 wurde gewählt, um eine skalenfreie Netzwerktopologie zu erreichen (R2 > 0,85), und die Pearson-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um die Beziehungen zwischen Moduleigengenen und klinischen Merkmalen zu bewerten. Funktionelle Anreicherungsanalysen wurden durchgeführt, um relevante biologische Signalwege in stark korrelierten Modulen aufzudecken.
Etablierung von Ovariektomie-induzierten osteoporotischen Mausmodellen
An dieser Studie nahmen 116 weibliche Mäuse mit Lichtschutzfaktor teil. Vor den Experimenten wurden die Tiere für eine 7-tägige Anpassungsphase unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen untergebracht, in der sie standardisiertes Nagetierfutter und destilliertes Wasser erhielten. Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren folgten streng den ethischen Protokollen, die von der Ethikkommission des Xi'an Jiaotong University Health Science Center unter der Zulassungsnummer 0609 genehmigt wurden. Die Studie wurde unter der Projektnummer [2024-054] registriert.
Chirurgisches Protokoll der bilateralen Oophorektomie (OVX):
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 0,3 % Pentobarbital-Natrium (0,5 ml/100 g Körpergewicht) anästhesiert. Das Rückenfell wurde operativ enthaart und die Tiere wurden in Rückenlage auf einer beheizten, sterilen Operationsplattform gelagert. Nach aseptischer Aufbereitung mit 75%igem Ethanol wurden bilaterale paravertebrale Schnitte (1 cm lateral der Wirbelsäule) auf Höhe der Nierenfettpolster vorgenommen. Der Schleimbeutel der Eierstöcke wurde exteriorisiert und der Eileiter wurde proximal zum Eierstock mit 5-0-Seidennähten ligiert, gefolgt von der Exzision der bilateralen Eierstöcke, des zugehörigen Fettgewebes und der partiellen Eileiterstrukturen. Muskulofasziale und kutane Schichten wurden nacheinander mit 4-0 resorbierbaren Nähten verschlossen. Die postoperative Antisepsis wurde mit 75% Ethanol durchgeführt.
Kontrollen der Scheinchirurgie:
Scheinoperierte Mäuse durchliefen identische Verfahrensschritte, einschließlich der Exposition der Eierstöcke und der Resektion des periovariellen Fettgewebes, ohne Exstirpation der Eierstöcke.
Postoperatives Management:
Die postanästhetische Genesung wurde mit zirkulierenden Wasserheizkissen bis zur vollständigen Ambulanz erleichtert. Die Analgesie wurde durch subkutane Carprofen-Verabreichung (5 mg/kg täglich) für 72 Stunden postoperativ aufrechterhalten, ergänzt mit prophylaktischem Penicillin G (50.000 IE/kg) für 48 Stunden, um Wundinfektionen zu verhindern. Die Körpermasse wurde während der 6-wöchigen osteoporotischen Modellierungsphase wöchentlich überwacht, wobei Ausschlusskriterien auf Tiere angewendet wurden, die einen Gewichtsverlust von >20 % oder klinische Beschwerden aufwiesen.
Aufbau eines experimentellen OP+PD-Tiermodells
Das experimentelle PD-Modell wurde auf der Grundlage des zuvor etablierten OP-Tiermodells entwickelt. Um Fadenbruch zu vermeiden und ein reibungsloses Einbringen zwischen den Backenzähnen zu gewährleisten, wurde für die Ligatur eine 5-0-Seidennaht verwendet. Während des Eingriffs wurde der Mundwinkel der Maus vorsichtig zurückgezogen, der Faden mit einer Pinzette gegriffen und vorsichtig im Gebärmutterhalsbereich zwischen dem ersten und zweiten Backenzahn platziert. Der Draht und die Spitze der Pinzette wurden waagerecht gehalten, um das Trauma der Wangenschleimhaut zu minimieren und dadurch das Risiko von Blutungen oder Mortalität zu verringern. Die andere Hand zog sanft am gegenüberliegenden Ende des Drahtes und führte ihn allmählich in den Interproximalraum zwischen den Backenzähnen. Sobald der Faden richtig positioniert war, wurde ein Abschnitt in der Nähe der bukkalen Seite mit einer Pinzette festgeklemmt und vorsichtig zwischen dem zweiten und dritten Backenzahn mit der gleichen Technik geführt. Sanfter Zug nach unten sorgte für einen reibungslosen Durchgang der Seide. Zum Schluss wurde der Faden fest um den zweiten Backenzahn im mittleren Halsbereich gebunden. Die Mäuse konnten sich anschließend erholen.
Quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
Die Materialtabelle listet spezifische Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen für RT-qPCR auf, die auf Gene abzielen, die mit Entzündungen, Gerinnung und Zelladhäsion in Verbindung stehen, einschließlich CD44, CDH13, VWF und GAPDH. Die für die RT-qPCR-Analyse verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Western-Blot-Analyse
Die Expressionseigenschaften von Schlüsselproteinen des Signalwegs in parodontalen Geweben wurden systematisch mittels Western Blot untersucht. Die parodontalen Gewebe wurden einer Gefrier-Tau-Homogenisierung unter Verwendung von RIPA-Puffern unterzogen, die Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielten, um das Gesamtprotein effizient zu extrahieren. Nach einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation (12.000 × g, 4 °C, 10 min) zur Abtrennung des Lysats wurde der Überstand verwendet, um die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit genau zu messen und so zuverlässige Daten für nachfolgende Experimente zu liefern.
Für jede Versuchsgruppe wurden 30 μg Gesamtprotein geladen und durch ein 10% SDS-PAGE-System getrennt. Die aufgelösten Proteine wurden dann mit einem Semi-Dry-Blotting-Verfahren auf PVDF-Membranen übertragen. Um Hintergrundstörungen zu minimieren, wurden die Membranen mit 5 % fettfreier Trockenmilch für h bei Umgebungstemperatur verstopft. Anschließend wurden die Membranen für die weitere Verarbeitung in einer stabilen Umgebung bei 4 °C gehalten.
Die Membranen wurden dann mit spezifischen Primärantikörpern (siehe Materialtabelle) für 2 h bei °C inkubiert. Am folgenden Tag wurde TBST-Puffer für eine gründliche Reinigung verwendet, und die Membranen wurden dann mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von 1:10.000 für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Alle Immundetektionsschritte wurden in strikter Übereinstimmung mit standardisierten Protokollen durchgeführt, um die Konsistenz und Validität der Signalweganalysesicherzustellen 20.
Durch die Verwendung von ECL-Substraten (Enhanced Chemiluminescence) zur Erfassung von Signalen und hochauflösenden Bildgebungsgeräten zur präzisen Lokalisierung von Proteinbanden wurden die optischen Dichtewerte der Banden mit der ImageJ-Software quantitativ analysiert. Durch den systematischen Vergleich der relativen Expressionsniveaus von Zielproteinen/β-Aktin in jeder Gruppe mit der Kontrollgruppe konnten schließlich der Aktivierungsgrad und die dynamischen Veränderungen des PI3K/Akt-Signalwegs unter verschiedenen Interventionen genau bewertet werden.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Unter Verwendung von ELISA-Kits (siehe Materialtabelle) wurde in dieser Studie eine präzise Quantifizierung verschiedener inflammatorischer Zytokine, einschließlich TNF-α, IL-6, IL-1β und IL-4, in Serumproben erreicht. Es untersuchte auch die Konzentrationen von TRAP5b, ALP und TGF-β als Marker für die Osteoklastenaktivität. Eine 96-Well-Platte, die mit Capture-Antikörpern vorbeschichtet war, wurde bei 25 °C inkubiert, wobei Serumproben 2 h lang 1:10 in PBS verdünnt wurden, so dass Antigene spezifisch an die immobilisierten Capture-Antikörper binden konnten. Nach der Inkubation wurden die ungebundenen Substanzen über drei Waschgänge mit PBS-T (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20) entfernt. Anschließend wurden Biotin-markierte Nachweisantikörper zugegeben und 1 Stunde lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Als nächstes wurde Streptavidin-HRP eingeführt, um die biotinylierten Antikörper zu binden, und das Gemisch wurde für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur unter lichtgeschützten Bedingungen inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde dann mit der Stopplösung beendet, und die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um die Zytokinkonzentrationen zu bestimmen.
Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)
Standardmethoden wurden verwendet, um H&E-Färbungen an paraffineingebetteten Schnitten von parodontalem Gewebe durchzuführen, um mikrostrukturelle Veränderungen zu analysieren. Der Probenvorbereitungsprozess umfasste eine anfängliche Fixierung in einer 4%igen Paraformaldehydlösung für 24 Stunden, gefolgt von einer abgestuften Ethanol-Dehydratisierung (70 %, 80 %, 95 % und 100 %) und einer Reinigung in Xylol und schließlich der Einbettung in Paraffin, um 4 μm dicke Schnitte herzustellen21. Nach der Entparaffinierung in Xylol wurden die Proben durch absteigende Ethanolkonzentrationen (100 % bis 70 %) rehydriert. Der Färbeprozess begann mit einem 5-minütigen Eintauchen in Hämatoxylin (Meisner-Syndrom), gefolgt von einem Spülen unter fließendem Wasser, einer Differenzierung in 1%igem sauren Alkohol in Ethanol und einem weiteren Spülen. Die Schnitte wurden dann 10 s lang mit 0,5 % Eosin gefärbt, um das Protokoll abzuschließen.
Nach der Färbung wurden die Objektträger in einer abgestuften Ethanolserie erneut dehydriert, in Xylol geklärt und mit Einbettmedium versiegelt. Die Beobachtungen wurden unter einem Mikroskop durchgeführt, das mit 10x- und 40x-Objektiven für eine hochauflösende Bildaufnahme ausgestattet war. Die histologische Analyse beurteilte die strukturelle Integrität des parodontalen Bindegewebes, die Infiltration von Entzündungszellen und die Morphologie der alveolären Knochenresorption. Das Ausmaß der Entzündung wurde anhand eines verbesserten Loe-Silness-Index bewertet, wobei zwei Pathologen, die für die Probenidentität verblindet waren, die Proben unabhängig voneinander über eine semiquantitative Skala bewerteten, um Objektivität und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten22.
Methylenblau-Färbung
In dieser Studie wurde die Methylenblau-Färbemethode an standardisierten, bearbeiteten Alveolarknochenschnitten des Oberkiefers verwendet, um den Grad der Knochenresorption zu quantifizieren. Das experimentelle Verfahren begann mit der Gewebefixierung: Das Parodontalgewebe wurde 24 h lang in 10%iger neutraler Formalinlösung fixiert, gefolgt von einer 21-tägigen Entkalkungsbehandlung in 10%iger EDTA-Lösung (pH 7,4). Nach der Entkalkung wurden die Proben paraffineingebettet und in 4 μm dicke Gewebeschnitte präpariert, die dann auf silanisierte Objektträger montiert wurden. Der Vorbehandlungsprozess der Sektion umfasste die Entparaffinierung von Xylol, die Gradienten-Ethanolhydratation und die Inkubation in einem 60 °C warmen Wasserbad. Die Objektträger wurden dann 15 Minuten lang mit 0,1%iger Methylenblaulösung gefärbt.
Nach der Färbung wurden die Schnitte 1 Minute lang mit destilliertem Wasser gewaschen, das auf 60 °C vorgewärmt worden war, um eine effektive Entfernung von überschüssigem Farbstoff zu gewährleisten, ohne die Gewebestruktur zu beschädigen. Anschließend wurden sie 5 Minuten lang mit 0,1% saurem Fuchsin gegengefärbt, um den Kontrast zwischen den Gewebestrukturen zu verbessern. Dieses Färbeprotokoll lieferte eine konsistente und zuverlässige Visualisierung für die quantitative Analyse der Alveolarknochenresorption23. Schließlich wurden die Objektträger mit abgestuftem Ethanol dehydriert, in Xylol gereinigt und montiert. Das gefärbte Knochengewebe wurde unter einem Lichtfeldmikroskop analysiert, und es wurden hochauflösende Bilder aufgenommen, um die Resorption der alveolären Knochenkanten für die anschließende morphologische Bewertung genau zu beurteilen.
Mikro-Computertomographie (Micro-CT) Analyse
Mikro-CT-Scans wurden durchgeführt, um 3D-Mikrostrukturveränderungen im Alveolarknochen von OP+PD-Modellmäusen zu beurteilen, die speziell auf die obere Region des ersten Molaren abzielten. Nach 8 Wochen postoperativer Überwachung wurden die Mäuse humanerweise durch CO2 -Inhalation eingeschläfert, eine Methode, die zur Erhaltung der Kiefer- und Gesichtsstrukturen geeignet ist. Anschließend wurden Oberkieferproben entnommen und 48 h24 lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert.
Die Mikro-CT-Analyse wurde mit den rekonstruierten DICOM-Bildern der Oberkieferregion durchgeführt, die in die Software importiert wurden, indem der Datensatz ausgewählt wurde, der den gescannten Proben entspricht. Eine Standard-Region of Interest (ROI) wurde manuell als mesialbukkaler Drittel der Wurzel des ersten Oberkiefermolaren definiert, indem die alveoläre Knochenstruktur in sagittaler und koronaler Ansicht umrissen wurde, und etwa 50 aufeinanderfolgende Schnitte wurden typischerweise eingeschlossen, um die Region vollständig abzudecken.
Um den trabekulären Knochen vom umgebenden Weichgewebe und dem Hintergrund zu trennen, wurde eine Dichteschwelle von 180-220 mgHA/cm3 angewendet. Anschließend wurde eine Segmentierung durchgeführt, um eine binäre Struktur zu erzeugen, die nur den trabekulären Knochen darstellt. Die morphometrische Analyse wurde mit dem Knochenmorphometrie-Modul innerhalb der Software durchgeführt. Parameter wurden automatisch berechnet, darunter die Knochenvolumenfraktion (BV/TV), die Trabekeldicke (Tb.Th), die Trabekelzahl (Tb.N), das Verhältnis von Knochenoberfläche zu Knochenvolumen (BS/BV) und die Knochenmineraldichte (BMD). Im Anschluss an die Analyse wurden die numerischen Ergebnisse in Tabellenkalkulationen exportiert.
Diese Messungen wurden verwendet, um das Ausmaß der mikrostrukturellen Schädigung des Alveolarknochens im Zusammenhang mit dem pathologischen Zustand OP+PD zu bewerten und die therapeutische Wirksamkeit von Glycitein bei der Wiederherstellung der Knochenqualität zu beurteilen. Dieser Ansatz ermöglichte eine hochauflösende, reproduzierbare und quantitative Bewertung der strukturellen Integrität in der parodontalen Knochenumgebung und bot wichtige morphologische Einblicke in die Behandlungsergebnisse.
Erstellung von Profilen in der Netzwerkpharmakologie
Um die bioaktiven Komponenten der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM), die wichtige biologische Signalwege modulieren können, die für komorbide Osteoporose und Parodontitis (OP+PD) relevant sind, systematisch zu untersuchen, wurde in dieser Studie ein netzwerkpharmakologischer Ansatz zur Analyse von Angelica sinensis verwendet. Diese Pflanze wurde aufgrund ihrer historischen Verwendung in der TCM zur Behandlung von Knochenerkrankungen und Entzündungen ausgewählt, einschließlich Symptomen, die sowohl mit Osteoporose als auch mit chronischen Zahnfleischerkrankungen verbunden sind. In der Screening-Phase wurden die Wirkstoffe von Angelica sinensis mit Hilfe der Datenbanken TCMSP und TCMID abgerufen [die Datenbankdetails wurden nach ToM verschoben] und anhand der Kriterien der oralen Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und der Wirkstoffähnlichkeit (DL) ≥0,18 gefiltert. Die Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und Zielen wurden mit STITCH vorhergesagt, wobei die Validierung der Zielstelle über DisGeNET und OMIM erfolgte. Die Analyse der Signalweganreicherung wurde unter Verwendung der DAVID 2021-Plattform durchgeführt, um KEGG-Signalwege zu identifizieren, die möglicherweise durch die ausgewählten Verbindungen moduliert werden. Um molekulare Wechselwirkungen sichtbar zu machen, wurde ein "Compound-Target-Pathway"-Netzwerk auf Basis topologischer Indizes (Gradzentralität, Zwischenzentralität) konstruiert. Die Analyse identifizierte Glycitein, ein natürliches Flavonoid, als eine Verbindung mit günstigen pharmakokinetischen Eigenschaften und starker Bindung an CD44, was auf eine potenzielle therapeutische Relevanz bei OP+PD hindeutet. Glycitein ist jedoch nicht klinisch für die Behandlung von Osteoporose oder Parodontitis zugelassen; Diese Erkenntnisse basieren auf in silico Vorhersagen und bieten einen theoretischen Rahmen für nachfolgende in vivo Validierungsexperimente 25.
Validierung des molekularen Dockings
Die Proteinstrukturen von CD44 (PDB-ID: 1UUH) und PI3K (PDB-ID: 4L23) wurden aus der RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org) entnommen. Die Ligandenstrukturen (Glycitein, Ligustilid) wurden durch Energieminimierung unter Verwendung eines molekularen Kraftfeldes optimiert. Die Docking-Simulationen wurden mit einem genetischen Algorithmus unter den folgenden Parametern durchgeführt: 100 Durchläufe, Populationsgröße 150 und 25×106 Energiebewertungen. Die Bindungstaschen wurden anhand kristallographischer Ligandenkoordinaten (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). Die resultierenden Andockposen wurden nach Bindungsenergie (ΔG, kcal/mol) eingestuft und die Reproduzierbarkeit wurde anhand eines RMSD-Schwellenwerts (Root-Mean-Square Deviation) von <2,0 Å validiert.
Therapeutische Evaluierung von Gycitein in OP+PD-Mausmodellen
Glycitein (Reinheit ≥ 98%) wurde von einem zertifizierten biochemischen Lieferanten in analytischer Qualität für In-vivo-Experimente gewonnen und ist ein natürliches Isoflavon, von dem bekannt ist, dass es in Angelica sinensis vorkommt, mit berichtenswerten entzündungshemmenden und osteoprotektiven Eigenschaften26. Osteoporotische Parodontitis wurde bei 11 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durch bilaterale Ovariektomie (OVX) und ligaturinduzierte parodontale Entzündung induziert. Die Mäuse wurden in vier Kohorten randomisiert (n = 6 pro Gruppe):
Schein: Scheinoperation + Vehikel (5% Dimethylsulfoxid [DMSO] in Olivenöl, tägliche Magensonde)
OP+PD: Krankheitsmodell + Vehikel
OP+PD + Niedrig dosiertes Glycitein (50 mg/kg): Krankheitsmodell + Glykiteinsuspension im Vehikel
OP+PD + Hochdosiertes Glycitein (100 mg/kg): Krankheitsmodell + Glykiteinsuspension im Vehikel
Statistische Analyse
Es wurden inferenzielle statistische Tests durchgeführt und visuelle Datendarstellungen für die Diagrammerstellung und Datenvisualisierung erstellt. Die numerischen Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Gruppenvergleiche wurden durch zweiseitige ungepaarte t-Tests bewertet, wobei Werte mit &l 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurden. Diese Methoden gewährleisteten die Robustheit der Daten und erhöhten die Zuverlässigkeit der nachfolgenden Analyseergebnisse.
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Proteomisches Profiling von OP+PD-Kohorten
Die quantitative proteomische Analyse von Serumen von OP+PD-Patienten (n=3) und gesunden Kontrollpersonen (n=6) identifizierte dysregulierte Proteine, die an der Krankheitspathogenese beteiligt sind. Vergleichende Analysen ergaben neun herunterregulierte Proteine (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) und sechs hochregulierte Proteine (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) in OP+PD-Seren im Vergleich zu Kontrollen (
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Diese Studie schlägt einen translationalen Forschungsrahmen vor, der proteomisches Profiling, Genexpressionsvalidierung, in vivo Tiermodellierung und Netzwerkpharmakologie kombiniert, um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die der Komorbidität von Osteoporose und Parodontitis (OP+PD) zugrunde liegen. Die zentrale Hypothese ist, dass CD44 die PI3K/Akt-Signalachse moduliert und dadurch den entzündlichen Knochenverlust unter OP+PD-Bedingungen verschlimmert, und dass Glycitein, ein Flavonoid aus Angelica ...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Diese Studie wurde von der Science and Technology Foundation for the Health Care Industry der Provinz Gansu, China, unterstützt (Grant No. GSWSKY2020-77), die Gansu Provincial Natural Science Foundation (Förderkennzeichen 25JRRA314 und 21JR7RA620), das Gansu Provincial Talent Program und das Youth Incubation Research Program des Gansu Provincial Hospital (Zuschuss Nr. 23GSSYF-35).
Beiträge der Autoren:
Jing Qi führte den Großteil der experimentellen Arbeit und Datenanalyse durch. Yunqing Pang trug zur Probensammlung, Datenkuration und statistischen Analyse bei. Yu Wang half bei der Versuchsplanung und leistete technische Unterstützung. Dawei Hou und Jing Wang betreuten gemeinsam das Projekt, überarbeiteten das Manuskript kritisch auf wichtige intellektuelle Inhalte und genehmigten die endgültige Fassung. Alle Autorinnen und Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ELISA-Kits | Shanghai Enzyme Link Biotechnologie | Quantifizierung von inflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| RNA-Extraktionskit | Shanghai Yesheng Biotechnologie | Serum-RNA-Extraktion | |
| cDNA-Synthese-Kit | Shanghai Yesheng Biotechnologie | Hochaktive reverse Transkription | |
| qPCR-Kit | Shanghai Yesheng Biotechnologie | Quantitative PCR-Amplifikation | |
| Antikörper (primär/sekundär) | Zellsignaltechnologie / ABCAM / Hangzhou Xianli Biotechnologie / Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnologie | Spezifische Primärantikörper; β-Aktin interne Kontrolle; Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper für Ziegen | |
| Reagenzien für die Histologie | Beyotime Biotechnologie / Shanghai Shangshang | Hämatoxylin– Eosin- und Methylenblau-Färbung | |
| Chemilumineszierendes Substrat | Yakken Biotechnologie | Western-Blot-Nachweis | |
| Mikro-CT-System | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Hochauflösende Gefügeanalyse | |
| LC-MS/MS-System | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Hochauflösende Proteomanalyse | |
| Software: MaxQuant (v2.1.0), Andromeda | Breites Institut | Vorverarbeitung von Proteomik-Daten | |
| Software: GSEA (v4.3.2) | Breites Institut | Analyse der Signalanreicherung | |
| Software: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), Pheatmap (v1.0.12) | R Stiftung | Statistisches Rechnen, Netzwerkanalyse, Clustering, Heatmaps | |
| Software: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | Das Scripps Research Institute | Molekulares Docking und Gitterdefinition | |
| Software: Open Babel 3.1.1 | Projekt Babel öffnen | Optimierung der Ligandenstruktur | |
| Software: PyMOL 2.5.2 | Schrö dinger, LLC | Visualisierung des molekularen Andockens |
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